欧洲拟南芥群落根系微生物群的组装与适应性分化

谷禾健康 原创

拟南芥（Arabidopsis thaliana），又名阿拉伯芥、鼠耳芥、阿拉伯草，是一种原生于欧亚大陆的小型开花植物，为一种模式生物，被广泛地应用于植物遗传学、细胞生物学、分子生物学，以及群体进化学等方面的研究中。据不完全统计，截止到2019年，已经有超过6万篇标题中含有拟南芥的学术论文发表，覆盖了几百个生物学领域，拟南芥中各种生物学过程的研究，都是最细致最深入的。当我们要研究某一课题时，最先想到的问题是“拟南芥中是怎样的”。现在，拟南芥已经成为了植物科学研究的金标准。然而目前，我们对于驱动植物在大陆规模层面的根部微生物变异和适应的因子所知甚少。

近日，一篇发表于《Nature Ecology & Evolution》来自德国科隆马克斯普朗克植物育种研究所关于拟南芥最新研究成果：Root microbiota assembly and adaptive differentiation among European Arabidopsis populations（欧洲拟南芥群落根系微生物群的组装与适应性分化），探索了这一问题。该研究表明土壤和气候条件对根系微生物群落中的细菌和真菌的分化有不同的控制作用，气候是土壤中真菌位点变异和地理分布的关键驱动因素，而土壤细菌的地理分布主要受土壤因素的控制。气候的差异比土壤和本地微生物群的差异更重要。

摘 要

研究人员在3年中监测了欧洲17个地点的拟南芥和禾本科植物中与根系相关的微生物群落。观察到土壤微生物群落具有强大的地理结构，但没有观察到根部微生物群落的地理结构。一些具有系统多样性并地理分布广泛的细菌始终定植在植物根部。细菌的根系微生物群在不同地点之间和不同年份间的群落组成相似性要强于真菌。在瑞典和意大利的两个拟南芥种群之间的交互移植中，排除地理位置效应对土壤微生物群落的影响，测试了它们对根系微生物群变化和植物适应性的贡献。植物根部的群落分化主要是通过真菌的位置和细菌的土壤来源来解释，而宿主基因型的影响较小。观察到两个拟南芥种群之间存在很强的地方适应能力，土壤特性和微生物的差异对于观察到的适应性分化的影响不大。结果表明，在较大的空间尺度上，气候比土壤条件对真菌根系相关微生物群落的变异和植物适应性更重要，而土壤特性是根系细菌群落分化的主要驱动因素。

背景

人们对引起根系微生物群和植物适应性方向在大陆尺度中变化的因素了解甚少。植物的免疫系统、根际沉积物和微生物相互作用是根系相关微生物群有别于周围土壤微生物群的已知决定因素。土壤生物群组成的大规模空间变化与土壤和气候条件的差异有关。特别是当地土壤特性，如pH值主要预测土壤细菌的地理分布，而气候条件更好的预测土壤中真菌的分布。然而，在土壤和气候条件的变化对植物根系微生物群落组成和适应性分化的影响程度方面缺乏系统的实地研究。交互移植已在许多植物物种中表现出局部适应，包括模式植物拟南芥。然而，不同的非生物和生物因素对当地适应的进化和维持的相对重要性知之甚少。在瑞典和意大利，研究了土壤条件和气候对两种海百合种群根系微生物群聚集和适应性分化的影响。

实验设计

1.样本采集

在欧洲选择了17个具有不同土壤特性的地点，在2月-5月间统一发育阶段连续3年采集自然生长的拟南芥，在不影响植物根系的情况下，用手铲将植物与其周围的块状土壤一起收获，转移到7厘米×7厘米的温室花盆中 。并在距离拟南芥生长50cm的范围内采集了三种邻近的禾本科植物，共采集285株植物。而后人工将单株植物与土体分离，分离出4个微生物生态位【土壤（Soil）;根际（RS）；根际平面（RP）；根(Root）】。whole-root是RP和Root的组合。

2.交互移植实验

2016年春季，在两个试验点收集了土壤，并将其储存在6摄氏度下。种子接种于琼脂培养皿中，在6摄氏度黑暗中冷沉积一周后移入生长室（22°C 16h，150μEm−2s−1 PAR，16°C黑暗8h），萌芽9天后，将20株本地苗和22株外地苗移植到每个土壤类型的6个区块的随机位置上，每个点×土壤组合共移植120株本地苗和132株外地苗。移栽过程中，插盘在温室内分别在~18℃和~12°C下白天放置16h，夜间放置8h。在6天内，插盘被运到意大利(IT4)和瑞典(SW4)。移栽苗与源群体中自然萌发的植株处于同一发育阶段。

3.将上述实验分离出的样本提取DNA后对细菌16SrRNA(799F-1192R)V5-V7、细菌16SrRNA(341F-806R)V3-V4、真菌ITS1(ITS1F-ITS2)、真菌ITS2(fITS7-ITS4)和卵菌ITS1(ITS1-O-5.8 s-Rev-O)区域扩增后使用MiSeq测序仪和定制测序引物在内部进行成对末端Illumina测序。得到序列后进行微生物群落组成及差异分析。

主要结果

1. 17个欧洲拟南芥种群中的微生物群落结构。表明根环境促使欧洲各地的细菌群落组成趋同。

a). 欧洲地图，显示了17种拟南芥种群的名称和位置

b). 基于Bray-Curtis相似度的树状图显示了3年中在每个站点中每个采样部位的微生物群落组成，从左至右分别为细菌、真菌、卵菌。采样部位由侧边彩色方块表示（深红色：土壤；灰色：根际（RS）；浅绿色：根际平面（RP）；深绿色：根）。彩色条形图表示群落组成（纲或目分类水平）。黑色条形图表示微生物的α多样性。从土壤到根内圈，细菌、真菌和卵菌的α多样性逐渐下降，其中细菌的下降幅度大于丝状真核生物。Bray-Curtis距离聚类显示RS与Soil间的细菌群落组成有较高相似性，RP与Root间的细菌群落组成有较高相似性。

c). 4个瑞典土壤样品(SW soils)与其他周围13个土壤样品(versus others)，以及根(Root versus)和土壤样品(soil)之间的差异丰度分析(纲或目分类水平)。三角表示差异有统计学意义(Wilcoxon秩和检验，FDR < 0.05)。与周围土壤样品相比，植物根部微生物群落的相对丰度显著增加。

d). 基于从17个地点、4个采样部位和连续三年(2015年、2016年和2017年)采集的样本之间的Bray-Curtis距离的PCoA图。列出了整个拟南芥数据集的微生物群落：细菌(n = 881)、真菌(n = 893)和卵菌(n = 875)，并根据不同采样部位进行了颜色编码。空心圆圈表示瑞典样本，实心圆圈表示所有其他样本。揭示了瑞典土壤和其他欧洲土壤之间土壤细菌群落的显著差异。这些差异在相应的根系样本中大大减小，表明植物内圈细菌群落组成趋同。

2.大陆尺度中，少数地理上广泛分布的细菌丰富地定殖在拟南芥的根部，推动了细菌群落组成的趋同。

a).细菌、真菌和卵菌在不同地点（3年的平均值）普遍流行的OTU与植物根部的OTU相对丰度（3年的平均值log2后的值）之间的相关性。蓝色代表地理上受限的OTUs，流行率<20%；橙色代表地理上常见的OTUs，流行率20-80%；红色代表地理上分布广泛的OTUs，>80%。不同的形状提示在第1、2或3年间检测到的与Root相关的OTU。NS表示无统计学意义。观察到在细菌群落中两者间呈正相关。相反，在真菌和卵菌群落中两者没有相关性。

b).a图数据的盒形图展示。描述了不同采样部位之间的显著差异（Kruskal–Wallis with Dunn’s的事后检验, P < 0.01）。地理上分布广泛的细菌OTUs在RP和Root样本中比相应的土壤样本中丰富得多。

c). 根据16S rRNA V5-V7基因片段(细菌)和ITS1区域(真菌和卵菌)构建的地理上分布广泛的Root相关的OTUs的细菌、真菌和卵菌的系统发育树。星号表示，与土壤样本相比，显著富集的与Root相关的OTU。对列出的OTUs中的进行序列变异的检查，发现细菌OTUs中有大量的序列异质性。其中OTU14和OTU5的序列异质性最高。相比之下，真菌和卵菌的OTUs几乎没有序列变异。这意味着一个保守的分类单元的小子集已经进化出在大陆尺度上支配根系细菌菌群的机制，而不考虑周围土壤细菌菌群的主要差异。

d).在拟南芥根部检测到的分布广泛的细菌和真菌的OTUs的比例。展示了相对丰度大于0.1%的OTUs。这些OTUs在root样本中的总体相对丰度显示在每个饼图下面。

3. 少量地理上分布广泛的细菌可以有效地在远亲植物的根系微生物群落中定殖，并随着进化时间的推移与植物根系微生物群落建立稳定的联系。拟南芥和禾本植物之间的群落组成差异较小。

a).基于Bray-Curtis距离的禾本植物和拟南芥的细菌、真菌、卵菌群落的种分类水平的PCoA图。观察到拟南芥和共生牧草在微生物群落组成上的差异较小。

b).细菌、真菌和卵菌的拟南芥根系普遍流行的OTUs和禾本植物根系普遍流行的OTUs之间的斯皮尔曼相关性。在大陆尺度上总体是一致的。

c).共生牧草根系中广泛存在的拟南芥根系OTUs在细菌群落中占总相对丰度45%，但在真菌群落中只占总相对丰度16%。而生长在不同土壤类型中的莲花根系微生物群落中也检测到这些OTUs，所占比例RA表示。

4.大陆尺度中影响拟南芥根系微生物群落的因素。不同地点间环境条件的变化比时间变化对根系相关微生物群落的影响更大

a). 在17个地点、四个采样部位和连续三年(2015年、2016年和2017年)采集的样本之间基于Bray-Curtis距离的PCoA图。从数据集中排除相对丰度 <  0.1%的OTUs。不同地点是影响拟南芥根系微生物群落组成变化的主要因素(Adonis: d.f. = 16; 细菌: R2 = 0.17; P < 0.001; 真菌: R2 = 0.19; P < 0.001; 卵菌: R2 = 0.17; P < 0.001),，但是与土壤样本中观察到的结果相比，这一效应明显降低。(Adonis: d.f. = 16; 细菌: R2 = 0.53; P < 0.001; 真菌: R2 = 0.51; P < 0.001; 卵菌: R2 = 0.27; P < 0.001）

b).采样地点、采样年份和采样地点x采样年份对细菌、真菌、卵菌群落组成的影响。其中，真菌和卵菌群落的年际变化尤为明显。

c). 在每个位置测量的环境变量或共线变量组对细菌、真菌和卵菌群落组成的影响。pH组包括pH、铁、纬度、经度、平均气温和平均相对湿度。硼组包括硼、有效钙和储备钙三个因子。P组包括有效P因子和储备P因子，NO3组包括有效NO3因子、有效Mg因子和储备Mg因子。K组包括有效K因子和储备K因子，显著统计意义用深色突出表现。两种土壤在有效钙、储备钾、有效镁、pH、铁和速效钾方面的差异是最大的。(c1图为描述了18个环境变量之间共线性的热图。定义了两个唯一变量(锰（Manganese）、铜（Copper）)和五组共线变量(K组、P组、Boron组、NO3组、pH组)。土壤、RS和RP细菌群落组成的主要驱动因素是pH和/或与pH密切相关的环境变量，如铁、平均气温和平均相对湿度。细菌群落与环境变量的相关性比真菌更强。

5. 土壤、气候和基因型的差异驱动了拟南芥种群间根系微生物群落的分化；与细菌相比，气候条件等特定位置因素对根相关真菌群落分化的影响更大。土壤条件的差异对拟南芥种群间的适应性分化贡献较小

a).交互移植示意图。来自IT1和SW4地点的土壤和植株基因型在这两个地点(8个不同处理组合)相互移植。

b). 根据Bray-Curtis距离用PCoA法测定了细菌、真菌和卵菌的土壤和全部根系微生物群落结构。与细菌相比，土壤来源的真菌和卵菌的解释变异百分比（PCoA1）较弱。土壤中微生物真核组合的位点间变异主要是由地理位置决定的。在whole-root组中，位置的影响与土壤对真菌的影响一样强，比土壤对卵菌的影响更强

c). 在IT1和SW4的土壤中相互种植，并在IT1和SW4的地点生长的两者基因型的整体适合度。红色表示IT1，蓝色表示SW4。圆形表示IT1土壤，三角形表示SW4土壤。填充符号表示在IT1生长，未填充符号表示在SW4生长。在IT1位点，本地基因型的相对适合度高于外地土壤。两种土壤在有效钙、储备钾、有效镁、pH、铁和速效钾方面的差异是最大的。在SW4地点，没有一株意大利植物幸存下来繁殖。较强的本地优势是较高的存活率和繁殖力共同作用的结果。

结论

土壤和气候条件对根系微生物群落中的细菌和真菌的分化有不同的控制作用，气候是土壤中真菌位点变异和地理分布的关键驱动因素，而土壤细菌的地理分布主要受土壤因素的控制。气候的差异比土壤和本地微生物群的差异更重要，因为这两个研究种群之间存在适应性差异。研究人员认为未来的研究应该确定在大空间尺度上影响根系微生物群组装和适应性分化的环境因子是否与在较小地理尺度上作用的环境因子不同。