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祝贺谷禾顺利通过ISO9001:2015质量管理体系认证

祝贺杭州谷禾信息技术有限公司获得ISO9001质量管理体系评审高分通过,认证组专家根据ISO9001质量管理体系的要求,对杭州谷禾信息技术有限公司所有职能部门按照 ISO标准,审核组通过现场询问、查看和抽样方式等形式,对质量方针、质量目标的完成情况以及全过程的控制情况进行了检查,经过严格审核,审核专家一致通过我公司的认证注册资格,并于2019年10月8日正式颁发ISO9001:2015质 量管理体系证书。 认证专家对各职能部门在工作流程中表现突出的工作给于了充分的肯定,对有待完善的地方,也提出了建设性意见。
谷禾将在今后的工作中一如既往的严格执行质量管理体系及规章制度,进一步优化和规范各项管理制度, 不断提高体系运行的有效性,不断进行积极探索 严格要求各部门严格按照体系文件要求,做到持续改进,给客户提供更优质的产品和服务。

谷禾健康2019年国庆收样及报告安排

收样安排
国庆前实验室的收样时间截止9月30日,客户的样本必须在9月29日前送到实验室会安排节前上机。国庆期间10月1日至10月7日实验室不接收样本。
报告交付
9月26号及之后收到样本及原定10月1-7号出具报告的样本报告将延后于10月8号出具。


杭州谷禾信息技术有限公司
2019年9月23日

如何读懂和利用你的微生物多样性测序结果?

做过16s测序的小伙伴们都知道

测完之后会拿到一份结果报告

但这并不代表可以开始写文章了

看似一大堆数据图表却不知如何下手

这是很多人头疼的地方

那么怎样给报告中的数据赋予灵魂

让它真正成为对你有帮助的分析呢?

今天我们来详细解读下。

一文扫除困惑

首先什么是16S rRNA?

16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因,长度约为1542bp,其分子大小适中,突变率小,是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。

16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区,保守区序列反映了物种间的亲缘关系, 而可变区序列则能体现物种间的差异。 

16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。

二代高通量测序原理

目前二代测序是一个边合成边测序的过程,使用的是荧光可逆终止子。每个可逆终止子的碱基3’端都有一个阻断基团,而在侧边带有一种荧光。由于有4种不同的碱基(ATCG),因此也会有对应4种不同颜色的荧光。开始扩增每次结合上一个碱基,DNA的扩增便会停止,此时能收到一种荧光信号。然后放试剂除去阻断基团,进行下一个碱基的结合,以此类推得到一连串的荧光信号组合序列。而根据荧光的颜色我们便可以确定每一个位点的基因型,即可以得到这一段DNA片段的序列。

环境样品高通量分析需要重复么?

在进行实验设计前,这是有些小伙伴面临的一个问题。环境样本由于来源和条件不完全可控,每个样品之间会存在很大的差异,即便是相同样本的不同取样时间和部位也会存在一定的差异。

基于高通量测序主要是为了了解样品的菌群构成和功能分析,以及寻找不同环境之间的差异,包括菌和功能基因以及代谢。如果仅做单一样本,很可能结论只能代表这个单一取样样本的信息,无法排除不同样本重复之间的差异,也就可能得不到真正代表环境差异的结果。
所以环境样品不仅要重复而且还应该以分组方式取尽量多的样本以全面的代表一个环境条件下的各种变异情况。

测序区段如何选择

确定做重复后,又面临该怎么选择测序区段的问题。目前市面上有v1-v3区/v3-v4区/v4区等可供选择。

16S rRNA编码基因序列共有9个保守区和9个高可变区。其中,V4区其特异性好,数据库信息全,我们通过大量的测序试验证明用v4区扩增出菌群结果的可以很好的反应样本的菌群结构用于后续的数据建模分析,是细菌多样性分析注释的最佳选择。

基本确定好后,就要着手开始实验,实验完送样又是个问题,以往给测序公司送样往往是低温运输,且不说麻烦,还要提心吊胆怕运输过程会不会有什么问题。为此我们免费提供常温保存取样盒,就不用有这样的顾虑,取样及运输全程都只需要常温即可。

样品到公司之后就更不用操心,全套服务等着呢!

16s分析结果详解

很多小伙伴有过这样的经历,在拿到公司出具的报告之后,仍然一头雾水,几十页的报告内容看着丰富却不知该怎么运用。我们一起来理一下关键图表的含义

OTU是我们要搞清的一个重要概念,可以说是后续分析的基石。

OTU(operational taxonomic units) 是在系统发生学研究或群体遗传学研究中,为了便于进行分析,人为给某一个分类单元(品系,种,属,分组等)设置的同一标志。通常按照 97% 的相似性阈值将序列划分为不同的 OTU,每一个 OTU 通常被视为一个微生物物种。相似性小于97%就可以认为属于不同的种,相似性小于93%-95%,可以认为属于不同的属。样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度都是基于对OTU的分析。

有了OTU这个概念之后,就不难理解下表。对每个样本的测序数量和OTU数目进行统计,并且在表栺中列出了测序覆盖的完整度。

其中 SampleName表示样本名称;SampleSize表示样本序列总数;OTUsNumber表示注释上的OTU数目;OTUsSeq表示注释上OTU的样本序列总数。

Coverage是指各样品文库的覆盖率,其数值越高,则样本中序列没有被测出的概率越低。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。计算公式为:C=1-n1/N  其中n1 = 只含有一条序列的OTU的数目;N = 抽样中出现的总的序列数目。

下表是对每个样本在分类字水平上的数量进行统计,并且在表栺中列出了在每个分类字水平上的物种数目

其中SampleName表示样本名称;Phylum表示分类到门的OTU数量;Class表示分类到纲的OTU数量;Order表示分类到目的OTU数量;Family表示分类到科的OTU数量;Genus表示分类到属的OTU数量;Species表示分类到种的OTU数量。

我们可以看到绝大部分的OTU都分类到了属(Genus),也有很多分类到了种(Species)。但是仍然有很多无法完全分类到种一级,这是由于环境微生物本身存在非常丰富的多样性,还有大量的菌仍然没有被测序和发现。

当然,对这些种属的构成还可以进行柱状图展示:

横坐标中每一个条形图代表一个样本,纵坐标代表该分类层级的序列数目或比例。同一种颜色代表相同的分类级别。图中的每根柱子中的颜色表示该样本在不同级别(门、纲、目等)的序列数目,序列数目只计算级别最低的分类,例如在属中计算过了,则在科中则不重复计算。

我们还需要对样本之间或分组之间的OTU进行比较获得韦恩图:

样品构成丰度

稀释曲线

微生物多样性分析中如何验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性?

稀释曲线(丰富度曲线)可以派上用场。它是用来评价测序量是否足以覆盖所有类群,并间接反映样品中物种的丰富程度

不免有同学有疑惑,稀释曲线怎么来的?

它是利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTU的相对比例,来计算抽取n个(n小于测得reads序列总数)reads时出现OTU数量的期望值,然后根据一组n值(一般为一组小于总序列数的等差数列)与其相对应的OTU数量的期望值做出曲线来。

至此,我们虽然知道了稀释曲线的由来,那么这个五彩缤纷的稀释曲线该怎么看呢?

当曲线趋于平缓或者达到平台期时也就可以认为测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种,增加测序数据无法再找到更多的OTU;

反之,则表示样品中物种多样性较高,还存在较多未被测序检测到的物种。

横坐标代表随机抽取的序列数量;纵坐标代表观测到的OTU数量。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量。

Shannon-Winner曲线

Shannon-Wiener 曲线,是利用shannon指数来进行绘制的,反映样品中微生物多样性的指数,利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线,以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。 

当曲线趋向平坦时,说明测序数据量足够大,可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。

横坐标代表随机抽取的序列数量;纵坐标代表的是反映物种多样性的Shannon指数,样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量。

其中曲线的最高点也就是该样本的Shannon指数,指数越高表明样品的物种多样性越高。

好奇的同学又有疑问,Shannon指数怎么算的?

这里有Shannon指数的公式:

其中,Sobs= 实际测量出的OTU数目;

ni= 含有i 条序列的OTU数目;N = 所有的序列数。

Rank-Abundance曲线

该曲线用于同时解释样品多样性的两个方面,即样品所含物种的丰富程度均匀程度

横坐标代表物种排序的数量;纵坐标代表观测到的相对丰度。

样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的物种数量

物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度来反映,曲线越宽,表示物种的组成越丰富;

物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映,曲线越平坦,表示物种组成的均匀程度越高。

如果曲线越平滑下降表明样本的物种多样性越高,而曲线快速陡然下降表明样本中的优势菌群所占比例很高,多样性较低。

但一般超过20个样本图就会变得非常复杂而且不美观!所以假如没超过20个样可以考虑该图哦~

Alpha多样性(样本内多样性)

Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性,常用的度量指标有Chao1 丰富度估计量(Chao1 richness estimator) 、香农 – 威纳多样性指数(Shannon-wiener diversity index)、辛普森多样性指数(Simpson diversity index)等。

计算菌群丰度:Chao、ace;  

计算菌群多样性:Shannon、Simpson。

Simpson指数值越大,说明群落多样性越高;Shannon指数越大,说明群落多样性越高。

看了那么多指数,可能觉得有点晕,到底每个指数是什么意思呢?

当然要解释下咯:

Chao1:是用chao1 算法计算群落中只检测到1次和2次的OTU数估计群落中实际存在的物种数。Chao1 在生态学中常用来估计物种总数,由Chao (1984) 最早提出。Chao1值越大代表物种总数越多

Schao1=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1)

其中Schao1为估计的OTU数,Sobs为观测到的OTU数,n1为只有一条序列的OTU数目,n2为只有两条序列的OTU数目。

Shannon:用来估算样品中微生物的多样性指数之一。它与 Simpson 多样性指数均为常用的反映 alpha 多样性的指数。Shannon值越大,说明群落多样性越高

Ace:用来估计群落中含有OTU 数目的指数,由Chao 提出,是生态学中估计物种总数的常用指数之一,与Chao1 的算法不同。

Simpson:用来估算样品中微生物的多样性指数之一,由Edward Hugh Simpson ( 1949) 提出,在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性。Simpson 指数值越大,说明群落多样性越高。

Alpha多样性指数差异箱形图

分别对 Alpha diversity 的各个指数进行秩和检验分析(若两组样品比较则使用 R 中的wilcox.test 函数,若两组以上的样品比较则使用 R 中的 kruskal.test 函数),通过秩和检验筛选不同条件下的显著差异的 Alpha Diversity指数。

Beta多样性分析(样品间差异分析)

也许我们有听说Beta多样性在最近10年间成为生物多样性研究的热点问题之一。具体解释下:

Beta多样性度量时空尺度上物种组成的变化, 是生物多样性的重要组成部分, 与许多生态学和进化生物学问题密切相关!

PCoA分析

PCoA(principal co-ordinates analysis)是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法,通过一系列的特征值和特征向量进行排序后,选择主要排在前几位的特征值,PCoA 可以找到距离矩阵中最主要的坐标,结果是数据矩阵的一个旋转,它没有改变样品点之间的相互位置关系,只是改变了坐标系统。

重要的是,它是可以用来观察个体或群体间的差异的。

每一个点代表一个样本,相同颜色的点来自同一个分组,两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。

另一种相似的是PCA分析

主成分分析(Principal component analysis)PCA 是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法,通过一系列的特征值和特征向量进行排序后,选择主要的前几位特征值,采取降维的思想,PCA 可以找到距离矩阵中最主要的坐标,结果是数据矩阵的一个旋转,它没有改变样品点之间的相互位置关系,只是改变了坐标系统。

详细关于主成分分析的解释推荐大家看一篇文章,http://blog.csdn.net/aywhehe/article/details/5736659 

一起来看看包含PCoA研究的文章

案例解析

研究背景:全球塑料产量飞速增长,而且呈持续上升的趋势,因此导致大量塑料废物排放到环境中,从沿海河口到大洋环流,从东大西洋到南太平洋海域。塑料废弃物具有化学稳定性和生物利用率低的特点,可长期存在于海洋中,从而影响海洋环境包括海洋生物的生存。

作为一个独特的底物,塑料碎片可以吸附海洋中的微生物并形成个“塑性球”。以生物膜形式存在于塑料碎片上的微生物群落。许多研究表明,无论是在海洋还是淡水生态系统中,附着在塑料碎片上微生物群落的组成明显不同于周围环境(水和沉积物),而且易受位置、时间和塑料类型的影响。

主要图表

两两群落差异指数的PCoA图

PCoA 图可以清楚地看到,SW区细菌群落的置信椭圆与pd和sd的置信椭圆有显著的偏差(p<0.05),而sd上细菌群落的置信椭圆几乎覆盖了pd的置信椭圆(p>0.05),这表明pd和sd上的细菌群落有相似之处。

不同样本和处理下的细菌群落( 前 10 位)丰度分布

底物(SW、SD和Pd)上的主要属为细菌和假互斥单胞菌,暴露两周后,这些菌可能是分布广泛和适应性强的三种底物(SW、SD和PD)。暴露4周后,弧菌相对丰度增加.此外,暴露6周后,自养细菌(如扁平菌和硝酸菌)的数量增加。这三种底物上个细菌群落的生长模式也与3.2的结果一致。图5还显示,在6个星期内,在429个原位点中,假单胞菌在pd上的相对丰度高于sw和sd(anova,p<0.05)。

研究结论:首先,营养物质 (TN 和 TP) 与生物膜的平均生长速率呈正相关,而盐度与生物膜的平均生长速率呈负相关。盐度是影响PD的个细菌多样性的主要因素,而温度、溶解氧和养分(TN和TP)在类似的盐度条件下可能具有二次效应。尽管种聚合物类型对PD上的细菌群落的多样性具有较少的影响,但是在细菌群落中的一些属显示对PD的聚合物类型的选择性,并且倾向于将其优选的基质定殖。大的相对丰度SW、PD、SD间属显著差异。盐度是改变河口地区Pd条件致病菌富集的主要因素。另外,在种病原物种丰富的基础上,PD具有较高的致病性。

NMDS分析(非度量多维尺度分析)

NMDS(Nonmetric Multidimensional Scaling)常用于比对样本组之间的差异,可以基于进化关系或数量距离矩阵。

横轴和纵轴:表示基于进化或者数量距离矩阵的数值在二维表中成图。与PCA分析的主要差异在于考量了进化上的信息

每一个点代表一个样本,相同颜色的点来自同一个分组,两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。

排序分析

PCA,PcoA,NMDS分析都属于排序分析(Ordination analysis)。

排序(ordination)的过程就是在一个可视化的低维空间或平面重新排列这些样本。

目的:使得样本之间的距离最大程度地反映出平面散点图内样本之间的关系信息。

排序又分两种:非限制性排序和限制性排序。

1、非限制性排序(unconstrained ordination)

——使用物种组成数据的排序

(1) 主成分分析(principal components analysis,PCA)

(2) 对应分析(correspondence analysis, CA)

(3) 去趋势对应分析(Detrended correspondence analysis, DCA)

(4) 主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)

(5) 非度量多维尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling, NMDS)

2、限制性排序(constrained ordination)

    ——同时使用物种环境因子组成数据的排序

(1) 冗余分析(redundancy analysis,RDA)

(2) 典范对应分析(canonical correspondence analysis, CCA)

比较PCA和PCoA

在非限制性排序中,16S和宏基因组数据分析通常用到的是PCA分析和PCoA分析,两者的区别在于:

PCA分析是基于原始的物种组成矩阵所做的排序分析,而PCoA分析则是基于由物种组成计算得到的距离矩阵得出的。

在PCoA分析中,计算距离矩阵的方法有很多种,包括如:Euclidean, Bray-Curtis, and Jaccard,以及(un)weighted Unifrac (利用各样品序列间的进化信息来计算样品间距离,其中weighted考虑物种的丰度,unweighted没有对物种丰度进行加权处理)。

LDA差异贡献分析

如果说 PCA,它所作的只是将整组数据整体映射到最方便表示这组数据的坐标轴上,映射时没有利用任何数据内部的分类信息,是无监督的。

那么LDA是有监督的,增加了种属之间的信息关系后,结合显著性差异标准测试(克鲁斯卡尔-沃利斯检验和两两Wilcoxon测试)和线性判别分析的方法进行特征选择。

两者相同点:

  • 都可以对数据进行降维。
  • 降维时都采用了矩阵特征分解的思想。

差异:

1)LDA是有监督学习的降维方法,而PCA是无监督的降维方法。(注:监督学习是从标记的训练数据来推断一个功能的机器学习任务。)

2)LDA选择分类性能最好的投影方向,而PCA选择样本点投影具有最大方差的方向。

除了可以检测重要特征,他还可以根据效应值进行功能特性排序,这些功能特性可以解释大部分生物学差异。这部分希望能详细了解的同学可以参考这篇文章http://blog.csdn.net/sunmenggmail/article/details/8071502 。

  • 不同颜色代表不同样本或组之间的显著差异物种。
  • 使用LefSe软件分析获得,其中显著差异的logarithmic LDA score设为2。

LDA分析究竟能做什么

组间差异显著物种又可以称作生物标记物(biomarkers),这个LDA分析主要是想找到组间在丰度上有显著差异的物种

案例解析

研究背景:研究表明遗传和环境影响都在I型糖尿病的发展中起作用,增加的遗传风险不足以引起疾病,环境因素也是需要的,而且起着至关重要的作用。肠道菌群也许就是这个重要的环境因素,肠道菌群在免疫系统的成熟中起重要作用,此外还影响自身免疫疾病发展。

不同遗传风险儿童的LDA差异菌群

不同遗传风险分组中包含的常见菌属,部分存在特定分组中

PCoA分析揭示不同遗传风险儿童肠道菌群的在不同地域样本中均存在显著差异

点评:针对I型糖尿病疾病发生过程中遗传HLA分型风险和对应肠道菌群菌的关联分析,揭示了特定肠道菌群与宿主特定遗传风险共同作用推进疾病发生。某些特定菌属可能无法在遗传高风险儿童肠道内定植,可能对疾病发生存在特定作用。此外对于其他遗传风险的自身免疫疾病也具有重要提示意义,例如乳糜泻和类风湿性关节炎。

物种进化树的样本群落分布图

这是另一款和LDA长得有点像的图,当然功能可完全不一样。它是将不同样本的群落构成及分布以物种分类树的形式在一个环图中展示。数据经过分析后,将物种分类树和分类丰度信息通过这款软件GraPhlAn进行绘制

(http://huttenhower.sph.harvard.edu/GraPhlAn )。

其目的是将物种之间的进化关系以及不同样本的物种分布丰度最高分布样本的信息在一个视觉集中的环图中一次展示,其提供的信息量较其他图最为丰富。

  • 中间为物种进化分类树
  • 不同颜色的分支代表不同的纲(具体的代表颜色见右上角的图例),
  • 接着的外圈的灰色标示字母的环表示的是本次研究中比例最高的15个科(字母代表的科参见左上角的图例)。
  • 之后的外圈提供的是热力图,如果样本数<=10个则绘制样本,如果样本数超过10个则按照分组绘制,每一环为一个样本,根据其丰度绘制的热力图。
  • 最外圈为柱状图,绘制的是该属所占比例最高的样本的丰度和样本颜色(样本颜色见环最下方的样本名字的颜色)。其中热力图和柱状图取值均为原比例值x10000后进行log2转换后的值。

物种相关性分析

根据各个物种在各个样品中的丰度以及变化情况,计算物种之间的相关性,包括正相关和负相关。

相关性分析使用CCREPE算法

怎么画的?

首先对原始16s测序数据的种属数量进行标准化,然后进行Spearman和Pearson秩相关分析并进行统计检验计算出各个物种之间的相关性,之后在所有物种中根据simscore绝对值的大小挑选出相关性最高的前100组数据,基于Cytoscap绘制共表达分析网络图。

网络图采用两种不同的形式表现出来。

物种相关性网络图A

○  图中每一个点代表一个物种,存在相关性的物种用连线连接。

 ○  红色的连线代表负相关,绿色的先代表正相关。

 ○  连线颜色的深浅代表相关性的高低

物种相关性网络图B

 ○  图中每一个代表一个物种

 ○  点的大小表示与其他物种的关联关系的多少

 ○  其中与之有相关性的物种数越多点的半径和字体越大

 ○  连线的粗细代表两物种之间相关性的大小

连线越粗,相关性越

案例解析

研究背景:气候变化导致美国中部草原的降水模式发生变化,对土壤微生物群落构成及代谢影响很大。

研究希望明确土壤微生物群落对土壤水分变化的反应,并确定响应的特定代谢特征。

主要图表

同一样本在不同水分含量孵化处理下土壤菌群的变化

受到水分条件影响的土壤菌群代谢途径和网络分布

研究结论:土壤干燥导致土壤微生物组的组成和功能发生显着变化。相反,润湿后几乎没有变化。由于干旱导致的土壤水分减少对土壤碳循环和土壤微生物组进行的其他关键生物地球化学循环的影响很大。导致渗透保护剂化合物产生的代谢途径受到较大影响。

点评:

相对简单的样本和实验设计,但是从多个维度探寻支持土壤微生物群落对湿润和干燥表型的反应。

与常见的环境采样检测不同,针对同一样本在对照环境下进行环境控制孵化,然后比较菌群变化可以更为有效的控制背景差异。

聚类分析

根据OTU数据进行标准化处理(1wlog10)之后,选取数目最多的前60个物种,基于R heatmap进行作图

 ○  热图中的每一个色块代表一个样品的一个属的丰度

 ○  样品横向排列,属纵向排列

 ○  差异是是否对样品进行聚类,从聚类中可以了解样品之间的相似性以及属水平上的群落构成相似性

Tips:

如果聚类结果中出现大面积的白或黑是因为大量的菌含量非常低,导致都没有数值,可以在绘制之前进行标准化操作,对每一类菌单独自身进行Z标准化。

案例解析

研究背景:妊娠期糖尿病(GDM)的患病率在全球范围内迅速增加,构成一个重要的健康问题和产科实践的重大挑战(Ferrara,2007)。高脂血症是妊娠常见的合并症。在GDM患者中,血脂的生理变化可能导致怀孕期间潜在的代谢紊乱。肠道失调在宿主代谢异常中起着至关重要的作用,最近关于2型糖尿病(T2D)和肥胖的研究就证明了这一点。这些研究表明,妊娠期间肠道微生物ME的主要变化可能在GDM的发展中起着至关重要的作用。

GDM加高脂血症(M队列)妊娠期间与显著改变的脂质相关的肠道微生物群(属)

研究结论:我们的结果表明,血脂水平可能反映了GDM发展过程中的一些异常变化。所鉴定的多种生物标志物对GDM合并高脂血症的防治有一定的参考价值。

组间物种差异性箱形图

组间物种差异性盒形图描述在不同分组之间具有差异显著的某一物种做盒形图,图中以属水平为例做物种差异性盒形图,展示如下:

 ○  图中不同颜色代表不同的分组,更直观显示组间物种差异

 ○  每一个盒形图代表一个物种,图上方是物种名。

Anosim检验

Anosim分析是一种非参数检验,用来检验组间的差异是否显著大于组内差异,从而判断分组是否有意义

展示如下:

R-value介于(-1,1)之间,R-value大于0,说明组间差异显著。

R-value小于0,说明组内差异大于组间差异。

统计分析的可信度用 P-value 表示,P< 0.05 表示统计具有显著性。

对Anosim的分析结果,基于两两样本之间的距离值排序获得的秩(组间的为between,组内的为within),这样任一两两组的比较可以获得三个分类的数据,并进行箱线图的展示(若两个箱的凹槽互不重叠,则表明它们的中位数有显著差异)

随机森林分类树属分类效果

随机森林是机器学习算法的一种,它可以被看作是一个包含多个决策树的分类器

其输出的分类结果是由每棵决策树“投票”的结果。由于每棵树在构建过程中都采用了随机变量和随机抽样的方法,因此随机森林的分类结果具有较高的准确度,并且不需要“减枝”来减少过拟合现象。

随机森林可以有效的对分组样品进行分类和预测。

物种重要性点图。横坐标为重要性水平,纵坐标为按照重要性排序后的物种名称。上图反映了分类器中对分类效果起主要作用的菌属,按作用从大到小排列。

Error rate: 表示使用下方的特征进行随机森林方法预测分类的错误率,越高表示基于菌属特征分类准确度不高,可能分组之间菌属特征不明显。图中以所有水平为例,取前60个作图。

ROC曲线图

ROC 曲线指受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve), 是反映敏感性特异性连续变量的综合指标,通过构图法揭示敏感性和特异性的相互关系。

ROC 曲线将连续变量设定出多个不同的临界值,从而计算出一系列敏感性和特异性,再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线。

曲线下面积越大,诊断准确性越高。展示如下:

FAPROTAX生态功能预测

FAPROTAX是一款在2016年发表在SCIENCE上的较新的基于16S测序的功能预测软件。它整合了多个已发表的可培养菌文章的手动整理的原核功能数据库,数据库包含超过4600个物种的7600多个功能注释信息,这些信息共分为80多个功能分组,其中包括如硝酸盐呼吸、产甲烷、发酵、植物病原等。

FAPROTAX对环境样本更友好

如果说PICRUSt(后续会介绍)在肠道微生物研究更为适合,那么FAPROTAX尤其适用于生态环境研究,特别是地球化学物质循环分析。

FAPROTAX适用于对环境样本(如海洋、湖泊等)的生物地球化学循环过程(特别是碳、氢、氮、磷、硫等元素循环)进行功能注释预测。因其基于已发表验证的可培养菌文献,其预测准确度可能较好,但相比于上述PICRUSt和Tax4Fun来说预测的覆盖度可能会降低。

FAPROTAX可根据16S序列的分类注释结果对微生物群落功能(特别是生物地化循环相关)进行注释预测。

图中横坐标代表样本,纵坐标表示包括碳、氢、氮、硫等元素循环相关及其他诸多功能分组。可快速用于评估样品来源或特征。

基于BugBase的表型分类比较

Bugbase也是16年所提供服务的一款免费在线16S功能预测工具,到今年才发表文章公布其软件原理。该工具主要进行表型预测,其中表型类型包括革兰氏阳性、革兰氏阴性、生物膜形成、致病性、移动元件、氧需求,包括厌氧菌、好氧菌、兼性菌)及氧化胁迫耐受等7类。

Gram Negative 革兰氏阴性菌

Picrust群落功能差异分析

通过对已有测序微生物基因组的基因功能的构成进行分析后,我们可以通过16s测序获得的物种构成推测样本中的功能基因的构成,从而分析不同样本和分组之间在功能上的差异(PICRUSt Nature Biotechnology, 1-10. 8 2013)。

Picrust对肠道菌群样本更友好

通过对宏基因组测序数据功能分析和对应16s预测功能分析结果的比较发现,此方法的准确性在84%-95%,对肠道微生物菌群和土壤菌群的功能分析接近95%,能非常好的反映样品中的功能基因构成

怎么做出来的?

为了能够通过16s测序数据来准确的预测出功能构成,首先需要对原始16s测序数据的种属数量进行标准化,因为不同的种属菌包含的16s拷贝数不相同。

然后将16s的种属构成信息通过构建好的已测序基因组的种属功能基因构成表映射获得预测的功能结果。(根据属这个水平,对不同样本间的物种丰度进行显著性差异两两检验,我们这里的检验方法使用STAMP中的two-sample中T-TEST方法,Pvalue值过滤为0.05,作Extent error bar图。)

此处提供COG,KO基因预测以及KEGG代谢途径预测。当然,跃跃欲试的小伙伴也可自行使用我们提供的文件和软件(STAMP)对不同层级以及不同分组之间进行统计分析和制图,以及选择不同的统计方法和显著性水平。

这里提到的STAMP有些小伙伴说不太了解,别急,后面会有更多介绍。

COG构成差异分析图

图中不同颜色代表不同的分组,列出了COG构成在组间存在显著差异的功能分类以及在各组的比例,此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。

KEGG代谢途径差异分析图

通过KEGG代谢途径的预测差异分析,我们可以了解到不同分组的样品之间在微生物群落的功能基因在代谢途径上的差异,以及变化的高低。为我们了解群落样本的环境适应变化的代谢过程提供一种简便快捷的方法。

本例图所显示的是第三层级的KEGG代谢途径的差异分析,也可以针对第二或第一层的分级进行分析。

图中不同颜色代表不同的分组,列出了在第三层级的构成在组间存在显著差异的KEGG代谢途径第三层分类以及在各组的比例,此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。

案例解析

研究背景:尽管普遍认为肠道微生物组的生态多样性和分类组成在肥胖和T2D中发生改变,但与单个微生物或微生物产物的关联在研究之间不一致。缺乏大样本群体研究,从而确定肠道微生物组,血浆代谢组,肥胖和糖尿病表型以及环境因素之间的几种关联。

主要图表

按照肥胖和糖尿病对人群分为三组,同时进行了16S,代谢和宏基因组的检测。

与肥胖相关的菌属以及代谢途径

研究结论:确定了肠道微生物组,血浆代谢组,肥胖和糖尿病表型以及环境因素之间的几种关联。与肠道微生物组变异相关的主要是肥胖,不是2型糖尿病。存在与肠道微生物组变异相关的药物和膳食补充剂。高铁摄入量影响小鼠的肠道微生物组成。微生物组变异也反映在血清代谢物谱中。

点评:

相对大人群的队列研究,同时涵盖了菌群、代谢和疾病表型以及膳食补充调查的数据。

从结果看菌属和血浆代谢存在关联,但是贡献度都较低,如果样本数量不足很可能找不到显著的联系,这也是这类大样本队列研究的意义。

本研究在人群分组时针对性的研究了肥胖-II型糖尿病和菌群的关联,因而构建了三个主要分组人群,结果显示肥胖与菌群的关联度更大,解释了大部分的菌群差异,而糖尿病的菌群变化较小。

本研究其中较为重要的是发现了不同膳食补充对菌群的影响,并在小鼠实验中得到证实。

基因的差异分析图

除了能对大的基因功能分类和代谢途径进行预测外,我们还能提供精细的功能基因的数量构成的预测,以及进行样本间以及组间的差异分析,并给出具有统计意义和置信区间的分析结果

这一分析将我们对于样本群落的差异进一步深入到了每一类基因的层面。

图中不同颜色代表不同的分组,列出了在组间/样本间存在显著差异的每一个功能基因(酶)以及在各组的比例,此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。

很多小伙伴总希望能亲自上手做点分析,机会来了!

在获得标准报告后如果希望单独修改分组或对某些组之间进行显著性差异分析,可以使用STAMP软件在自己的电脑上进行数据分析。STAMP提供了丰富的统计检验方法图形化结果的输出。

在使用STAMP之前需要首先准备需要的spf格式文件和样品分组信息表,但是如果数据不会处理,那也很不便。

而在我们的报告中已经将KEGG和KO以及COG的结果文件后经过转换生成了适用于STAMP软件打开的spf格式文件,还有对应的分组信息表文件groupfile.txt。

使用STAMP时的一些相关问题

1、STAMP作图用的原始数据的来源?

STAMP 可以直接使用来自QIIME的biom文件和PICUST的KEGG和ko 文件,groupfile.txt文件的格式为tab-saperated value (tab键隔开的数据)

2、分组问题?

导入数据之后,viewàgroup legend ,在窗口右侧会出现分组栏,根据需要进行分组。

3、Unclassiffied选项中,remain Unclassiffied reads、remove Unclassiffied reads、和use only for calculating frequency profiles 方法的区别?

remain Unclassiffied reads和use only for calculating frequency profiles方法会保留所有的数据,而remove Unclassiffied reads仅仅保留有确定分组信息的数据。

4、Statistical test 中,Welch’s t-test、t-test、white’s non-parametric t-test的区别,各自优缺点?

为了确保统计学意义和准确度和精确性,需要足够多的样本数目,t-test检验可以在最少样本数为4的时候确保高的准确度和精确性。

当两个样本之间具有相同方差的时候,用t-test更为准确,当两个样本没有相同方差Welch’s t-test更为准确。

当样本数目少于8的时候,可以使用white’s non-parametric t-test,该计算时间较长,当样本数目过多的时候不宜使用该方法。

5、Two-group 中 type: one side和two side的区别?

One side 只会显示前一个group与后一个group差异的比例,而two side 两者之间的比例均会显示

6、STAMP在使用时首先打开了一个分析文件,如果新打开一个可能会导致显示错误?

目前版本的STAMP存在一些小问题,一次分析只能使用一个数据文件,如果要打开新的需要关闭软件后再打开。

详细的STAMP使用教程可以参考我们提供的STAMP使用教程。

环境因子分析

冗余分析(redundancy analysis, RDA)或者

典范对应分析(canonical correspondence analysis, CCA)都是基于对应分析发展的一种排序方法,将对应分析与多元回归分析相结合,每一步计算均与环境因子进行回归,又称多元直接梯度分析。主要用来反映菌群与环境因子之间的关系。

RDA 是基于线性模型,CCA是基于单峰模型。分析可以检测环境因子样品菌群三者之间的关系或者两两之间的关系。

○ 冗余分析可以基于所有样品的OTU作图,也可以基于样品中优势物种作图;

○ 箭头射线:箭头分别代表不同的环境因子;

○ 夹角:环境因子之间的夹角为锐角时表示两个环境因子之间呈正相关关系,钝角时呈负相关关系。环境因子的射线越长,说明该影响因子的影响程度越大;

○ 不同颜色的点表示不同组别的样品或者同一组别不同时期的样品,图中的拉丁文代表物种名称,可以将关注的优势物种也纳入图中;

○ 环境因子数量要少于样本数量,同时在分析时,需要提供环境因子的数据,比如 pH值,测定的温度值等。

个性化图表

除以上部分,还可以进行个性化图表定制,像下面这样:

看完以上内容,也许还有不明白的地方,没关系,我们罗列了一些常见的问题。看看有没有你想问的。

答疑小课堂

Q1

原始数据形式以及数据如何上传?

原始fastq格式是一个文本格式用于存储生物序列(通常是核酸序列)和其测序对应的质量值。这些序列以及质量信息用ASCII字符标识。通常fastq文件中一个序列有4行信息:如

第一行:序列标识,以 @开头。格式自由,允许添加描述信息,描述信息以空格分开。

第二行:序列信息,不允许出现空格或制表符。一般是明确的DNA或RNA字符,通常大写

第三行:用于将序列信息和质量值分隔开。以 +开头,后边是描述信息或者不加。

第四行:质量值, 每个字符与第二行的碱基一一对应,按照一定规则转换为碱基质量得分。进而反映该碱基的错误率,因此字符数必须和第二行保持一致。

Fasta格式

fasta是一种基于文本用于表示核苷酸序列或氨基酸序列的格式。在这种格式中碱基对或氨基酸用单个字母来编码,且允许在序列前添加序列名及注释。由两部分信息组成:如

第一行:序列标记,以 >开头,接序列的标识符,序列标识符以空格结束,后接描述信息。为保证分析软件能区分每条序列,每个序列的标识必须具有唯一性。

第二行:序列信息,使用既定的核苷酸或氨基酸编码符号。

数据提交

原始数据(Raw data),常见的是illumina机器产生的fastq文件,这一类文件需要向NCBI的SRA数据库进行提交,SRA是NCBI为了并行测序的高通量数据(massively parallel sequencing)提供的存储平台。完整提交SRA需要一些独立项目的分步提交,包括BioProject、BioSample、Experiment、Run等,每一部分用以描述数据的不同属性。

Q2

如何判断测序质量是否合格?

原始的Tags数据会经过质控、过滤、去嵌合体,最终得到有效数据(Effective Tags)。所以在判断测序质量是否合格时应该从几个方面去判断。

打开文件01_sequence_statistic/sumOTUPerSample.txt

报告里所有的txt打开如果格式不对的话,可以用excel表打开。

其中tags为经质量过滤后能正确overlap包含正确barcode和高质量序列的数据。

Singleton为非完全相同的序列,只要有1个碱基的差异即为不同序列,该值的高低与OUT数量并无直接关系,OTU是以97%的相似度聚类,测序质量较低导致的碱基错误、PCR扩增过程中的碱基错误、菌种内部的多样性以及OTU数量均会影响该数量。

Chimeras为通过与RDP等标准数据库比对分析判断可能由于PCR过程错误扩增导致的嵌合体比例,chimeras%为百分比,一般低于1。

首先判断下机数据tags和有效数据 clean tags 的数据量是否满足测序要求,一般下机数据量达到3万条reads以上满足测序需要,谷禾16s样本的测序深度可以达到10万条reads左右。如果数据量不够则需要重新补测样本。通过观察嵌合体数chimras 和嵌合体所占百分比chimeras%,可以反应出有效序列的转化率,嵌合体的比例越小序列的利用转化率就越高。

根据稀释曲线可以判断测序深度是否达到饱和,如图中曲线都逐渐趋于平缓,就证明样本的测序深度较好,测序深度基本覆盖能测到的该样本所有的物种,测序深度比较好。同时曲线趋于水平纵坐标的高低也能够反映各样本的微生物多样性情况,曲线越高,证明测到的物种种类越多,样本的微生物多样性就越高。

而从该图可以看出,个别样本的曲线未趋于平缓,证明该样本测序深度不够,测序深度未能很好的反映出该样本的完整菌群构成。如果测序数据量更大的的话会检测到更多物种。

Q3

如何了解分组内部的多个样本的重复性以及多样性情况?

观察分组内部多个样本的重复性如何可以从以下几个方面考虑。

首先在各分类水平的柱状图的菌属构成来看

从构成图来看,Flu组和ZW3.7组,组内样本重复性较好。Ctrl组中Ctrl.2明显区别于组内另外两个样本,可以去掉该样本。而ZW3.8组内样本间差异性较大。

比如人体肠道或小鼠肠道样本本身个体差异性较大,菌群结构组成复杂,即便通过不同疾病的分类的样本,但营养饮食、代谢以及环境的影响都会改变肠道菌群的构成,所以有可能组内样本间差异性会比较大。而经过单因素处理的样本组内差异会比较小。

所以在前期实验设计时,尽量选择同一批次相同处理的小鼠或其他样本,避免组内差异的影响。并且要预留好多余的样本,比如组内只有3个样本,如果去掉一个差异性较大的样本,一个分组内只有2个样本,会影响后续组间差异比较,组间差异性比较分析每组要至少要3个样本。

通过beta多样性分析PCA,PCoA,MNDS 也可以大致观察组内样本重复性情况,左图组内样本重复性较好,右图组内样本间差异性较大,两组间的区割不是很明显。

在加圈图的beta多样性分析中,右下角有给出PC1和PC2的P值,小于0.05则差异显著。

Alpha多样性是针对单个样品中物种多样性的分析,包括chao1指数、ace指数,shannon指数以及simpson指数等。前面4个指数越大,最后一个指数越小,说明样品中的物种越丰富。

其中chao指数和ACE指数反映样品中群落的丰富度(species richness),即简单指群落中物种的数量,而不考虑群落中每个物种的丰度情况。指数对应的稀释曲线还可以反映样品测序量是否足够。如果曲线趋于平缓或者达到平台期时也就可以认为测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种;反之,则表示样品中物种多样性较高,还存在较多未被测序检测到的物种。

而shannon指数以及simpson指数反映群落的多样性(species diversity),受样品群落中物种丰富度(species richness)和物种均匀度(species evenness)的影响。相同物种丰富度的情况下,群落中各物种具有越大的均匀度,则认为群落具有越大的多样性。

稀释曲线是利用已测得序列中已知的各种OTU的相对比例,来计算抽取n个(n小于测得Reads序列总数)Tags时各Alpha指数的期望值,然后根据一组n值(一般为一组小于总序列数的等差数列,本项目公差为500 )与其相对应的Alpha指数的期望值绘制曲线。

Q4

不同的样本之间差异大吗?不同分组之间能否用菌群差异来区分?

观察不同分组间差异的大小可以观察随机森林分类效果图。

路径在07_diff_analysis/RF

图中以该分类水平下选取用于区分不同分组间的差异性起到关键性影响因素的物种作为标志物作图。标志物按重要性从大到小排列,图中随机森林值error rate 表示用随机森林方法预测分组之间的错误率,分值越高代表所选取的标志物准确度不高,并不能很好的用于区分各分组,分组差异不显著。分值越低证明分组效果比较好。

上图中的随机森林按照门和属以及代谢途径分别进行分析作图,各自都有单独文件,报告中仅给出了一个图,其他文件需要到目录中查看。可能存在门或属区分效果不佳,但是代谢途径区分效果较好。

随机森林筛选出来的物种是用于区分所有分组的重要标志。分值越高代表该物种用于区分所有组之间的重要性越大。

Q5

二代测序16s 能用普通酶扩增吗?

16s测序主要为了鉴定菌种,通常在做鉴定的时候区分标准是97%,区分亚种和菌株的时候相似度更高。
普通TAQ酶的复制错误率较高,可能在扩增过程中引入错误,这些错配可能导致相似度下降从而分类错误。
一般我们不建议使用普通TAQ酶进行扩增,都选择高保真酶。

Q6

利用16s rRNA鉴定细菌能确定到种上吗?

16s rRNA长度为1.5k多,作为菌种鉴定一般选择相似度97%的标准,相似度超过97%一般定义为同一种菌。


如果是sanger测序获得16s全长的都可以鉴定到种,甚至能区分亚种。有些细菌并不只有1个16s序列,会包含有1-15拷贝的16s序列,所以单一的16s序列鉴定可能会出现偏差。


利用高通量如454或miseq测序一般由于读长的缘故,通常只有300-500多个碱基被测序,所以在物种鉴定上一般比较可靠的是能分类到属,部分能分类到种。


根据我们的经验,不同的样品会有大约10-50的菌能分类到种。利用新的分析方法,我们现在也可以利用16s rRNA的群落多样性高通测序数据进行亚种级别的分析。主要是利用16s中共同变化的SNP位点进行分型。这样可以大大提高菌种的分类精度,尤其是在有些菌株之间表型差异巨大的时候。

Q7

听说光测16s就可能预测基因和功能,是真的吗?

16s序列能够区分菌的种属,但是并不包含这些菌的基因和代谢功能的信息。不过由于我们已经对大量的细菌基因组进行了测序,所以可以根据16s的菌种信息,利用这个菌属已经测序的细菌基因组的基因信息和代谢功能信息来估计每类基因的上限和下限。


所以答案是可以利用16s序列测序来预测菌群的功能基因分布和代谢途径分布情况。
目前主要使用的软件是PICRUSt和新发表的Tax4Fun。


从我们实际分析和实验结果来看,预测的准确性还是很高的,不过和样品有很大关系。像肠道菌群和土壤以及一些致病菌的测序较多,所以预测的准确度较高可以到85-90%以上。一些海洋的菌由于测序的菌较少,预测准确性要差一些。目前发表的文献基本都是用PICRUSt,新的软件还有待验证。

Q8

测16s rRNA能分到亚种吗?不同菌株都有致病性差异光到种不解决问题啊!

16s rRNA如果是使用sanger测序可以细分到亚种甚至有些可以精确区分菌株,但是要看菌种。

如果是高通量测序,目前的常见分析一般以97%为标准,大部分情况只能到属,少部分能区分到种。如果要进一步细分到亚种甚至更小的区分目前是有可能的,我们在使用oligotype一类的方法时可以将相同变化模式的SNP归类,并对原来的OTU进行进一步细分,理论上可以区分到菌株。


不过这种区分不同菌属差异很大,有些可以很理想的区分,主要用来了解在更细分化尺度上菌株构成的地理和时间变化。
仅通过16s高通量测序恐怕不能完全解决菌株致病性差异这种问题,但是通过对常见OTU的进一步深入分析可以提供可能的解释或方向。如果明确了某一特定类型菌株的变化有关,可以采用比如毒力基因或菌株特异性标记等方法详细了解不同菌株的比例和差异。

多项合作成果发表于Nature communications、PNAS、Plant biotechnology journal、DNA Research、Environmental Science & Technology、Plant、cell & environment、Science of The Total Environment 、Gut Microbes 、Frontiers in microbiologyt、Journal of environmental management 等国际著名学术期刊。

近期发表文章目录

  • Li W, Zhang Y, Wu N, et al. Colonization characteristics of bacterial communities on plastic debris, influenced by environmental factors and polymer types in the Haihe Estuary of Bohai Bay, China[J]. Environmental Science & Technology, 2019. 
  • Mao Z, Li Y, Dong T, et al. Exposure to Titanium Dioxide Nanoparticles During Pregnancy Changed Maternal Gut Microbiota and  Increased Blood Glucose of Rat[J]. Nanoscale research letters, 2019, 14: 26. 
  • He Z, Kong X, Shao T, et al. Alterations of the Gut Microbiome Associated with Promoting Efficacy of Prednisone by Bromofuranone in MRL/lpr Mice[J]. Frontiers in Microbiology, 2019, 10: 978. 
  • Liu Y, Lu M, Zhang X, et al. Shift of the microbial communities from exposed sandstone rocks to forest soils during pedogenesis[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2019, 140: 21-28. 
  • Lu H, Wang W, Li F, et al. Mixed-surfactant-enhanced phytoremediation of PAHs in soil: Bioavailability of PAHs and responses of microbial community structure[J]. Science of The Total Environment, 2019, 653: 658-666. 
  • Xu S, Wang W, Zhu L. Enhanced microbial degradation of benzo [a] pyrene by chemical oxidation[J]. Science of The Total Environment, 2019, 653: 1293-1300. 
  • Ji C, Yan L, Chen Y, et al. Evaluation of the developmental toxicity of 2, 7-dibromocarbazole to zebrafish based on transcriptomics assay[J]. Journal of hazardous materials, 2019, 368: 514-522. 
  • Ju M, Liu Y, Li M, et al. Baicalin improves intestinal microecology and abnormal metabolism induced by high-fat diet[J]. European journal of pharmacology, 2019: 172457. 
  • Wu H, Li Y, Zhang W, et al. Bacterial community composition and function shift with the aggravation of water quality in a heavily polluted river[J]. Journal of environmental management, 2019, 237: 433-441.
  • Xia H, Wu Y, Chen X, et al. Effects of antibiotic residuals in dewatered sludge on the behavior of ammonia oxidizers during vermicomposting maturation process[J]. Chemosphere, 2019, 218: 810-817. 
  • Sun Y, Geng W, Pan Y, et al. Supplementation with Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 from Tibetan Kefir improves depression-like behavior in stressed mice by modulating the gut microbiota[J]. Food & function, 2019, 10: 925-937. 
  • Wu S, Qiu J, Gao Q. QTL-BSA: A Bulked Segregant Analysis and Visualization Pipeline for QTL-seq[J]. Interdisciplinary Sciences: Computational Life Sciences, 2019: 1-8
  • Liu H, Pan L, Lv S, et al. Alterations of Gut Microbiota and Blood Lipidome in Gestational Diabetes Mellitus with Hyperlipidemia[J]. Frontiers in Physiology, 2019, 10: 1015. 

谷禾健康2019年中秋收样及报告安排

收样安排

         中秋前实验室的收样时间截止9月12日,客户的样本必须在9月12日前送到实验室会安排节前上机。中秋期间9月13日至9月15日实验室无法收样。

报告交付

         原定9月13号出具报告的样本报告将延后于9月16号出具。








杭州谷禾信息技术有限公司

                                                                                         2019年9月2日

深度解读 | 饮食、肠道菌群与健康

谷禾健康 原创

   导语:You are what you eat.

             ——饮食、肠道菌群与健康

肠道菌群对人体健康的影响和关联性已被广泛研究和认可,肠道菌群作为人体最重要的共生伙伴与我们的健康密切相关。影响肠道菌群的因素众多,饮食、年龄、发育、遗传、疾病、抗生素、用药、甚至激素水平和情绪压力都影响并塑造着每个人独特的肠道菌群,但是短期内,饮食内容以及饮食模式被认为是塑造肠道菌群最重要的驱动因素,长期来看,饮食也是调整和干预肠道菌群调整最有效和健康的选择方式。

肠道菌群是消化的关键组成部分,分解复杂的碳水化合物,蛋白质,并且在较小程度上分解到达下胃肠道的脂肪。该过程产生大量微生物代谢物,其可以局部和全身起作用(在被吸收到血流中之后)。这些途径都可以产生潜在有益和潜在毒性的代谢物。


Graf D, Microbial ecology in health and disease, 2015

接下来,我们逐一解析各大营养物质和肠道菌群之间的关系,对人体健康会带来什么样的影响。

小贴士【全文导航】

​各类营养成分

  • 膳食纤维   
    • 菊粉
    • 抗性淀粉
    • 低聚果糖和低聚半乳糖
    • 聚葡萄糖
    • 阿拉伯木聚糖 
  • 碳水化合物
    • 短链脂肪酸(乙酸盐,丙酸盐和丁酸盐)
    • 细菌交叉喂养
  • 脂肪  
    • 高脂饮食引起的菌群失调可能与其促胆汁酸分泌有关
    • 脂肪也有好坏之分
  • 蛋白质
    • 氨基酸
  • 植物源生物活性营养素  
    • 多酚
  • 维生素
    • 维生素K,B9,B12,B2,D3
  • 食品添加剂 
    • 膳食乳化剂
    • 无热量的人造甜味剂 
  • 矿物质

​饮食模式—菌群

  • 西方饮食
  • 地中海饮食
  • 亚洲饮食
  • 不同饮食特点的肠道菌群特征
  • 动物饮食 vs 植物饮食

饮食量作为微生物调节剂

进食频率对菌群的影响   

时间-饮食-菌群

  • 一生中饮食都会影响肠道细菌的结构和功能
  • 失调的昼夜节律和饮食对微生物群的影响

饮食-菌群-健康互动的复杂性

  • 人类主要肠道菌群及其代谢产物
  • 膳食成分通过肠道菌群和宿主代谢相互作用
  • 膳食代谢产物可通过不同的信号通路引起免疫应答,从而影响神经系统
  • 饮食和菌群相互作用影响胃肠功能和健康
  • 肠道菌群稳定性及对饮食的响应周期

普通膳食建议

膳食纤维

大部分食物经过小肠时吸收,但仍有一部分不能被消化吸收,主要是植物细胞壁多糖(包括纤维素,木聚糖,果胶)以及一些特定对体内水解酶无反应的多糖成分(如菊粉和寡糖),通常称为膳食纤维。膳食纤维在这里被定义为具有三个或更多个单体单元的碳水化合物聚合物。

膳食纤维对结肠屏障有重要作用,是结肠微生物的主要营养来源,经细菌酵解可以形成短链脂肪酸,对维持结肠系细胞的营养和功能完整时必需的,而且还具有排气,解毒,抗氧化,抗癌作用。

膳食纤维的发酵是盲肠和结肠微生物群的主要功能之一,也是短链脂肪酸的主要来源,短链脂肪酸是发酵的最终产物。

膳食纤维摄入增加时,胃肠运输速度增快,肠腔内细菌数量因营养物质增加而增多,从而使短链脂肪酸的含量明显增加肠腔内PH值下降影响肠腔内特定菌群的定植和生长。

膳食纤维主要有以下几类:

菊粉

一些研究表明菊粉通常与其他纤维结合从而对人体肠道微生物群组成产生影响。

菊粉或与减轻腹泻有关

一项研究调查了菊粉和部分水解瓜尔胶(i-phgg)或麦芽糊精混合物对60名便秘妇女肠道微生物群的影响。其中纤维组梭状芽孢杆菌(某些种类与腹泻有关)总数减少

食用菊粉后双歧杆菌增加

在另一项研究中,从全球洋蓟(cynara scolymus)中提取的长链菊粉被给予健康志愿者。这项研究持续了3周,经过3周的缓冲期后,受试者又服用了3周的麦芽糊精(安慰剂)。总细菌水平不受干预影响。然而,与基线水平和麦芽糖糊精摄入后相比,食用菊粉后双歧杆菌数量显著增加。而且,食用菊粉后乳酸杆菌/肠球菌的数量更高,而食用麦芽糖糊精后则有所下降。另外,阿托波氏菌属的丰度增加,拟杆菌/普氏杆菌组的数量减少。SCFA浓度无差异。

此外,Lecerf等人还研究了菊粉和低聚木糖的影响。.在一项随机交叉研究中,60名健康受试者被给予木糖低聚糖、菊粉和木糖低聚糖以及小麦麦芽糖糊精的混合物4周。与麦芽糖糊精相比,仅木糖低聚糖就能提高双歧杆菌和丁酸盐的粪便浓度。此外,A-葡萄糖苷酶和B-葡萄糖醛酸酶活性较高,而乙酸和R-甲酚的粪便浓度较低。菊粉和低聚木糖的组合增加了粪便中的短链脂肪酸和丙酸盐,同时降低了血液中的脂多糖浓度

抗性淀粉

淀粉可能逃过小肠的消化,到达结肠发酵。这种抗性淀粉通常被称为物理不可接近淀粉(RS1)、天然颗粒淀粉(RS2)、逆反应淀粉(RS3)或化学改性淀粉(RS4)

抗性淀粉促进布氏瘤胃球菌生长

一项随机交叉研究,包括14名超重男性,研究了在10周内服用RS3的效果。在特定饮食中,个体的细菌分布随时间的推移是恒定的。大多数研究对象在RS饮食中,布氏瘤胃球菌Ruminococcus bromii的丰度增加,该菌比例高达17%,而在含有麦麸的非淀粉多糖(NSP)饮食中为3.8%。未培养的颤杆菌克Oscillibacter和直肠真杆菌的水平也随着含有RS的饮食而增加。

在另一项关于RS的研究中,10名受试者被给予RS2、RS4或天然淀粉作为饼干,持续3周。RS4导致放线菌和类杆菌数量增加,而厚壁菌门数量降低。在种水平上,青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis和迪氏副拟杆菌Parabacteroides distasonis的比例随RS4的增加而增加,而RS2则较RS4提高了布氏瘤胃球菌Ruminococcus bromii和直肠真杆菌的比例。个体差异较大,变化是可逆的,且与消耗的RS相关。

综上这两项研究的结果表明,食物中RS可能对布氏瘤胃球菌Ruminococcus bromii和直肠真杆菌有促进生长的作用,但这种作用可能取决于所使用的RS的类型。

低聚果糖和低聚半乳糖

无法在小肠中被酶解吸收,到达结肠后可产生SCFA,降低肠道pH值,具有促进双歧杆菌、乳杆菌等有益菌增殖,抑制肠杆菌、沙门菌等有害菌肠道内定植和繁殖的生理功能。

在一项前瞻性、双盲、随机、交叉试验中,健康志愿者每2周食用液体配方食品。一种配方食品含有由低聚果糖和豌豆纤维组成的膳食纤维,而另一种配方食品不含添加纤维。

在研究开始和两个干预期(6周)之间,志愿者们消耗他们的习惯性饮食。除双歧杆菌比例随纤维补充饮食增加而增加外,两个饮食期后所有靶向细菌种类均减少。

无论饮食的纤维含量如何,普氏栖粪杆菌Faecalibacterium prausnitzii和Roseburia intestinalis水平均降低,而拟杆菌的减少只发生在无纤维饮食。

无纤维饮食后,粪便短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)浓度降低,而补充纤维饮食后,丁酸盐浓度也降低。

在一项双盲安慰剂对照交叉研究中,超重的成年人被喂食半乳糖(GOS)或麦芽糊精(安慰剂)混合物12周。在6周和12周后,含GOS的饮食增加了粪便中双歧杆菌的数量,而与安慰剂组相比,拟杆菌属(Bacteroides sp .)和梭菌(Clostridium histolitycum group)的数量同时减少

聚葡萄糖

在持续21天的对照研究中,检测了聚葡萄糖(PDX)摄入对肠道微生物群的影响。每天志愿者食用三个小吃棒,提供PDX,可溶性玉米纤维或无纤维(对照)。与对照条相比,摄入PDX和可溶性玉米纤维导致梭菌科增多,优杆菌科减少。粪杆菌属Faecalibacterium,考拉杆菌属Phascolarctobacterium和戴阿利斯特杆菌属Dialister的水平较高,而对于乳杆菌,仅在可溶性玉米纤维消耗后才观察到这种效应。

普氏栖粪杆菌Faecalibacterium prausnitzii的数量也增多了。这种菌是丁酸盐生产者,以其抗炎特性而闻名。

处理前后,厚壁菌是最丰富的细菌群(93%),而纤维素消耗后,放线菌的丰度减少。

另一项对照研究,包括接受PDX治疗3周的健康人类受试者,结果显示,已知生产丁酸盐的菌Ruminococcus intestinalis的数量和Clostridium I,II和IV菌数量增加,而与接受麦芽糖糊精的安慰剂组相比,乳杆菌/肠球菌比例降低。肠道菌群变化持续了10周。

阿拉伯木聚糖

Processed with VSCO

在一项前瞻性、双盲、随机、交叉试验中,健康志愿者每2周食用液体配方食品。一种配方食品含有由低聚果糖和豌豆纤维组成的膳食纤维,而另一种配方食品不含添加纤维。

在研究开始和两个干预期(6周)之间,志愿者们消耗他们的习惯性饮食。除双歧杆菌比例随纤维补充饮食增加而增加外,两个饮食期后所有靶向细菌种类均减少。

无论饮食的纤维含量如何,普氏栖粪杆菌Faecalibacterium prausnitzii和Roseburia intestinalis水平均降低,而拟杆菌的减少只发生在无纤维饮食。

无纤维饮食后,粪便短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)浓度降低,而补充纤维饮食后,丁酸盐浓度也降低。

在一项双盲安慰剂对照交叉研究中,超重的成年人被喂食半乳糖(GOS)或麦芽糊精(安慰剂)混合物12周。在6周和12周后,含GOS的饮食增加了粪便中双歧杆菌的数量,而与安慰剂组相比,拟杆菌属(Bacteroides sp .)和梭菌(Clostridium histolitycum group)的数量同时减少

聚葡萄糖

在持续21天的对照研究中,检测了聚葡萄糖(PDX)摄入对肠道微生物群的影响。每天志愿者食用三个小吃棒,提供PDX,可溶性玉米纤维或无纤维(对照)。与对照条相比,摄入PDX和可溶性玉米纤维导致梭菌科增多,优杆菌科减少。粪杆菌属Faecalibacterium,考拉杆菌属Phascolarctobacterium和戴阿利斯特杆菌属Dialister的水平较高,而对于乳杆菌,仅在可溶性玉米纤维消耗后才观察到这种效应。

普氏栖粪杆菌Faecalibacterium prausnitzii的数量也增多了。这种菌是丁酸盐生产者,以其抗炎特性而闻名。

处理前后,厚壁菌是最丰富的细菌群(93%),而纤维素消耗后,放线菌的丰度减少。

另一项对照研究,包括接受PDX治疗3周的健康人类受试者,结果显示,已知生产丁酸盐的菌Ruminococcus intestinalis的数量和Clostridium I,II和IV菌数量增加,而与接受麦芽糖糊精的安慰剂组相比,乳杆菌/肠球菌比例降低。肠道菌群变化持续了10周。

阿拉伯木聚糖

对健康成年人食用含有阿拉伯低聚糖(AXOS)的面包进行了对照研究。为了干预,将木聚糖内酯酶制剂加入到小麦/黑麦面包的面团中,得到平均聚合度为18。安慰剂面包含有阿拉伯木聚糖,平均聚合度为174。

安慰剂治疗后,拟杆菌/直肠真杆菌和 罗氏-真杆菌(Roseburia – Eubacterium) /普氏栖粪杆菌 比例更高。

食用添加AXOS的面包后,细菌总数和粪便丁酸盐含量增加,而分支链短链脂肪酸的浓度降低,同时,蛋白质发酵减少。

此外,一项随机的安慰剂对照的交叉研究检查了服用AXOS或麦芽糖糊精(安慰剂)的效果。与基线水平相比,摄入AXOS后(但3周后食用安慰剂后)双歧杆菌水平增加。细菌总数,乳酸杆菌,罗氏-直肠真杆菌或肠杆菌没有变化。在AXOS饮食后,尿液中的甲酚(一种细菌代谢物)含量较高。

总的来说,具有不同化学成分的膳食纤维似乎能够刺激产丁酸盐菌的生长和活性,例如Roseburia、直肠真杆菌和普氏栖粪杆菌。此外,摄入纤维后,双歧杆菌和乳酸杆菌的数量增加,并经常出现拟杆菌向副拟杆菌的转变。肠道中较高浓度的丁酸盐可能有益于局部和全身健康。

综上,我们已经了解到膳食纤维对身体健康的益处,那么假设不吃膳食纤维,会发生什么后果呢?

一项研究构建了无菌小鼠,研究人员定制了3种食物:含有15%纤维的食物;富含可溶性纤维的食物(类似于膳食补充剂);不含有纤维的食物。他们以不同的食物喂养试验小鼠,并用大肠杆菌感染它们。

不吃膳食纤维,肠道菌群会吃你

结果发现:富含15%纤维的食物喂养的小鼠,它们肠道被感染的程度最轻。因为它们肠道黏液层较厚,可以防御细菌入侵。但是,如果小鼠摄取的是不含有纤维的食物,它们体内的肠道菌群会因为饥饿而“吃”黏液。一旦长期缺乏纤维,肠道菌群甚至于会“吃”肠壁。而且,使用富含可溶性纤维食物(类似膳食补充剂)的小鼠,它们体内的肠道菌群依然会呈现出“饥饿”状态。

碳水化合物

那些富含淀粉的食物,是我们平时摄入碳水化合物的主要来源,比如大米、小麦、玉米等谷物、土豆等薯类。

大肠中的细菌主要依赖于在上消化道中未消化的膳食底物以存活。糖分解细菌发酵通常产生有益的代谢产物,而如果碳水化合物含量有限,细菌转向替代能源,导致其他代谢产物的产生,这可能对人类健康更有害。膳食碳水化合物发酵后的关键细菌发酵产物是短链脂肪酸和气体

细菌发酵产物之一 短链脂肪酸

粪便中检测到的三种最丰富的SCFA是乙酸盐丙酸盐丁酸盐

丁酸盐潜在的抗癌活性

丁酸盐可以说是最重要的。它能通过抑制组蛋白去乙酰化酶诱导结肠癌细胞凋亡及其调节基因表达的能力,形成人类结肠细胞的关键能量来源,并具有潜在的抗癌活性。还有证据表明丁酸盐可通过cAMP依赖性机制激活肠道糖异生(IGN),对葡萄糖和能量稳态有益。

丙酸盐与减肥有关

丙酸盐也是上皮细胞的能量来源,但也转移到肝脏,在肝脏中它也在糖原异生中起作用。由于与肠道受体(G蛋白偶联受体,GPR)GPR 41和GPR 43(也称为脂肪酸受体FFAR2和FFAR3)相互作用,它也越来越被认为是饱腹感信号中的重要分子。在肠道糖异生中丙酸转化为葡萄糖通过减少肝葡萄糖的产生直接促进能量稳态,从而减少肥胖。

细菌成长离不开乙酸盐

乙酸盐是最丰富的SCFA,是其他细菌生长的必需辅因子/代谢物。例如,在没有乙酸盐的情况下,普氏栖粪杆菌Faecalibacterium prausnitzii不会在纯培养物中生长。

细菌交叉喂养

细菌产生中间发酵产物,包括富马酸盐,琥珀酸盐和乳酸盐,但由于其它细菌广泛利用它们,这些产物通常在健康个体的粪便中被检测到低水平。例如,乳酸通常被其他细菌转化为丙酸盐或丁酸盐,因此在成年粪便中以可忽略的水平存在。

然而,在患有溃疡性结肠炎的患者中,乳酸可以被检测到显着更高的量,并且可能是疾病的指标。共培养交叉饲喂研究说明了细菌相互作用对最终短链脂肪酸检测的影响。由长双歧杆菌在纯培养物中生长的果寡糖(FOS)产生的乳酸盐在与Eubacterium hallii的共培养中完全消失,且单独的E. hallii不能在碳水化合物底物上生长,被显著的丁酸盐水平所取代。

乙酸盐刺激了Roseburia intestinalis的生长,并且与不同的长双歧杆菌菌株共培养,果寡糖上的Roseburia intestinalis生长推迟,直到由长双歧杆菌产生的足够的乙酸盐积累在生长培养基中。

脂肪

脂类在小肠消化吸收的比例较大,粪便中测得的脂肪酸只有7%左右。但有关高脂饮食-肠道菌群相关研究越来越引人注目。

高脂肪含量的食物富含磷脂酰胆碱和胆碱,肠道细菌能将其转化成三甲胺,氧化的三甲胺进入血液可导致动脉粥样硬化,从而引发心血管疾病。

高脂饮食引起的菌群失调可能与其促胆汁酸分泌有关

脂肪量和质量可能影响肠道微生物群组成。胆汁酸是膳食影响菌群构成的重要因素之一,在消化、吸收脂类,以及清除、排泄机体产生的诸多废物等发面发挥重要作用。

来自人类干预研究的初步数据表明,膳食脂肪通过其对胆汁酸分泌以及胆汁酸组成的影响间接调节肠道菌群的组成。

高脂肪摄入会刺激胆汁酸的分泌并增加粪便中二级胆汁酸的浓度,如脱氧胆酸(DCA)。由于它们具有选择性的抗菌活性,胆汁酸如DCA可以介导脂肪诱导的肠道菌群改变。

在最近的一项短期干预研究中,高脂肪,以动物为基础的饮食显着增加粪便DCA浓度并改变微生物群组成,导致耐胆汁酸细菌增加。

脂肪也有好坏之分

高饱和和反式脂肪饮食被认为会通过提高血液总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇来增加心血管疾病的风险。另一方面,促进健康的脂肪,如单不饱和脂肪和多不饱和脂肪,对减轻慢性疾病的风险至关重要。

为了你的身体正常运转,你需要在饱和和不饱和脂肪之间保持稳定和平衡的供应。

几项人体研究表明,高脂肪饮食会增加厌氧菌总数和拟杆菌计数。让受试者食用不同脂肪含量的饮食。研究者指出,与基线水平相比,低脂肪饮食的摄入导致拟杆菌丰度增加,同时空腹血糖和总胆固醇降低。另一方面,高饱和脂肪饮食增加了普氏栖粪杆菌Faecalibacterium prausnitzii的相对比例

最后,摄入高单不饱和脂肪的受试者并没有经历任何细菌属相对丰度的变化,但总体上确实降低了总细菌负荷、血浆总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。

对大鼠的研究表明,摄入高脂肪食物会导致肠道乳酸菌数量显著减少,而产丙酸盐和乙酸盐的菌(包括梭状芽孢杆菌、拟杆菌和肠杆菌)则不成比例地增多。此外,肠道乳酸杆菌的丰度与大鼠脂肪量和体重呈负相关。

饱和脂肪促进代谢紊乱

猪油源性和鱼油源性脂质的比较显示,猪油喂养小鼠的拟杆菌和嗜胆菌属增多,用鱼油来源喂养的小鼠放线菌(双歧杆菌和Adlercreutzia)、乳酸菌(乳酸杆菌和链球菌)和Akkermansia muciniphila增加

此外,与食用鱼油的小鼠相比,食用猪油的小鼠的全身TLR活化、白色脂肪组织炎症和胰岛素敏感性受损。作者证明,至少部分原因是由于两组间肠道菌群不同。结果表明,饮食中富含饱和脂肪的小鼠肠道菌群可能通过TLR信号在挑战时促进代谢紊乱

另外还有第三类脂肪包括氢化脂肪,这是一种人工处理后的脂肪,天然食物中并不存在,比如油炸的快餐食品和人造黄油等,通常是不健康的应该避免食用。

蛋白质

食物中的蛋白质的消化产物主要是氨基酸以及一些小肽,约有95%经过胃和小肠被消化吸收,未吸收的氨基酸以及未消化的蛋白质在大肠下部,经大肠杆菌的作用,即腐败作用,产生一系列产物。

大多数的研究指出,蛋白质消耗与总微生物多样性相关。例如,关于乳清和豌豆蛋白提取物,已报道可提高肠共生双歧杆菌和乳酸杆菌,而乳清另外降低了致病脆弱拟杆菌和产气荚膜梭菌 。豌豆蛋白也被观察到增加肠道短链脂肪酸(SCFA)水平,这被认为是抗炎的并且对维持粘膜屏障很重要。

一项研究给无菌小鼠肠道接种10种细菌,并给予不同组合的单糖(蔗糖)、多糖(玉米淀粉)、脂肪(玉米油)和蛋白质(酪蛋白),结果发现随着酪蛋白浓度增加,细菌总数增加,有7种细菌数量与酪蛋白呈正相关,3种细菌呈负相关。数量与酪蛋白浓度呈正相关的细菌多形拟杆菌、卵形拟杆菌、粪拟杆菌均属于拟杆菌属,占细菌总数绝大部分。

此外,摄入红肉促进的几种微生物也与三甲胺-N-氧化物(TMAO)水平升高有关,三甲胺-N-氧化物是一种致动脉粥样化合物,可增加心血管疾病的风险。

【 注:红肉是营养学上的概念,指的是在烹饪前呈现岀红色的肉,含有很高的饱和脂肪。如猪肉、牛肉、羊肉、鹿肉、兔肉等所有哺乳动物的的肌肉、内脏及其制品都是红肉。

有证据表明,芳香族氨基酸(苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸)可以发酵成苯基丙醇代谢物,苯乙酸和4-羟基苯乙酸,它们在粪便中含量很高。所涉及的包括几种拟杆菌,Eubacterium hallii和Clostridium barlettii.

宿主对蛋白质的消化率比碳水化合物和脂肪的消化率变数更大,受先前提到的食品加工因素、大量营养素比率和转运时间的影响,这也导致不同氨基酸组成可以供肠道微生物群利用。

氨基酸发酵所需的额外的相互转化步骤产生了大量的代谢产物。对宿主有毒的化合物可由此过程产生,包括胺、酚/吲哚和含硫化合物。当然并非所有的氨基酸都会发酵成有毒的产品;事实上,最丰富的终产物是SCFAs.

氨基酸分解代谢两个步骤:要么脱氨生成羧酸加氨,要么脱羧生成胺加二氧化碳。脱氨基会产生高浓度的SCFAs.

接下来的步骤取决于氨基酸起始底物的种类,大多数最终会产生三羧酸循环中间体、丙酮酸盐或辅酶A-连接的SCFA前体。

人体肠道微生物群发酵氨基酸的主要产物

植物源生物活性营养素

植物,除了纤维,还为人类饮食提供了许多生物活性化合物。多酚是一大类不同的化合物,多存在于一些常见的植物性食物,如红酒、大豆、番茄、葡萄、绿茶等,其中一些有益于健康。

例如,给高脂饮食喂养的小鼠补充来自葡萄或蔓越莓的多酚,减少了炎症和饮食带来的致肥效果。这与
Akkermansia muciniphila菌的大量增加有关。

但由于对化合物的反应具有相当大的个体间差异,因此很难分析多酚对人类,特别是黄酮类化合物的健康影响,这可能源于肠道菌群的差异。

研究用高脂饮食喂养的小鼠,由于低膳食可用性和类黄酮降解共生物的增加,肠道中的黄酮类芹菜素和柚皮素水平显著减少。将高脂饮食喂养的小鼠转换为正常的多糖饮食使其代谢参数正常化,但不是它们的肠道菌群组成,其持续降解这些类黄酮,导致类黄酮水平低。由于成功节食的小鼠被重新喂养高脂饮食,低黄酮类水平充当“微生物群记忆”,通过影响棕色脂肪组织的热量产生进一步加剧高脂饮食喂养小鼠的代谢作用。用膳食芹菜素和柚皮素补充节食小鼠,可以通过补充其调节能量消耗的能力来防止加剧的体重恢复。

植物来源化合物如何与尿路结石风险增加有关?

通过肠道菌群改变为与健康有益的形式的其他植物化合物的实例包括羟基肉桂酸咖啡酸,香豆酸和阿魏酸,它们作为植物中的酯共轭物存在,并以其自由化学形式被认为是抗炎和抗氧化的。双歧杆菌,乳酸杆菌和埃希氏菌属的成员能够从共轭植物形态中释放出来,从而影响这些生物活性化合物的个体化水平。

与此同时,肠道菌群会降解其他有毒植物来源的化合物,如草酸盐,其中富含几种绿色,坚果,浆果和茶,并形成可能导致肾结石形成的草酸钙晶体。 在分解代谢草酸盐的细菌中,产甲酸草酸杆菌Oxalobacter formigenes是一个关键的参与者,该分类群的低丰度与尿草酸盐浓度升高和人类尿路结石风险增加有关。

各种食物中存在的膳食多酚类型

以及导致降解的微生物的类型

膳食多酚除了具有全身抗菌和代谢功能外,还具有抑制肠道细菌的作用。

维生素

维生素是人体健康必需的小分子物质,近年的研究发现这些小分子物质对肠道菌群的组成有一定的影响。

通过肠道菌群产生甲基萘醌,叶酸,钴胺素和核黄素,以满足其自身的能量和代谢需求。

维生素K在血液凝固,骨代谢以及可能的胰岛素敏感性中起关键作用。广泛的抗生素治疗降低肝脏维生素K2浓度,肠道菌群是维生素K的重要来源。

维生素B9是参与细胞分裂的必需维生素,这种维生素缺乏与癌症,贫血症的高风险相关和胚胎发育过程中的神经管缺陷。

维生素B12是一种代谢辅助因子,其缺陷导致老年人痴呆症和心血管疾病的风险增加。

维生素B2是辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)的前体。其缺乏与神经肌肉和神经系统疾病,癌症和李斯特菌感染的易感性有关。

一项研究通过问卷形式计算非洲裔美国人和美国白人的饮食组成,结果显示非洲裔美国人杂环胺的摄入较高,维生素的摄入较少,并且与两个种族粪便微生物组成差异相关。维生素D摄入不足或缺乏可引起肠道菌群组成的改变。

另有研究表明,补充维生素D3可改变上消化道(胃体、胃窦和十二指肠)的肠道微生物群。γ-变形杆菌相对丰度降低,包括假单胞菌属和大肠杆菌/志贺氏杆菌属,细菌丰度增加。

食品添加剂

在过去的几十年里,人类饮食的主要变化之一是加工食品的增加,这些食品通常含有合成的或天然的添加剂,如防腐剂、甜味剂、乳化剂和强化剂。这些添加剂通常被食品监管机构认为是安全的,依据是批准时公布的科学证据。

膳食乳化剂导致菌群失调引起炎症

许多食品(如工业生产的番茄酱)中都添加了膳食乳化剂,以保持油和水的乳剂。一项研究表明,低剂量的两种常见乳化剂,羧甲基纤维素和聚山梨酯-80,会使小鼠菌群失调,从而诱发低度炎症、代谢综合征和结肠炎。当对这些化合物的反应在人类肠道菌群培养中进行分析时,检测到了生物活性鞭毛蛋白水平的升高,其原因可能是菌群失调,也可能是细菌基因表达发生了改变。

另一种乳化剂是磷脂酰胆碱(一种卵磷脂)。与l-肉碱和其他胆碱分子一样,卵磷脂被肠道微生物群转化为TMA,从而增加TMAO水平和CVD1的风险

菌群决定无热量的人造甜味剂对人有益or有害

另一种常用的食品添加剂是无热量的人造甜味剂,它被推广为一种常见的减肥策略,通过将含有高热量糖的食物和饮料换成无热量的甜味替代品,来限制饮食中摄入的热量。

在人类的观察研究和啮齿类动物的干预中,对这种方法的疗效的研究显示出混合的和相互矛盾的结果:一些研究显示了无热量的人造甜味剂对减肥有益,而另一些研究报告了无热量的人造甜味剂促进增重和其他相关的代谢紊乱。

无热量的人造甜味剂与葡萄糖不耐受有关

有几项研究报告了啮齿动物在食用糖精、三氯蔗糖阿斯巴甜、甜蜜素、新甜和阿昔单胺钾等无热量的人造甜味剂时,其代谢平衡失调和菌群破坏。对改变的微生物组或其分泌的代谢物的基因含量进行的功能分析表明,人造甜味剂诱导的生态失调通向代谢表型,对于糖精,通过将引用糖精的小鼠菌群移植到GF幼鼠中,表现出同样葡萄糖不耐受。从而将无热量的人造甜味剂和葡萄糖不耐受建立直接联系。

无热量的人造甜味剂与提高能源收获能力有关

有趣的是,在两项针对不同无热量的人造甜味剂(糖精和阿斯巴甜)的啮齿类动物研究中,消耗量与醋酸和丙酸盐水平的增加有关,这表明无热量的人造甜味剂改变的肠道微生物群的能量收获能力增加。

在一项小规模的人体干预试验中,糖精摄入后葡萄糖稳态的破坏在一些参与者中很明显,但不是所有的参与者中都存在,这与他们接触糖精前和糖精诱导的菌群组成的改变有关(每天补充120mg糖精,6天,7人)

以上结果表明,无热量的人造甜味剂摄入对健康影响的相反结果源于参与者自身菌群的差异(通过鉴定菌群的敏感性特征)。由此,对于用无热量的人造甜味剂替代高热量甜味剂,我们可以区分哪些人可以从中获益,哪些人应该避免。

矿物质

​大量补铁或有菌群失调风险

众所周知,补充铁是预防和治疗贫血的常用方法,尤其是婴儿。然而,细菌尤其是一些病原体是高效的铁清除剂。因此,补充铁可能导致菌群失调和病原体大量繁殖

类似的,在饮食中补充锰会增加心脏的细菌定植,增加小鼠金黄色葡萄球菌感染的致死率,这可能是由于细菌利用锰来保护机体免受活性氧和中性粒细胞的杀灭。

以上所有都是讨论食物中的某种营养成分,但我们日常生活中,每天吃很多种类的食物,多种食物的组合互相协同,我们可以探讨下不同的饮食模式和肠道菌群之间的关系,以及对健康的影响。

饮食模式-菌群

地中海饮食法 

地中海饮食主要是植物性饮食。地中海饮食强调食用蔬菜、水果、蔬菜、坚果和橄榄油等“健康”脂肪。还有一个重点是利用香料和其他调味品来代替盐的使用。饮食的另一个重要组成部分是限制加工食品中的碳水化合物。

在一项小型研究中,与同样饮食的男性相比,女性在地中海饮食后的食欲和饥饿感下降幅度更大,这可能是由于该饮食中纤维含量增加所致。如果遵循正确的饮食习惯,这种饮食中的纤维含量高,动物源的脂肪含量低,加工食品中的碳水化合物含量低,盐含量低。

不同饮食特点的肠道菌群特征

狩猎-采集人群依赖于觅食,很少接触治疗剂,在普氏菌和其他纤维降解菌群中高度富集。相反,西方化社会中发现的饮食特征和卫生基础设施与拟杆菌的优势相关,同时伴随着微生物多样性的减少。

动物饮食 vs 植物饮食

基于动物的饮食对肠道微生物群的影响比基于植物的饮食更大。

菌群对饮食的反应相对于所有受试者的基线样品计算每个饮食组上的簇log2倍数变化,并绘制为圆圈。

基于动物的饮食中具有显着倍数变化的群集以红色着色,并且基于植物和动物的饮食具有显着倍数变化的群集以红色和绿色着色。

未着色的簇在基于动物或植物的饮食中没有表现出显着的倍数变化(q <0.05,双侧Wilcoxon符号秩检验)。

在动物饮食中具有三个最大的正和负折叠变化的群集中的菌群成员也被显示并通过门着色:厚壁菌门(紫色),拟杆菌(蓝色),变形菌门(绿色),Tenericutes(红色)和Verrucomicrobia(灰色)。括号中会计入多个具有相同名称的OTU。

动物饮食增加了耐胆汁微生物(腐烂别样杆菌、嗜胆菌属和拟杆菌)的数量,并降低代谢膳食植物多糖的厚壁菌门的水平(罗氏菌属Roseburia、直肠真杆菌和布氏瘤胃球菌)

该研究还显示:相对于植物性饮食和基线样本,动物性饮食显著降低了碳水化合物发酵产物的水平,提高了氨基酸发酵产物的浓度

饮食量作为微生物调节剂

摄取的食物量会影响肠道微生物群。

在人类中,短期碳水化合物限制(每天24-164克,持续4周)导致产生丁酸盐的细菌减少,因此产生丁酸盐70,以及限制卡路里的方案(10%的能量摄入减少10%周)导致微生物组组成的改变,包括Blautia coccoides的减少和拟杆菌属的增加。

进食频率对菌群的影响

尽管对进食频率和健康状况进行了大量研究,但最近才开始研究进食频率对胃肠道微生物组的影响。

马的盲肠微生物群受饲养频率的影响,饲养频率越高,YRC22属相对丰度越高普氏菌属、乳酸杆菌属、链球菌属、粪球菌属、和考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)相对丰度越低。

为了确定饮食模式的改变是否影响与人类葡萄糖反应、脂质代谢和肥胖相关的类群,还需要进行更多的研究。

与进食频率无关,某些菌群与改善的葡萄糖稳态,脂质和肥胖有关。例如,粘蛋白降解肠细菌A. muciniphila与改善的葡萄糖稳态有关,与动物模型中的炎症反向相关。

在人类中,Akkermansia的增加与空腹血糖、腰臀比和皮下脂肪细胞直径呈负相关。

除以上膳食成分、饮食模式、饮食量、进食频率等对菌群产生影响外,还有昼夜节律变化也会影响菌群波动。

时间-饮食-菌群

饮食对微生物组分和功能的时间效应可以在多个时间尺度上发生,范围从饮食诱导每日微生物组波动到注意到长期变化后数天内观察到的营养相关效应。

在最高分辨率下,宿主每天昼夜节律的睡眠-清醒和进食-禁食周期伴随着显著的组成和功能性肠道微生物群变化,在三个主要门,拟杆菌门,厚壁菌门和变形杆菌门的成员中,以及粪便和循环中的细菌代谢产物的水平上,都能观察到绝对丰度振荡。

一生中饮食都会影响肠道细菌的结构和功能

失调的昼夜节律和饮食对微生物群的影响

连续肠外营养的小鼠已被证明微生物群落结构发生了实质性变化,但微生物群并未完全丧失昼夜变化。但高脂肪饮食和昼夜节律紊乱的结合可能是导致小鼠微生物失调的原因。

有证据表明细菌含有时钟基因,并以昼夜节律的方式调节宿主的行为。例如,产气肠杆菌据称含有内源性生物钟基因,其通过分泌到胃肠道中的褪黑激素与人宿主同步。

在小鼠中,高脂肪饮食干预后出现的肝昼夜节律钟的重新编程被归因于微生物驱动的感应和转录因子PPARC的激活。

肝脏和肠道昼夜节律基因都受到未结合的胆汁酸(已知的微生物代谢产物)的影响。在无菌和抗生素诱导的小鼠模型中,微生物群的缺失已被证明会改变肠上皮细胞核受体的转录以及诸如Rev-erba、RORa、Bmal1、Cry1、Per1和Per2等时钟元件。

已发现在没有微生物的动物中,回肠和结肠上皮细胞内昼夜节律性被完全打乱了。研究人员推测,微生物相关的分子模式是以连续的方式从微生物群中释放出来的,相反,也有研究表明细菌组成的昼夜变化导致细菌代谢物浓度的相应变化,例如在禁食期间达到峰值的丁酸盐,以及在摄食期间达到峰值的硫化氢。已显示粪便丁酸盐在标准但不是高脂肪饮食的小鼠中循环,而硫化氢在高脂肪但非正常饮食的小鼠的盲肠中表现出周期性行为。先前已经在体外证明这些代谢物可以直接影响肝脏时钟基因Per2和Bmal1的循环。

总之,在昼夜节律破坏后观察到的负面后果可能与由肠屏障功能的改变,促炎细菌的丰度增加和昼夜节律紊乱相关疾病的病因引起的炎症过程有关。

饮食-菌群-健康互动的复杂性

大量营养素、微量营养素和食品添加剂与微生物群相互作用,改变特定属的丰度或微生物代谢产物环境,从而对宿主健康产生相当大的影响。在这个复杂的网络中,大多数食物成分和微生物是多面的,对宿主既有利又有害。

常见的膳食成分通过肠道微生物群代谢并产生调节宿主代谢(例如在动脉粥样硬化中)的代谢物【例如,膳食胆碱和三甲胺(TMA)】。同时,饮食改变了菌群组成并因此改变了微生物代谢产物,其中一些对宿主会产生有益或有害的影响【例如,脂肪,脂多糖(脂多糖)和内毒素血症)】。一些相互作用局限于肠道【例如,纤维,短链脂肪酸(SCFAs)和肠道糖异生】,而其他作用则有系统性效果【例如,脂肪,乙酸盐和抗胰岛素性(IR)】。

饮食模式可以通过营养物质对多种变量的影响影响影响代谢变化和炎症的发展,包括微生物组分、微生物产物的释放、胃肠道信号分子、以及神经递质。

由于细菌专门用于不同底物的发酵,复合饮食可以为特定的种系提供一系列促生长和生长抑制因子。

这些信号分子依次与免疫系统的调节有关,促进或抑制促炎细胞因子的产生和特异性白细胞亚群的扩大,如Th17和Treg细胞,它们与神经系统发育有关。

膳食代谢产物可通过不同的信号通路引起免疫应答

膳食代谢物来源于各种食物的消化

食物,如纤维、鱼和肉被消化,直接(例如,ω-3脂肪酸、烟酸)或间接产生代谢物【例如,短链脂肪酸(scfas)或吲哚-3-醛,分别通过细菌消化膳食纤维或色氨酸获得】

膳食代谢产物可以通过代谢传感GPCRs发出信号

这可以通过激活MAP激酶等途径的传统G蛋白信号传导,或通过β-抑制蛋白2来实现,一种与抗炎作用更密切相关的替代途径,包括抑制NF-κB功能或抑制炎症细胞因子的产生。

此外,在GPCR激活后,NLRP3炎症体激活响应Ca2+通量或K+射流。

某些代谢物作为组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂

例如短链脂肪酸,尤其是丁酸盐和丙酸盐。

SCFAs抑制HDAC可使组蛋白内赖氨酸残基乙酰化,从而通过染色质松弛促进基因转录。

最后,膳食代谢物可以作为转录共激活因子

例如,吲哚-3-醛与芳烃受体(AHR)结合,允许其与AHR核转位蛋白(ARNT)相互作用以促进基因转录,包括肠内稳态细胞因子IL-22.

膳食代谢物信号的作用以及对免疫、代谢和神经系统的影响

各种膳食代谢物的可用性取决于食物摄入量(数量和质量)以及宿主或肠道微生物群的新陈代谢。代谢产物分布到胃肠道,并以高浓度输送到门静脉。

这些代谢物可以引发广泛的生物学功能,主要是通过结合到它们的同源GPCRs。GPCR激活可诱导细胞形态和运动的改变,诱导Ca2+或K+流出,或诱导下游pi3k/map激酶途径。GPCRs也可以通过β-抑制蛋白来传递信号,β-抑制蛋白可以抑制NF-κB的激活和促炎细胞因子的产生。

随后,其同源GPCRs的饮食代谢物激活可影响细胞迁移、炎症体激活、上皮完整性、炎性细胞因子产生、Treg细胞生物学、肠-脑轴、组织修复、肿瘤抑制、饱腹感和代谢。

饮食和菌群相互作用影响胃肠功能和健康(从生态学、代谢学和免疫调节的角度)


Murtaza N, Gastroenterology Clinics, 2017

以上我们知道了饮食对塑造肠道菌群及健康的重要性

然而或许我们还有疑问:

肠道菌群对摄取食物的响应周期是多长时间?

肠道菌群的动态波动和稳定主要受什么因素影响?

下面看一篇权威的论文

该文章将每日宏基因组数据与日常饮食相结合,构建了响应饮食的肠道菌群变化模型来进行研究。

实验设计

某研究连续17天收集来自34名受试者的膳食摄入数据和粪便样本。使用自动化自我管理的24小时(ASA24)饮食评估工具收集每日食物记录

表1 按性别分类的主体特征


Johnson A J, et al. Cell host & microbe, 2019

值显示为平均值±标准偏差。使用Student’s t检验计算p值。

Johnson A J, et al. Cell host & microbe, 2019
(A) 在整个研究期间,一些受试者的菌群组成比其他受试者的变化更大
(B) 在按微生物群相似性排序的研究期间,按天计算的20个最可变的功能模块(变异系数最高)的相对丰度。

结果发现

  • 相似的食物对不同人的肠道菌群有不同的影响
  • 相比于常规营养素,肠道菌群与整体食物数据具有更为强烈的相关性
  • 每日微生物组的变化取决于至少两天的饮食历史
  • 肠道菌群稳定性与饮食多样化有关

同时我们也可以看出,以调节肠道菌群为目的的干预方案需要针对个体进行定制。

对上述所有饮食的比较揭示了一个中心主题:蔬菜、水果、瘦肉的消费量增加,加工食品的消费量减少,可带来积极的健康效益。大多数人选择食物的因素往往集中在食物的数量和容易获得和准备,而不是食物的内容和质量。由于优先考虑这些因素,食物首要为我们身体提供能源和保障健康越来越被我们忽视,取而代之的是快餐,高热量、低营养质量食品的大量进入我们生活,这直接导致了当下的许多慢病包括肥胖的流行。  

普遍饮食建议

  • 食用主要由新鲜蔬菜、水果和瘦肉蛋白质来源组成的饮食。 
  • 增加纤维有助于提高饱腹感和改善血糖参数。 
    -贫蛋白来源也会增加饱腹感。 
    -限制加工食品和外源性膳食糖的摄入量。 
    -控制食物大小和饮食量。 
    -避免从饮料中摄取热量。  

主要参考文献

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分享|破解菌群检测应用于多疾病临床辅助诊断应用的难题

越来越多小伙伴开始关注我们产品的同时也会对产品的准确性,检测使用的技术等产生强烈的好奇日常提问:

检测后能得到什么有用的信息?

这个结果的准确性如何?

通过检测能直接区分患者和健康人吗?

同个人过一段时间做菌群变化大吗?

取样时间不同影响大吗?

疾病之间会不会相互干扰?

……各种问题层出不穷今天就为大家详细解答

以下是分享原文。

非常高兴有机会在这里跟大家分享我们这几年在肠道菌群检测应用于临床和健康管理方面的尝试,以及我们的一些经验。

谷禾成立于 2012年,是最早从事肠道菌群健康事业的公司,技术骨干源自浙大。建立了完整的pcr分子实验室。

我们比较专注,一直在做肠道菌群检测,从整个样本量来说,我们更关注来自于临床的有病理的信息,以及临床辅助诊断的数据样本。所以我们在这方面积累了相当大一部分的数据集。

而且这些临床样本相对来说,对于我们后续将肠道菌群检测应用于临床辅助诊断当中有很大的帮助。

我们其实不只是检测一下肠道菌群的构成,以及哪些菌有异常,我们是希望将肠道菌群检测直接做成一个临床辅助诊断的产品。

不只是告诉你可能有哪些疾病风险,我们希望可以直接给出包括结直肠癌、胃癌、甚至肝癌、抑郁症、自闭症的临床辅助诊断提示

从这个角度上来说,可能跟目前已有的检测,包括这几天嘉宾分享的一些研究,可能就会有很大的不同。

你可以通过检测找到很多肠道菌群构成的显著性差异,比如自闭症患者跟健康人之间有相当大一部分的菌是存在丰度上的显著差异,但是:

能不能准确告知,哪个是自闭症患者,哪个是健康人,或者是他甚至有中间型的状态?

那么这个过程当中就需要解决几个问题。

第一个问题,首先是准确度

不仅仅是告诉你一个概率的问题,而且需要临床辅助诊断,那么就需要提高样品的处理本身,以及疾病诊断模型的准确度。

第二个是稳定性

大家都知道肠道菌群其实受的影响因素非常多,你的饮食方式、生活、地域、健康状态、甚至情绪状态都可能对菌群有巨大的影响。

这种巨大的影响的来源有这么多的情况,那么如何保证无论你什么时候检测,都能够是可靠稳定的?

假设一个结直肠癌患者,他今天做了,和隔了一个礼拜之后再去做,从病理的状态上来说,他还是个结直肠癌患者,但是他的菌群状态可能会产生巨大的变化。

那么这些变化本身是否会对我们的检测和临床结论产生巨大的影响,这种波动如何去消除,所以这个是个稳定性的问题。我等会也会讲到。

再一个是可解释性

因为菌群相对来说,实际算是一个大的数据。我们现在如果采用高通量测序的方式来做,一次性可以拿到大量的数据集。

这些数据集本身会有各种各样的菌的构成差异,我们的经验是差不多每个人,从婴幼儿开始到成年人,大概两岁以上的婴幼儿,菌群构成会从200到2000种菌不等,也就是说每个人会有这么大的菌的种类。

但是总的数据集有多大呢?我们自己有几万例的人群的样本,构建了一个人的肠道菌群的参考数据集,这个数据集里目前包括7500多种菌。但是我们自己的评估,全人类的肠道当中可能出现的定植菌应该会超过10万例。

那么这么大的数据量当中的异常菌如何去进行解释,如何给临床上提供更有意义的,病理上也好,或者机制上的一种解释,以及可以量化的干预方案,这就是可解释性。

最后一个是经济性

因为如果希望肠道菌群检测能够作为一个临床辅助诊断的项目,或者是针对具体的临床疾病的辅助诊断来说,它不仅仅要做到准确,它要具有足够大的经济性。

也就是说成本必须要得到控制,几千块钱的项目可能能做,但是它无法做到普及,也无法在临床当中被大量的应用,所以如何控制成本也是个巨大的一个问题。

我们做了很多的工作,尝试在上面提到的方向去努力实现在临床应用当中的可能,以下几方面我后面会逐一讲一下我们所做的工作。

第一是取样和储存运输,然后是如何大规模、低成本、高效准确的去处理样品。

再一个是参考数据库,完整的数据库的建立,其实也是非常重要的。

然后是大规模人群队列和临床数。我们的核心经验,由于肠道菌群的多样性,以及受各种因素的影响比较多,那么大规模的人群队列就变成一个非常重要的点。如何去构建大规模的临床队列,以及从这个大规模的临床队列当中,我们能不能拿到一些信息和有用的经验。

再有是全方位的解析,我们等会儿会讲到不只是在菌群层面上,也不只是在代谢层面上,我们甚至可以基于肠道菌群,把代谢营养,生理生化指标,免疫指标,我们都是来自于临床的,包括血常规,尿常规,我们都能够进行解析。

还有重要的一点是如何使用人工智能的高可用性的模型,从这么大的数据当中精细化的提高检出率的同时,又能够保证它的特异性和敏感度,这是个巨大的一个挑战,这个我后面也会讲到。

第一个方面,可能我们现在采用的这个取样方式,应该相对来说最简便和最小的一个取样方式,我们直接可以用棉签从厕纸上蘸取,直接洗脱在取样管当中。

你可以看到取样颜色达到左侧第二个管子的这种颜色的粪便量,我们就可以完成整个检测,从使用体验上来说,会比较简便,而且需要量少

样本保存也可以在室温下至少可以保存一个月,运输过程当中就不需要涉及到冷链,可以直接快递,便捷性也会大大提高。

有了这个取样管之后,实际上从临床和门诊当中可以快速的拿到大量的方便的样品,因为不需要采用非常复杂的取样和储存的方案。

我们讲第二个方面,刚才提到菌群的构成特点是很多样性的,而且跟很多因素包括取样时间有关,比如说早上取、晚上取,取的粪便的部位以及取样的量的多少,可能出来的菌群构成都会有一些区别。

如何再将这些区别和波动有效地控制,并且从中提取稳定准确的信息

这就涉及到一个我们能够从菌群数据当中能拿到一些什么结果,我主要从几个维度来讲。

——首先是菌群丰度和菌群结构

你首先可以知道每一种菌大概有多少的量,相对比例是多少。你还会知道菌群构成,也就是说都有些什么菌。

——然后是菌群结构

所谓菌群结构就是说,有一些菌它会共同出现。甚至你会发现你检测到了有几种菌,并不代表其他的菌可能就没有出现。我们的肠道菌群总共可能会有七万多种菌,每个人差不多200到2000种,但是在99%的人当中都出现的菌,可能不超过30几种。你的肠道当中有这种菌,但是很多人当中都没有这种菌,那么很多的信息是稀疏的。但是通过构建菌群结构之后,你会发现这两种菌,可能一个在你这里有,一个在另外一个人当中有,但是这两种菌它其实代表的意义和内涵是类似的。

——再一个方面,我们通过数据的模型的挖掘,可以拿到更高维的特征

这些特征反应的是生理的,比如说你的尿酸量,你的尿蛋白,你的血液当中的高密度脂肪酸,包括一些代谢的指标,这些指标的生理的特征和病理的特征,我们也可以通过菌群结构来进行提取。

那么从信息的维度上提升了之后,你可以看到数据的稳定性在不断提高

最底层数据菌种的丰度波动性是非常大的。前一天的饮食如果有改变,跟你日常的饮食习惯有一些稍微的改变,第二天的检测,菌群的构成丰度上,波动甚至会达到30%。这种菌群丰度的变化,就代表如果你单纯依据少量的几种菌的丰度变化去检测它的异常,或者是这个疾病的状态的话,稳定性是很差的。那么你就需要控制各种场景,各种条件,才能拿到一个稳定的结果。但是菌种丰度又代表了一个非常高的信息量。

那我们尝试的更多的是从第二个维度开始,就菌群的构成,菌群的结构以及高维的菌群特征这个角度,因为它的稳定性更好。我们通过不断的去加入各种各样的临床病例的数据的方式来提取这些菌群的附加信息。

这就涉及到第二个问题,我们要把这更多维度的信息量能够提出来的话,你就必须要有涉及到非常大规模的样本人群,包括疾病状态、年龄、社会生活区域、饮食方式等各种因素的情况。

那么大量样本的话,我前面提到我们在取样盒上的改进,对应的我们还提供了一个快速的提取方式。就是通过磁珠法,来完全全自动化的来配合我们的取样盒,来做到大规模,自动化的,低成本的快速提取。

因为一般来说像MoBio这一类的试剂盒它对于样本的起始量有一个比较高的要求,并不适用于我们前面那种非常低当量的一个量。

我们自己改进之后的方法,稳定性和可靠性也是相当高的,这样是极大地降低了我们的整个实验处理过程当中的成本,同时又能够有效地保证这个检测结果的可靠性。我们的方法已经有文章发表。

那么当有了大量的样本之后,第二个问题就是

需要你更精准,更精细化的去提取这些数据

提取这些数据的过程当中我们自己也做过比较。用公共数据库包括Greengene、RDP或者HMP这些数据参考集,我们大概也就只能最多到95%的数据是能比对上去的,到种属的鉴定甚至会更低一些。

我们自己大概用了24000例的来自全球各地的样本,包括我们自己大概测了将近有17000多例的我们早期测的样本,还有各种来源的,特征的,包括疾病状态的,包括我们纳入了从各种基因组数据库拿到的肠道疾病和人体病原物的这些菌的数据,总共汇总之后,我们有24000多人的样本。

最后,我们构建了一个全新的人体肠道的一个参考集,这个参考集大概有75000多种OTU的菌,然后我们做了大量的注释,超过99.5%的菌是都能够完成比对的,这就大大的提高了对于菌属和样品当中菌构成的分辨率。

我们目前总的样本量已经接近快20万了,估计今年应该会超过20万例。

多种相关疾病互相存在干扰

这个是遇到的另外一个问题。

当我们解析了这些菌之后,我们尝试去做不同的疾病状态下菌的构成丰度和这些菌的特征信息,我们去尝试做疾病的分类。

前期做的时候效果相对还是非常不错的,因为它的特征菌比较明显。但是实际上面对临床的时候会遇到第二个问题,临床当中没有一个人的样品是非常干净,他可能会有结直肠癌,但是同时又会有高血压,或者是有消化道的疾病。

这些样本在你做检测之前你其实不知道他的状态,在试验或者研究型论文当中,你可能做的队列一个是健康人,再加一个某种疾病的患者,那么这两类的样本做出来,统计差异是非常明显的。但是如何在临床样本当中做到非常精准地将这两类人区分,而且不受任何中间因素的干扰,比如说阴性干扰样本的这个影响,这是需要面临的问题。

图解

上面图的左侧,我们自己做了一个结直肠癌的模型。结直肠癌我们现在检测的准确度可以达到非常高了。

但是,最开始做的时候,其实我们做了一下测试,单纯的模型去做预测分析的时候,会有其他中间疾病的大量干扰。尤其是消化道出血的情况下,会对整个菌群状态有非常大的影响。

包括腺瘤的阶段,刚才几位也都提到肠癌,肠癌其实是一个菌群变化要早于癌症发生的过程。但是菌群变化和癌症的阶段是有一些特征性的影响的,那么腺瘤的阶段跟肠癌是有大量的菌群特征是重叠的。

我们前期由于收集来自于各个来源的病例样本,所以可以大量的去寻找哪一些疾病是和我们要检测的目标疾病存在干扰因素的,我们可以挑选出这些疾病作为一个控制集,那么可以大大的减少假阳性和干扰的因素

这也就是另外一个因素,就是我们在构建人群队列的时候,务必不能以一个相对干净的样本集去做。对于研究来说,它可能是很好的一个方式,你可以做前瞻性来寻找这是否可能以及效果。但是实际临床过程当中,你需要纳入大量的,可能影响你这个菌群,或者跟这个疾病有相互干扰和影响的相应的疾病来作为控制集,才能够提高它的可靠性和准确度。

图解

这个图是我们自己有完整的临床病例,我们跟大量的医院和研究所在合作,我们自己构建了大量的人群队列规模,全部都是住院病人,有明确的临床的诊断和所有的病例信息,这个样本规模差不多有4.7万例。

图的左侧是各种疾病的类型,我们也通过各种疾病和菌群的模型构建,分析了七大类系统,包括呼吸系统,泌尿系统,免疫系统,内分泌系统,神经系统和消化系统,还有循环系统,跟肠道菌群能够有相对可靠的临床应用和检测,用于临床疾病的辅助诊断的可能性的。

右边这里是一个疾病的构成,其中有很多病跟菌群的关系目前甚至都没有发表过论文,就是说并不知道肠道菌群跟它有关。我们实际通过大规模的临床样本的实际筛查和模型构建之后,发现有很多病,通过肠道菌群可以做到非常精准。

另外一个问题就是,我们对于一个病的预测也好,或者进行辅助诊断也好,基于肠道菌群

需要多大样本的量才能够做到足够的准确度

来看一个我们自己做的一个模型,是拿实际真实临床样本的数据来做的

图解

这个图实际上是拿二型糖尿病的患者的诊断来做的,可以看到不同的曲线丰度。

我们自己做了从50例、300例、1000例到3000例,这些都是病人的样本量,对照集的样本量一般会在两到三倍的量来进行构建模型。

从我们自己的这个模型数据来看,50例的样本,你可以有效地判断菌群到底能否对这个疾病进行一个相对较好的评估;那么如果是300例,你基本上可以拿到一个相对可用的模型,进行初步评估。

如果是要达到一个相对稳定的有临床应用价值的模型,我们认为差不多要1000例。因为你要纳入各种来自于不同临床疾病状态的样本,因为可能这个患者虽然有这个病,但是他同时还会有其他的疾病,包括不同的年龄和饮食习惯的这些背景因素要做控制,至少要1000例。

如果想要得到稳定可靠的检测结果,而且因为不是所有的病,菌群都是在其中起到绝对性的作用,有些是属于间接的,那么你希望菌群本身的检测,它需要有一个贡献度的上限,也就是说,菌群本身与这个疾病的参与度和关联性的上限。那么要达到这个上限,我们认为差不多要3000例的临床的阳性样本,就是病例患者的样本,可以达到上限的结果。

再下来,就是我们需要构建可靠的模型。

因为菌群是一个相对数据源,你的各种生活方式,疾病状态,营养健康的情况都会影响它。可能这个菌既在肠癌当中属于特征菌,同时也是一个炎症性疾病的特征菌,那么这些状态都会影响同一个菌的结果。

如何将这个菌的结果的变化反馈到去解释它到底是哪一个病的问题呢?

我们通过数据标准化和多维度的提升来构建一个判断的模型。

我们用人工智能和深度学习的方法,通过足够大的样本数据,来提取各种各样的菌群特征,并不直接用菌群自身的信息,而是用高维度自主学习的方式来提取这些菌群特征。

然后纳入各种各样数据,

比如有营养学的数据,有质谱的数据,

也有一些病理的数据,包括一些生理生化的数据,

都纳入之后,我们去解析它。

而且我们并不是用一个模型来做,我们现在是用三个模型来做。

我们第一轮是将所有的可能的干扰性疾病和有影响的疾病,全部作为一个病的类型,来进行模型的分析,筛出所有可能有问题的人

然后第二轮我们需要精准化的去提取,到底哪些病是明确就是单一这种疾病的。

第三个模型,就是我们要对目标疾病与其他干扰的疾病进行区分

通过多个模型之后,我们可以极大地提高菌群检测的稳定性,以及这个疾病当中的特异性程度。



图解

这个图是我们自己在做的一些疾病的检测结果。从目前来看,很多疾病的稳定性和效果都相当不错,这里每一个病至少都有将近500例病人的样本数据,来去做一个验证。每一个疾病的类型,我们差不多都有两到三个中心的检测结果数据去汇总。

通过多维度之后,我们就可以探寻不同的菌群变化背后,它可能真实驱动的因素。

我们还加入了营养的部分,这些营养其实我们是通过营养调查和一些质谱的数据,然后通过机器学习的方式来去把它解析出来。

我们也加入了像血常规,尿常规,生化,免疫组化,代谢组产物指标,肿瘤标志物,还有激素水平。我们将这些数据纳入之后,通过构建模型,可以将菌群的结果转换为这些生理生化相应的指标。也就是说,你如果只给我菌群的数据,我可以将这些生理生化的相应指标也能够给你体现出来。

甚至还有包括艾滋病的特征的,以及另外一些其它疾病,这里没有列出来,但是效果也是相当不错。

但是你可以看到,它的解释并不是指这个菌群直接的特征变化。我们通过菌群解析,像艾滋病,我们有免疫组化的数据解读了之后,我可以明确告诉你,CD4和CD8的比值会有特征性的差异。但它本身的菌群特征上并没有直接体现出这个东西,是通过生理生化指标的转换之后,我就可以告诉你,菌群特征的变化在具体哪些生理生化方面产生一些影响。

这个是我们现在提供给包括临床和健康检测的一些基本的内容。

可以提供菌群的总体状况,以及致病菌的情况,益生菌的情况。因为本身测的就是菌群,所以它直接就能提供这些最基本的一些信息。当然正常范围都是我们基于将近上万人的健康人群来做的正常范围的评估。

这个是除了来自文献之外,我们自己通过算法提取到的相关的菌,每一种菌在这个疾病内的相关性情况,以及它在正常人群的基本的正常范围是多少。然后我们通过检测这个是否异常,在临床当中给医生来做快速判断的一个内容和信息。

再有一个我们现在给一个疾病的辅助诊断,这些部分它可以相对有效的提供整个维度的不只是一个专科的信息,可以给到包括我们前面讲到七个系统的相关疾病的一个提示。

这些提示可以帮助我们来做一些专科性的疾病辅助诊断,能排除一些其他科室可能漏掉的一些疾病症状。另外包括消化道症状的解读,我们也会有一个菌群异常的评估提示。

包括营养的部分,我们也单独加入营养摄入水平,维生素摄入水平,氨基酸摄入水平

这个值目前来说我们是基于人群分布数据,就是说我们通过菌群来预测模型构建之后,评估出人群基础的水平,然后再基于人群的营养调查的水平,我们做拟合。现在来看,准确度还是相当的高。

那另外也包括微量元素,现在重金属的部分我们已经完成了,也很快会加入包括饮食特点、盐摄入、精制糖摄入对应的信息,还有短链脂肪酸的这些指标。

另外这里还有包括有心脑血管、神经系统的疾病的风险评估,包括过敏的一些问题。

过敏的话现在我们也在开展一个比较大的多中心的项目。关于过敏Broad Institute(博德研究所)去年还是今年有一篇文章,他们做的是一个大的欧洲的队列。

也就是通过菌群的数据,从刚出生开始持续采集,差不多到六岁,然后再去评估过敏以及过敏原。目前他那个数据我们做过测试,完全基于菌群的数据,对于过敏包括过敏体质的评估,我们差不多现在能到0.78左右。那如果你是做特异性的过敏原的检测的话,我们甚至也能够进行过敏源的评估,完全基于菌群数据。

所以我们自己的大量的数据检测完了之后,会发现,通过菌群数据本身,不止是能够告诉你菌群的结果,甚至能够反映非常非常多原来你意想不到的,需要用其他手段来进行检测的结果。

另外,我们现在的检测全部是基于16S,16S大家知道它本身的精细度可能还是有缺陷,就是它并不能到菌株;另外它只测细菌的部分,你的病毒和真菌是没有的。

但是我们这里可以看到有一项检测是病毒性腹泻,就是说我测的是肠道菌群,但是我们能够发现,这个病毒的感染,也会对整个肠道菌群产生一个巨大的影响。

所以我们通过整个菌群结构的特征变化,能够只检测细菌,也仍然能够发现病毒性的这种变化。

最后我说一下挑战。

第一个挑战,到目前为止我们做了这么多的数据和这么多样本量之后,竟然发现要真正去完整的解析整个菌群的特征,我们需要更大规模和全面多维度的数据集。不只是菌群检测本身的或者疾病的信息,我们需要纳入比如代谢组,以及其他的一些数据的情况,来构建更完整的数据集。

第二,我们发现不同的疾病,它的诊疗需求和特点是不一样的。虽然信息很多,但如何去跟临床辅助诊疗特定的疾病去做对接和结合是很重要的一点。

第三,我们现在的肠道菌群干预的手段其实也蛮多的,但是这些干预手段呢,现在缺乏量化,就是如何去评估每个人的干预手段,包括饮食的习惯,益生菌的菌株的水平的评估,益生元的效应,甚至粪菌移植的配体。这些量化的方面需要有大量的工作去做。

以上是我们这么多年做的实际临床大量样本的菌群检测的一些经验,跟大家分享一下,谢谢。

检测定位及结果适用范围

尊敬的肠道菌群检测者:
    谷禾健康专注于提供高水准的肠道菌群基因检测和基于此的健康评估咨询,肠道菌群对人体健康的影响和关联性已被广泛研究和认可,多年来谷禾已累积数十万肠道菌群样本数据,但基于对健康的慎重和法规,谷禾重申其提供的肠道菌群基因检测目前不用于临床疾病诊断,仅作为菌群状况构成检测和健康评估以及基于菌群的科研。

分析报告中疾病风险和健康相关评估来自于公开研究数据和谷禾构建的大人群队列数据分析的预测评估结果,涉及临床诊断和医疗建议请遵照临床诊断和医生的医嘱。由于技术进步和样本数据不断积累,报告中可能存在尚未完全涵盖的因素或状况,不可避免的存在一定概率部分风险未被完全检出的情况。

杭州谷禾信息技术有限公司

2019年8月6日

深度解读 | 肠道菌群和中枢神经系统的关系

原创:  谷禾健康

说话晚、读书读不进、每天不开心不全是我们的错,还可能是肠道菌群有问题。肠道菌群不仅影响消化吸收,还影响神经系统。近年来,科学家们研究发现,肠道细菌可能在神经发育,焦虑和抑郁症的诱发过程中,甚至很多中枢神经系统疾病中,都起着重要的作用。

肠道菌群究竟是什么

首先,我们了解下肠道菌群。
肠道菌群包含居住在胃肠道中的大约100万亿微生物的集体基因组,我们肠道细菌的基因库包含比人类基因组多150倍的独特基因。
在人体定植的许多微生物群落中,肠道菌群正在成为影响宿主健康状况的主要参与者。肠道菌群的组成是在宿主发育早期建立的,并且可以在一生中经历无数的变化。越来越多的证据表明,肠道微生物组与中枢神经系统(CNS)相通。


Ghaisas et al. Pharmacology & therapeutics, 2016

肠道菌群和我们的发育同步
是伴随和影响我们一生的伙伴

  从怀孕时期就影响我们的神经发育

神经发育过程

经研究发现,神经发育的主要过程与母体和新生儿肠道微生物的变化一致


Sharon et al. Cell, 2016


肠-脑轴参与婴儿早期神经发育与感受 

Cong et al., Advances in neonatal care: official journal of the National Association of Neonatal Nurses,2015

接下来我们看看胃肠道是怎么构成的

胃肠道的构成

胃肠道(GI)长5米,上皮表面积约32平方米。它是身体70-80%免疫细胞的家园,超过1亿个神经元,以及多达100,000个外在神经末梢。

微生物组包含多达40万亿个细胞和至少数百种不同的物种。胃肠道的一个重要功能是感知和响应外部线索。

胃肠道由不同的横截面隔室组成。外在的,交感神经和副交感神经纤维通过肠系膜进入胃肠道并且可以延伸遍及肠组织的所有层。各种免疫细胞驻留在肌层,但在固有层中也非常丰富,特别是在Peyer氏斑块和淋巴滤泡中。

这些免疫细胞也与神经元和神经胶质细胞紧密相连。这里显示的上皮由5种不同的细胞类型组成,包括吸收肠上皮细胞,肠内分泌细胞,杯状细胞,潘氏细胞,微细胞。

胃肠道(GI)对于营养物质的吸收,粘膜和全身免疫反应的诱导以及健康的肠道微生物群的维持是必不可少的。

你会发现不只是消化的细胞

还有大量的神经元和免疫细胞

以及海量的肠道菌群

为什么有句话说

“肠胃不好顺带着心情和脑子也不好了”?

肠道又是如何联系到大脑

从而影响神经系统的呢?

经过大量的研究,我们逐步揭开了肠道菌群与大脑之间的联系。

肠-脑轴

人体肠道微生物组以多种方式影响人类大脑健康:

(1)结构性细菌成分如脂多糖为先天免疫系统提供低级强直性刺激。由细菌生态失调,小肠细菌过度生长或肠渗透性增加引起的过度刺激可能产生全身和/或中枢神经系统炎症。

(2)细菌蛋白质可能与人类抗原交叉反应,刺激适应性免疫系统的功能失调反应。

(3)细菌酶可产生神经毒性代谢物,如D-乳酸和氨,甚至有益的代谢物如短链脂肪酸也可能发挥神经毒性。

(4)肠道微生物可以与人类产生相同的激素和神经递质。这些激素的细菌受体影响微生物的生长和毒力。

(5)肠道细菌直接刺激肠神经系统的传入神经元,通过迷走神经向大脑发送信号。通过这些不同的机制,肠道微生物塑造了睡眠和下丘脑 – 垂体 – 肾上腺轴的应激反应的结构。它们影响记忆,情绪和认知,并且在临床和治疗上与一系列疾病相关,包括酗酒,慢性疲劳综合症,纤维肌痛和不安腿综合征。


Wang and Kasper.  Brain, behavior, and immunity, 2014

在健康和疾病的背景下,多个途径引导微生物组 – 肠 – 脑轴的向下和向上方向。

(A)向下,CNS通过影响营养的可用性饱食信号肽,影响肠功能和神经通路的内分泌物来控制肠道微生物组成。

皮质醇的HPA轴释放调节肠道运动和完整性。

免疫途径(细胞,细胞因子和sIgAs)可以开启,用以响应肠道功能的改变。内分泌和神经通路还可以调节来自特化肠上皮细胞的分泌,包括潘氏细胞,肠内分泌细胞和杯状细胞。它们的分泌产物影响菌群的存活和居住环境。

(B)向上,肠道微生物组通过神经(通过微生物组直接激活神经元),内分泌(例如5-羟色胺的肠内分泌细胞释放),代谢(神经活性分子的菌群合成)和免疫(CNS浸润免疫细胞和全身炎症)途径来控制CNS活动。

菌群在健康状态(神经发育)和疾病(一系列神经免疫和神经精神疾病)状态影响CNS。肠腔菌群,其产物由APC取样,附着上皮的SFB(肠内节丝状菌)介导外周免疫培养。

肠道微生物组成,菌群内的特定菌株,益生菌处理,菌群衍生产物和其他因素构成微生物组研究的范围。

由肠道微生物及其产物

直接或间接驱动的基本发育过程


Sharon et al. Cell, 2016
(A)肠道微生物通过各种直接和间接机制将信息传递给大脑。
(B)基因神经发育过程因GF动物的定植或因抗生素消耗肠道细菌而调节。具体而言,以下过程是调节:血脑屏障形成和完整性,神经发生,小胶质细胞成熟和分化,髓鞘形成,和神经营养因子,神经递质,及其各自的受体的表达。

细分来看,肠神经系统(ENS)就是肠道的大脑,同时还是联系着肠道外部(微生物群,代谢物和营养物)和内部(免疫细胞和基质细胞)微环境。

肠神经系统

胃肠生理学的关键方面由肠神经系统(ENS)控制。ENS由神经元和神经胶质细胞组成。

肠神经元位于粘膜下或肌间神经丛中。两个丛都位于两个肌肉层之间。副交感神经纤维释放乙酰胆碱,交感神经释放去甲肾上腺素。这些外在神经纤维可以支配肠神经元,但也与平滑肌,固有层和上皮细胞相关。肠神经元可以相互支配或延伸到固有层,特定的肠道真菌(IFAN)可以突触到交感神经节。

肠神经胶质细胞产生和释放神经营养因子,与肠神经元结合,并延伸到整个粘膜。左列和中间列用颜色编码,分别代表产生特定条件的细胞和分子以及从这些特定条件产生的结果。

肠神经元与胶质细胞的连接


Yoo and Mazmanian. Immunity, 2017

此外肠道菌群还通过释放不同物质和干预免疫系统最终影响血脑屏障和中枢神经系统(CNS)产生联系。

肠道用于收集营养和能量,防止有害的毒素和病原体,并清除废物,它是一个高度动态的环境,受到蠕动活动的周期性波动的影响。这些功能主要受两个肠神经系统(ENS)和驻留在肠道内的亿万共生细菌调节和控制。斑马鱼研究实验表明ENS调节肠道微生物群落成员身份以维持肠道健康。通过施用代表性抗炎细菌菌株或恢复ENS功能来预防ENS突变体中的炎症。

肠-脑之间通讯途径

肠道微生物群与大脑之间可能存在五种通信途径,包括肠道神经网络,神经内分泌 – HPA轴,肠道免疫系统,肠道菌群合成的一些神经递质和神经调节因子,以及包括肠粘膜屏障和血脑屏障在内的屏障。在这个通信网络中,大脑影响肠道运动,感知和分泌功能,来自肠道的内脏信号也影响大脑功能。

肠道微生物群与脑之间可能存在的五种通讯途径


Wang H X, Wang Y P,Chinese medical journal, 2016

神经递质和代谢产物

很多肠道菌群能代谢产生大量神经递质及其类似物,此外肠道菌群的部分代谢物质也会通过免疫系统影响神经系统。


Cryan & Dinan, Nature reviews neuroscience
, 2012

连接菌群和大脑的

还离不开一个重要通道

——血脑屏障

血脑屏障越来越多的证据表明,菌群与中枢神经系统(CNS)相互作用,并可以调节其许多功能。这种相互作用的一种机制是在血脑屏障(BBB)的水平上。细菌可以直接将因子释放到体循环中或可以转移到血液中。一旦进入血液,微生物组及其因子可以改变外周免疫细胞,促进与BBB的相互作用,并最终与神经血管单元的其他元素相互作用。在菌群影响下从外围部位释放的细菌及其因子或细胞因子和其他免疫活性物质可穿过BBB,改变BBB完整性,改变BBB转运率,或诱导屏障细胞释放神经免疫物质。由菌群代谢产物,例如短链脂肪酸,可穿过BBB以影响脑功能。通过这些和其他机制,微生物组-BBB相互作用可以影响疾病的进程。


Logsdon et al, Experimental Biology and Medicine, 2018
图中1层
菌群与全身免疫细胞相通,可影响血脑屏障(BBB)和CNS功能。肠腔不断暴露于来自外部环境的细菌。肠上皮屏障的破坏可允许肠道菌群不受调节的移动进入固有层。


图中2层
细菌可以渗透GALT(肠道相关的淋巴组织)和血腔,它们与各种免疫细胞相互作用,包括T细胞。


图中3层
某些细菌可以刺激效应型T细胞分化。调节性T细胞测量在GALT,血液和脑脊液中局部菌群的变化可促进T细胞脑浸润。


图中4层
循环细菌可以上调炎性细胞因子水平,影响BBB完整性并促进神经炎症。LPS(脂多糖)由细菌因子产生,并且可以作用于内皮TLR(Toll样受体)以促进神经炎症和CNS疾病。


图中5层
细菌代谢物可以上调紧密连接蛋白并改善BBB完整性。


图中6层
代谢物也可穿过BBB以影响神经胶质细胞和神经炎症。微生物组对周细胞的作用仍不清楚。

那么肠道菌群如果发生变化,

会带来哪些神经系统疾病和问题呢?

神经系统疾病的相关菌

目前已经发现一些与神经系统疾病(包括多发性硬化症,自闭症,帕金森病等)研究相关的菌。研究发现,这些疾病患者的某些菌群的数量明显发生变化,具体如下表:


Marietta et al., Neurotherapeutics, 2018

菌群干预或异常会导致的问题

目前有越来越多的证据表明,肠道微生物群在指导和促进大脑发育过程中发挥着重要作用,对健康具有长期的影响。

菌群和菌群产物的扰动

会影响小鼠模型和人类的行为结果

产前效果

产后效果


Sharon et al. Cell, 2016
注:GF – 无菌;      Abx :抗生素;      SPF – 无特定病原体; 
VTA :腹侧被盖区;                PVN – 下丘脑室旁核
SCFA :短链脂肪酸;              ANS :自主神经系统; 
NR2B :N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基2B; 

菌群如何影响中枢神经系统疾病

免疫介导的CNS疾病

多发性硬化症

多发性硬化症(MS)是由针对中枢神经组织的自身反应性免疫攻击介导的慢性CNS脱髓鞘疾病。这是通过研究患者和使用称为实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的MS动物模型来实现的。

如在一系列研究中观察到的,用单一细菌或细菌混合物口服治疗可调节EAE。益生菌动物双歧杆菌减少了大鼠EAE模型中症状的持续时间。

乳酸杆菌(包括LcS),单独施用或与其他双歧杆菌属菌株组合施用,倾向于通过相互调节促炎细胞因子和抗炎细胞因子反应来缓解小鼠EAE症状。

脆弱拟杆菌和乳酸片球菌(菌株R037)的益生菌治疗也显着降低了小鼠对EAE的易感性。

视神经脊髓炎

视神经脊髓炎(NMO),是一种CNS自身免疫疾病,其特征在于视神经和脊髓的免疫介导的脱髓鞘。

研究发现水通道蛋白血清阳性的NMO和NMO谱系疾病患者血清对胃肠道的抗原(最常见的饮食蛋白)抗体水平高于健康对照组,暗示NMO患者微生物群组成和免疫状态的改变。

格林 – 巴利综合征

格林 – 巴利综合征(GBS)是一种周围神经系统的自身免疫性疾病。

空肠弯曲杆菌在家禽中发现的肠道共生物种是由食物污染引起的人类肠炎的主要原因。研究表明弯曲杆菌肠炎患者的GBS风险高。

此外,弯曲杆菌与几种GBS的病理形式有关。不同的弯曲杆菌菌株以及宿主因子在GBS发育过程中形成自身反应性免疫反应中起重要作用。

因此,空肠弯曲杆菌代表了一种介导神经自身免疫的肠道相关病原体。

其他免疫介导的疾病

脑膜炎是CNS保护膜的炎症。病毒或细菌感染可能导致脑膜炎。据报道,成年肠道共生大肠杆菌 K1能够通过母体转移给新生儿引起脑膜炎。

慢性疲劳综合征(CFS),也称为肌痛性脑脊髓炎(ME),目前尚不清楚病因。据推测,共生细菌的转运升高可能是某些CFS患者疾病活动的原因。

非免疫介导的CNS疾病

自闭症

自闭症谱系障碍(ASD)是一系列发育性神经行为障碍,其特征是社交互动和沟通受损。新出现的数据表明肠道微生物组与ASD之间存在联系,可能是直接因果关系,也可能是间接的非典型摄食和营养模式的结果。

肠道微生物群的破坏可能促进产生神经毒素的细菌的过度定殖,从而导致自闭症症状。据报道,在自闭症儿童的粪便样本中存在的梭菌属下的物种数量更多,Bacteroidetes和Firmicutes门的不平衡也表现在自闭症儿童身上。

此外,其他肠道共生物的水平改变,包括双歧杆菌,乳酸杆菌,Sutterella,普氏菌和Ruminococcus属以及Alcaligenaceae家族,与自闭症相关。

肠道微生物组介导的新陈代谢也会影响自闭症。

抑郁症

抑郁症是由神经精神障碍或免疫失调导致的情绪障碍的主要形式。益生菌治疗已经显示出抑制动物抑郁症模型的功效。乳杆菌属下的物种特别表征为抗抑郁剂,包含鼠李糖乳杆菌和瑞士乳杆菌菌株的益生菌混合物通过使皮质酮水平正常化来改善母体分离诱导的抑郁。

类似地,鼠李糖乳杆菌菌株JB-1通过以迷走神经依赖性方式调节皮质酮和GABA受体来减少抑郁相关行为。

双歧杆菌的种类也是有效的抗抑郁药。

如大鼠强迫游泳试验(FST)和母体分离模型所示,Bifidobacterium infantis减轻了抑郁症。涉及的机制包括促炎细胞因子的减弱,色氨酸代谢的调节和CNS神经递质。

此外,含有高水平多不饱和脂肪酸(PUFA)n-3的饮食配方通过与瑞士乳杆菌和长双歧杆菌相似的机制减弱大鼠MI后抑郁症。

焦虑和压力

焦虑和压力是具有神经,内分泌和免疫学基础的情绪障碍的常见形式。暴露于诸如化学,生物或环境刺激的压力因素可引发压力和焦虑反应,其涉及激活HPA轴(下丘脑-垂体-肾上腺轴)。如前所述,焦虑和压力的共病已经在剧烈和轻微的肠功能障碍类型中被感知,强调了肠 – 脑信号如神经递质和免疫因子的作用。

与具有正常肠道微生物群的SPF小鼠相比,GF小鼠显示出增加的运动活性和减少的焦虑。这种行为表型与GF小鼠的CNS中更高水平的神经递质和降低的突触长期增强相关。

后来的研究证实了GF条件下焦虑样行为的减少,这可以通过其他神经化学变化来解释,例如神经递质受体减少和色氨酸代谢增加。因此推测肠道微生物组调节HPA轴的设定点。

有益的益生菌可以改善焦虑。乳杆菌属和双歧杆菌属的特定种类具有抗焦虑作用。用长双歧杆菌,婴儿双歧杆菌,瑞氏乳杆菌或鼠李糖乳杆菌的某些菌株进行益生菌处理单独或联合使用,在动物焦虑模型中归一化行为表型。

Lactobacillus farciminis还抑制了应激诱导的肠道泄漏并减弱了HPA轴应激反应。

由瑞士乳杆菌和长双歧杆菌组成的益生菌制剂显示出在大鼠中的抗焦虑样活性和对健康人受试者的有益心理作用。

通过益生菌调节微生物组可以减轻由对刺激的外周神经反应和对CNS的信号转导引起的伤害性疼痛。在乳杆菌属的种中可见抗伤害感受作用。

罗伊氏乳杆菌还减轻正常大鼠CRD诱导的内脏疼痛。

L. paracasei使抗生素扰动小鼠的CRD内脏超敏反应正常化。

嗜酸乳杆菌通过诱导阿片样物质和大麻素受体在肠道疼痛中产生镇痛作用。

此外,两项研究支持IBS背景下特定婴儿双歧杆菌菌株的抗伤害感受作用。

其他神经精神症状

微生物组与其他神经精神疾病有关,其中经常发生基于免疫和非免疫的病因的混合物。GF动物表现出缺陷的记忆和认知能力。用小鼠菌群重新定殖GF小鼠可以增强或减少探索行为。海马脑源性神经营养因子水平与探索行为正相关。

益生菌能够改善感染引起的记忆功能障碍和糖尿病引起的认知缺陷。肠道微生物组的膳食改变也调节了小鼠的认知和学习行为。

总而言之,肠道菌群的研究对于CNS疾病相关的诊断,预后和治疗都有很大的意义。

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  • 含样品保存液/裂解液的样品
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粪便大小适中(黄豆大小),样品管中含有大量保存液/裂解液。

例,颗粒状粪便取样量视大小而定,如小鼠粪便2粒、大鼠粪便1~2粒;

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  • 问题样品

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样品管内液体无明显颜色变化,且无固体存在——视为不合格样品

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