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研究速递|微生物群衍生的肽模拟物可导致致命的炎性心肌病

近日, 国际顶级方法学期刊《Science》发表了一篇由瑞士免疫生物研究所的研究成成果:Microbiota-derived peptide mimics drive lethal inflammatory cardiomyopathy(微生物群衍生的肽模拟物可导致致命的炎性心肌病),此项研究表明针对遗传易感性心肌炎患者或通过抗生素进行检查点抑制剂治疗的易感患者的微生物群可能会减轻疾病的严重程度,这可能有助于预防可能致命的炎症性心肌病后遗症。

摘要

心肌炎可通过肌球蛋白重链6特异性 T 辅助细胞 (TH)1 和 TH17 细胞的慢性刺激发展为炎症性心肌病。然而,控制心脏特异性 T 细胞心脏毒性编程的机制仍然难以捉摸。

研究人员使用自发性自身免疫性心肌炎的小鼠模型,表明心肌炎向致死性心脏病的进展依赖于由共生拟杆菌肽模拟物在肠道中留下印记的心肌肌球蛋白特异性 TH17 细胞。通过抗生素治疗成功地预防了小鼠的致死性疾病,以及在人心肌炎患者中观察到的拟杆菌特异性 CD4+T 细胞和B细胞反应显著升高,都表明来自共生细菌的模拟肽可以促进遗传易感性个体的炎症性心肌病。通过操纵微生物群抑制心脏毒性 T 细胞的能力,从而将炎症性心肌病转变为可靶向的疾病。

背景

心肌炎期间的急性免疫激活与针对肌球蛋白重链 6 (MYH6) 的自身免疫反应的产生有关。随后的MYH6 特异性辅助性 T 细胞 (TH)1 和 TH17 细胞的慢性刺激诱发炎症性心肌病。

自身免疫性和慢性炎症性疾病的进行性是由遗传易感性和独特的环境条件决定的。炎症性心肌病的易感性可与 HLA-DQB1* 多态性有关,而病原体感染使患者易患主要组织相容性复合体(MHC)II类限制性T细胞,这是由于心肌细胞的死亡和自身抗原的过度呈递导致的。

另外,微生物成分的抗原模拟也可能导致这些疾病。为了评估心脏特异性T细胞是否与微生物组成发生交叉反应,研究人员使用了在其 CD4+T 细胞(TCRM)的 95% 以上的表达 MYH6-特异性T细胞受体的转基因小鼠。

主要结果

1、自身免疫性心肌炎向扩张型心肌病的微生物依赖性转变。微生物群的存在促进了心脏特异性CD4+T 细胞中 TH17 表型的印记,并有利于髓样细胞在 TCRM 小鼠心肌中的积累。

图A. TCRM 小鼠在 SPF(无特定病原体动物)或 GF 条件下的存活率。所有 TCRM 小鼠都发生了自发性自身免疫性心肌炎,约 50% 的小鼠在 SPF 条件下发展为致命性心肌病,但是缺少共生菌群的 GF 条件下小鼠则会发展为致命性心肌病的结果。

图B. 12 周龄的 SPF 条件和 GF 条件下的 TCRM 小鼠的心脏大体病理。标尺(4mm)

图C. 12 周龄 TCRM 小鼠在 SPF 条件和 GF 条件下的心脏组织学分析。使用 HE 和 EVG 染色。标尺(100mm)

图D. SPF 和 GF 条件下 4 周龄和 12 周龄 TCRM 小鼠的组织病理学疾病严重程度。圆点表示单个小鼠的值,线条表示中间值。ns 表示无显著统计学意义。

图E-G. 在单个小鼠中测定的 SPF 和 GF 条件下 TCRM 小鼠和转基因阴性对照组 (Tg-) 的超声心动图参数,射血分数 (图E),缩短分数 (图F) 和收缩左心室内径 (图G ,LVID sys)。尽管有低水平的心脏炎症,但 GF TCRM 小鼠的心脏功能正常。

图H-Q. 从 4 周 (CoH 4 wk) 或 8 周 (CoH 8 wk) 开始, GF 条件下 TCRM 小鼠被转移到 SPF条件下,并与 SPF 条件下 TCRM 小鼠同住,直到分析。作为比较,使用 GF 或 SPF 条件下的TCRM小鼠。(图H)前瞻性生存分析,箭头指示转移到SPF条件的年龄。(图I)组织病理学疾病进展。心脏浸润细胞计数:CD45+ 细胞(图J),肌球蛋白特异性 CD4+T 细胞 (图K),白细胞介素-17-(图L),IFN-g- 产生心脏浸润 MYH6 特异性 CD4+T 细胞 (图M)。转移后 GF TCRM 小鼠显著加剧心脏炎症。

图N-Q. 用流式细胞术分析心脏浸润髓细胞亚群。(图N)SPF 条件下 TCRM 小鼠心脏中CD11b+ ly6g 细胞的典型t-分布随机相邻嵌入 (t-SNE) 图;(图O)炎症性单核细胞;(图P)MHCII 巨噬细胞;(图Q)CD11b-CCR2- 驻留在心脏的巨噬细胞。共生菌群的存在增加了TH1和TH17 心脏特异性 CD4+ T 细胞的比例,并促进了炎症性骨髓细胞在心脏组织中的积累。

2、MYH6特异性CD4+T细胞与肠道微生物群的相互作用。心脏特异性的CD4+T细胞可以塑造结肠微生物群落,并且不同的细菌群落(在本例中为拟杆菌)提供了可以激活MYH6特异性CD4+T细胞的模拟肽。

图A. 流式细胞术分析来自 SPF 或 GF 条件下 TCRM 小鼠的心蛋白过滤 MYH6 特异性细胞中的整合素 α4β7 和 CCR6。心脏浸润的 CD4+TCRM 细胞在 SPF 条件下的肠归巢受体表达明显高于GF条件。

图B,C. 荧光染料 CFSE 标记的 TCRM 细胞过继转移到 Rag1–/–小鼠后的定位和增殖。(图B)在过继移植后第 3 天对结肠补片进行共聚焦显微镜分析,比例尺(100mm),DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)。(图C)MYH6 特异性细胞的增殖。用流式细胞术对指定的器官和指定时间点的荧光染料 CFSE 稀释进行定量。条形表示平均值。nd(不可检测);LN(淋巴结);LP(固有层);MedLN(纵隔淋巴结)

图D,E. 通过 16SrRNA 测序,转基因阴性对照组 (Tg-)、SPF TCRM 和 GF TCRM 小鼠在 SPF条件下 4 周龄时的粪便细菌组成。(图D)主成分分析。(图E)指示的细菌纲和科的相对丰度下的热图。提示 GF TCRM 小鼠获得了 SPF TCRM 小鼠的微生物群落。

图F-H. MYH6 特异性 CD4+T 细胞交叉反应性。(图F)用 MYH6、拟杆菌的 b-gal 肽或阴沟肠杆菌的半胱氨酸水解酶衍生肽进行再刺激后,通过 CFSE- 稀释法测定 TCRM 小鼠的 CD4+ T细胞体外增殖。

图G,H. SPF TCRM 小鼠经 MYH6 或拟杆菌的 b-gal 肽体外再刺激后,心脏和结肠浸润,表达 Vb8 的 CD4+T 细胞产生细胞因子。

图I-L. GF TCRM 小鼠被 B.theta 野生型 (B.theta WT) 或缺失 β-半乳糖苷酶 BT1626 基因(B.theta DB-gal) 的 B.theta 所克隆。对心脏浸润细胞(图I)和对心脏和结肠中 MYH6 特异性细胞因子产生细胞(图J)的流式细胞术分析。带有 B.theta β-gal 的 TCRM 小鼠的重新定殖减少了心肌中免疫细胞的积累,并显著降低了心脏和结肠中肌球蛋白特异性 TH17 细胞的活性。

图K,L. 通过细菌流式细胞术 (K) 和来自单个小鼠的汇集数据来确定 IgA 结合的粪便细菌。SSC,侧边散射;PE,藻红蛋白。在 B.theta β-gal 中缺乏交叉反应表位导致单克隆 TCRM 小鼠的 IgA 反应显著降低。

3、TCRM模型中抗生素治疗对致死性心脏病和免疫反应性的影响。心脏特异性CD4+T细胞与肠道中的微生物成分特异性地相互作用,从而影响系统的免疫反应性。

图A,B. 断奶后小鼠用广谱抗生素组合[磺胺多辛,甲氧苄啶和甲硝唑 (S+T+M) ] 治疗后,TCRM 小鼠的存活率 (A) 和疾病严重性 (B)。在 20 周龄的小鼠中测定疾病的严重程度。圆点表示单个小鼠的值,对应纵轴刻度表示平均疾病严重程度。

图C. 通过定量聚合酶链反应定量粪便中的 B.theta,广谱抗生素不仅降低了粪便样本中的B.theta 水平,而且在过继转移后第 28 天显着改善了心脏病(图D)

图E,F. 接受各种抗生素治疗的 RAG1- /-受体心脏中 CD45+ 免疫细胞 (图E) 和表达 Vb8 的CD4+T 细胞 (图F) 的积累显着减少。

图G. 心脏浸润性MYH6特异性 Vb8+CD4+T 细胞的细胞因子产生。

图H. 用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 测定抗 B.theta,B.distasonis,B.vulgatus 和 E.cloacae 的特异性 IgG 反应的热图。抗生素治疗降低了 B.theta 特异性 IgG 抗体水平,但该治疗对针对B.distasonis,B.vulgatus 或 E.cloacae 的 IgG 抗体反应有不同的影响。

4、人类心肌炎患者对拟杆菌和心肌肌球蛋白抗原的免疫反应性。人类的炎症性心肌病至少部分是通过源自肠道微生物群的细菌肽模拟物激活心脏特异性 Th 细胞来驱动的。

图A. AMITIS 队列患者入院时及诊断后不同时间点血清中 B.theta 特异性 IgG 抗体与健康人血清的比较分析。红框和黑框分别表示抗 B.theta 抗体水平高或低的患者。圆点代表个体抗体水平,线条代表平均值, A=吸光度。与健康对照组相比,这些患者显示出明显升高的 B.theta 特异性 IgG 反应。

图B. AMITIS 队列患者在指定时间点的射血分数 (EF%) 和 C-反应蛋白(CRP) 值 (图C)。心肌炎患者的临床改善伴随着抗 B.theta 血清反应性的降低。

图D. 来自 AMITIS 队列的心肌炎患者在初次就诊时具有针对 B. theta 的或低或高 IgG 抗体的综合临床评分,如图A 所示。圆点表示抗-β1-AR 抗体阳性总和的个体临床评分,CRP值≥16和EF≤40,而线条代表中位数临床评分。

图E. AMITIS 队列和健康对照中针对 B.theta,B.distasonis,B.vulgatus 和 E.cloacae 的特异性 IgG 反应的热图。在心肌炎患者和健康对照组之间,IgG 抗体对其他拟杆菌种类的反应性没有差异。

图F. 入院时来自 Micro-DCM 队列患者的血清 B.theta 特异性 IgG 水平。

图G. 抗菌 IgG 反应性的热图。与健康对照组相比,抗 B.theta IgG 抗体明显升高。

图H. 热图代表了计算机预测的 MYH6614-629 肽或 B. theta b-gal11-25 肽与流行的 HLA-DQ 等位基因的结合。

图I. 用人 MYH6614-629 肽或 B. theta b-gal11-25 肽刺激 HLA-DQB1 * 03 健康志愿者(n = 10)或 Micro-DCM 队列患者(HLA-DQB1 * 03,n = 9;其他 HLA,n = 8)后,对外周血单核细胞的 IFN-γ 酶联免疫斑点分析(ELISPOT)与健康对照相比,患者外周血 T 细胞对MYH6和 β-gal 肽的干扰素-g(IFN-g) 反应性显着提高(图4I)。

图J. 具有指示的 HLA-DQB1 等位基因的心肌炎患者和健康人中 MYH6- 或 β-gal IFN-g 产生细胞之间的相关性。圆点代表个体主体。r,Pearson相关系数;r2,决定系数。与健康对照相比,MYH6 和 β-gal 肽反应性之间存在高度显著的相关性,表明心脏特异性 CD4+T 细胞与人心肌炎患者的细菌肽发生交叉反应。

图K,L. 粪便微生物群移植(FMT)后4周,对前 GF 受体小鼠的心脏浸润 CD45+ 免疫细胞(K)和CD4+T细胞(L)进行计数。免疫细胞的积累仅在接受来自 B.theta 阳性患者移植的TCRM小鼠受体的心脏中显著增加。

结论

总体而言,在肠道中引发的交叉反应性 CD4 + T 细胞可进入心肌并加剧由嗜心病毒或亚临床性心肌梗死感染引起的损害。同样,在免疫检查点抑制剂治疗期间对自身和交叉反应性 T 细胞失去控制可能是共享特定 HLADQA1* / B1* 等位基因的患者潜在致死性心脏炎症的原因。因此,针对遗传易感性心肌炎患者或通过抗生素进行检查点抑制剂治疗的易感患者的微生物群可能会减轻疾病的严重程度,这可能有助于预防可能致命的炎症性心肌病后遗症。

视频 | 肠道菌群科普小课堂

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健康科学相关知识

肠道菌群

首先,肠道菌群是什么?

究竟扮演什么样的角色?

人类肠道菌群是如何形成?

与疾病之间又有什么联系?

No. 1

https://v.qq.com/x/page/z0324rg0854.html

来自:腾讯视频, 2016.08.27

肠道菌群建立

人的菌群是如何建立并发展的?

为什么说怀孕母亲

和新生宝宝的微生物组非常重要?

它是如何对母亲和宝宝产生影响?

宝宝又是如何建立自己的肠道菌群?

No. 2

https://v.qq.com/x/page/u3006r5vo0h.html

来自:腾讯视频, 2019.10.10

母体子宫内菌群存在与否?

关于微生物群是何时以及如何建立的,

研究人员提出了两种相反的假设?

详见视频。

No. 3

https://v.qq.com/x/page/f3018t8bxmb.html

来自:腾讯视频, 2019.11.08

肠道菌群的影响

肠道菌群如何影响大脑

改变一个人的精神状态,改善焦虑?

和抑郁症,自闭症有什么样的联系?

关于抗生素的使用是否会影响到

儿童的肠道菌群以及大脑发育呢?

No. 4

https://v.qq.com/x/page/k0893wse9ft.html

来自:腾讯视频, 2019.07.02

肠-脑轴

肠道菌群和你的大脑之间有着密切的关系

它们是如何影响的你的健康?

No. 5

https://v.qq.com/x/page/c0889zmh5um.html

来自:腾讯视频, 2019.06.25

肠道菌群对免疫系统有什么影响?

肠道菌群和癌症之间的关系

肠道菌群受什么影响?饮食?

改变的肠道菌群会引起什么反应?

No. 6

https://v.youku.com/v_show/id_XMTY2MDI3NDY5Ng==.html?spm=a2h3j.8428770.3416059.1

来自:优酷视频, 2016.07.27

食物消化——粪便形成

食物消化过程

  前方高能预警  

本视频第一视角带你观看

食物进入体内后的运动轨迹

No. 7

https://v.qq.com/x/page/n05309up1jb.html

来自:腾讯视频, 2017.07.27

  前方高能预警  

粪便形成过程

食物经过消化获取营养后,

剩余的废料和水,

从小肠进入直肠。

怎么形成粑粑排出?

什么情况引起便秘?

。。。

No. 8

https://v.qq.com/x/page/o05305zh7pp.html

来自:腾讯视频, 2017.07.27

肠镜相关知识

肠镜是什么?

仪器是怎么样的?

如何进行肠镜检查?

检查过程需要多长时间?

肠镜有哪些不适?是否会痛?

哪些症状表明需要进行肠镜检查?

来看看你需要了解的所有肠镜知识。

No. 9

https://v.qq.com/x/page/r05303w8449.html

来自:腾讯视频, 2017.07.26

肠道菌群检测

肠道菌群健康检测是怎么做的?

这背后有什么样的技术支撑?

No. 10

https://v.qq.com/x/page/q0870ckhmi3.html

来自:腾讯视频, 2019.05.15

以上几个科普小视频,

看完之后是不是有了更多的认识? 

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可用于分析微生物与代谢产物之间相互作用的人工神经网络

谷禾健康 原创

最近, 国际顶级方法学期刊《Nature Methods》发表了由加利福尼亚大学圣地亚哥分校儿科、加州大学计算机科学与工程系 、加州大学合作质谱创新中心以及加利福尼亚大学圣地亚哥分校微生物群创新中心 多学科合作研究的最新成果:“Learning representations of microbe–metabolite

Interactions(可用于分析微生物与代谢产物之间相互作用的人工神经网络)”,此项研究恢复微生物与代谢物之间关系的能力,并证明了该方法如何发现微生物产生的代谢产物与炎症性肠病之间的关系。

摘要

研究人员表示,整合多组学数据集对于微生物组研究至关重要。但是,推断整个组学数据集之间的交互具有多种统计学上的挑战。文章中通过使用神经网络(https://github.com/biocore/mmvec)来解决了此问题,其能够在存在特定微生物的情况下估算每个分子存在的条件概率。研究人员以已知的环境(沙漠土壤湿润生物结壳)和临床(囊性纤维化肺)实例为例,展示了这一方法恢复微生物与代谢物之间关系的能力,并证明了该方法如何发现微生物产生的代谢产物与炎症性肠病之间的关系。

背景

虽然已经有广泛的努力来开发整合多组学数据的方法,但一些概念上的挑战限制了整合不同组学数据的技术,例如,将微生物测序和非靶向质谱联系起来。因此,需要新的方法来处理不同的数据类型。为此,研究人员提出了“mmvec”(微生物-代谢物载体),一种神经网络,可以从单个微生物序列预测整个代谢物丰度曲线。通过迭代训练,mmvec可以学习微生物和代谢物之间的共现概率。微生物-代谢物相互作用可以通过标准的降维界面进行排序和可视化,从而产生可解释的结果。

主要结果

1.使用模拟囊性纤维化生物膜的数据集,将mmvec与Pearson’s、Spearman’s、SPIEC-EASI、SparCC和proportionality方法进行基准比较。证明了mmvec优于所有旨在推断成对微生物-代谢物丰度数据集之间相互作用的现有工具。

图a.两个微生物和多个分子之间的相互作用被模拟成单分子动力学和扩散过程,(发酵剂由θf表示,铜绿假单胞菌由θp表示)从推导的微分方程模拟的微生物和代谢物的绝对丰度,图b. 为图a.中绝对丰度的比例。这里模拟了五种代谢物,即糖(SG)、抑制剂(I)、酸(F)、铵(P)和氨基酸(SA)

图c. 在每种微生物的前100个代谢产物中,使用 F1 score、precision(精确率)和recall curves(召回率)比较了mmvec与Pearson’s、Spearman’s、SparCC、SPIEC-EASI(生态关联的稀疏逆协方差估计与统计推断)、比例度量(φ和ρ)。图中表示mmvec和SPIEC-EASI的随机表现(Random)优于其它所有工具,其中mmvec表现最好。

图d.从绝对丰度和从所有基准测试方法获得的相对丰度的系数比较。图中显示mmvec是唯一对比例偏差具有鲁棒性的方法。这对于保持绝对丰度和相对丰度之间的一致性至关重要,否则可能导致虚报假阳性和假阴性。

2.沙漠土壤生物润湿事件,测试mmvec是否可以解决微生物-代谢物相互作用中无法解释的差异。结果是mmvec解决了阴道分枝杆菌释放的体外验证代谢物与环境样品的测序和质谱分析之间的冲突发现。

图a. 阴道分枝杆菌-代谢物相互作用的比较,根据Spearman‘s和mmvec估计(n = 19个样品)。由阴道分枝杆菌释放的所有经实验验证的代谢物都被标记。所有与生物润湿实验结果和体外实验结果相矛盾的代谢物都用红色突出显示。Spearman‘s标记的13个标签中有7个具有负相关性,表明这些分子被阴道分枝杆菌消耗而不是释放。

图b.经实验验证的分子在不同统计方法中的检测率的基准比较。mmvec具有相当高的真阳性率。

图cd. 阴道分枝杆菌(c)和4-胍丁酸(d)在生物润湿事件后的比例

MMVEC和Spearman‘s之间的冲突结果可以用生物润湿后微生物生物量的增长(c)和可用资源(d)的转移来解释。

3. 囊性纤维化患者的肺粘液微生物组研究,进一步验证mmvec是否可以检测已知的微生物-代谢物相互作用。结果表明mmvec可以可靠地识别由铜绿假单胞菌产生的所有经实验验证的感兴趣的分子

图a.依据mmvec在囊性纤维化数据集中估计的条件概率做的双标图。箭头代表微生物,圆点代表代谢物。x轴和y轴表示由mmvec (n = 138个样本)估计的微生物代谢产物的条件概率的奇异值分解(SVD)的主成分(PCs)。点之间的距离量化了代谢物之间的共现强度,较小的距离表明代谢物有很高的共现概率。箭头尖端之间的距离可以量化微生物之间的共现强度。箭头的方向性可以用来确定哪些微生物可以解释代谢产物的共现模式。绿色箭头表示推测的囊性纤维化病原体,黄色箭头表示已知的厌氧菌。只有铜绿假单胞菌产生的已知分子被标记。mmvec清楚地分离了厌氧菌和病原体,左侧是已知的厌氧微生物,右侧是显著的病原体。

图b.从mmvec学习到的第一主成分与代谢物在氧梯度上的对数倍数变化之间存在负相关 ( Pearson‘s r=−0.59,P=1.8×10−44,n=442个分子)。Pearson‘s法未发现氧梯度与第一微生物主成分之间的这种相关性(r=0.11,P=0.16,n=138个分子)。

图c. 第一主成分与样本数量的关系,其中分类群是该样本中最丰富的分类群。

图d. 铜绿假单胞菌和链球菌最丰富的样品的热图(log ratio t test = 6.51, P = 4.4 × 10−8, n = 49 个样本)。这提供了证据表明,在本研究的背景下,代谢组学特征在很大程度上受到最丰富的微生物的影响。

图e. 与铜绿假单胞菌和链球菌共生的前100个代谢物分子的热图。图中表示仅是预测铜绿假单胞菌代谢物谱就可以解释这些样品中10%的代谢物变异(r = 0.319, P = 1.18×10−11,n = 442个分子)。

4. 胆汁酸研究。证明mmvec能够在复杂的生物系统中进行探索性分析,并简化特定代谢物的微生物来源的发现

图a. 微生物共生模式的可视化,其中点之间的距离近似于微生物之间的Aitchison距离,它量化了微生物发生的情况。较小的距离表明微生物具有很高的共生概率。微生物根据它们与HFD(高脂肪饮食)的关联被着色,这是通过多项式回归用差异丰度分析估计的。mmvec的使用显示了与HFD相关的不同微生物群

图b. 微生物-代谢物相互作用的双图,代谢物根据它们与HFD的关联而着色。HFD关联性通过多项式回归的差异丰度分析进行估计。点之间的距离近似代谢物之间的Aitchison距离,箭头间距近似微生物之间的Aitchison距离。表明mmvec根据饮食对质谱数据进行了清晰的分层。

5.炎症性肠病中微生物-代谢产物的相互作用。结果表示mmvec能够确定IBD研究中对代谢物丰度最强的微生物贡献,并发现了在最初的研究中被遗漏的一种微生物(Propionibacterium)

图a.和图b.分别为在三种菌属Klebsiella,Roseburia和Clostridium bolteae存在的情况下,推断各种胆汁酸(a)和肉碱(b)的条件概率的热图

图c.从宏基因组的概要文件和C18负离子模式LC-MS中学习到的微生物-代谢物相互作用的多组学双图。微生物(箭头)和代谢物(球体)根据多项式回归估计的差异着色。Klebsiella似乎与IBD密切相关,而Propionibacterium有强烈的负相关。

图d. 前300条边缘的网络,只有包含Klebsiella和Propionibacterium的边缘可见。

结论

作者表示,鉴于这些发现,目前的方法仍有局限性。目前还不清楚如何使用共现概率来获得相互作用的统计意义。同样,还不能计算每个微生物-代谢物相互作用强度的置信区间,还需要理论工作来处理连续值的输入。

Tips:文章末尾有关于mmvec算法的推导公式。

根除幽门螺杆菌后肠道菌群、抗生素耐药性及代谢参数的长期变化

原创:谷禾健康

这是一项在台湾九个医疗中心进行的多中心、开放标签、随机试验。

单位:台北大学医学院

期刊: LANCET INFECTIOUS DISEASES 《柳叶刀·传染病》(IF: 27.516)

摘要

在 2013 年 7 月 17 日至 2016 年 4 月 20 日之间筛查了 5454 名患者,其中 1620 名被随机分配到治疗组(每组 540 人)。显示三联疗法、联合疗法和铋四联疗法对肠道微生物群、抗生素耐药性和代谢参数的明显短期和长期影响。研究发现,在根除H pylori(幽门螺杆菌)后1年,肠道微生物群的短期扰动和大肠杆菌抗生素耐药性的短期增加得以恢复。

然而,肠道微生物群的恢复速度和程度因治疗方案的不同而不同。三联疗法对肠道微生物群的干扰较小,而铋四联疗法导致大肠杆菌的抗生素耐药性轻微增加。虽然体重指数和体重有微小的增加,但胰岛素抵抗和甘油三酯浓度降低,表明根除 H pylori 后潜在的有益代谢效应。

背景

根除幽门螺杆菌感染可减少消化性溃疡的复发和胃癌的发生。三联疗法(质子泵抑制剂( PPI )、阿莫西林和克拉霉素),联合疗法( PPI 、阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑)和铋四联疗法( PPI 、铋、四环素和甲硝唑)是根除幽门螺杆菌最常用的方案。然而,在广泛使用抗生素作为预防胃癌的措施方面存在一些问题和障碍,包括抗生素耐药性的出现、肠道菌群的扰动以及根除幽门螺杆菌后代谢综合征的发展。

一些小规模的研究表明,短疗程的三联疗法可能导致肠道微生物群的长期失调,然而,不同的根除方案对肠道微生物群、抗生素耐药性和代谢参数的短期和长期影响未见报道。

研究设计

对受试人群的筛选

符合条件者: 组织学、培养、快速尿素酶试验和血清学中至少有两项阳性检测结果的成年患者(>20岁)或只有一次尿素呼气试验阳性的无症状患者。

不符合条件者(满足其中一个即为不符合):胃切除病史,曾做过 H pylori 根除治疗,具有研究药物的禁忌症或过敏性反应,严重的并发性疾病或恶性肿瘤,孕妇或哺乳期妇女,以及不能给予知情同意的患者。

方案设计

符合条件的患者被随机分配接受三种方案中的一种

三联疗法 14 天(T14,阿莫西林 1 g,克拉霉素 500 mg,兰索拉唑 30 mg, [每日两次])

联合治疗 10 天 (C10,阿莫西林 1 g,克拉霉素 500 mg,甲硝唑 500 mg,兰索拉唑 30 mg, [每日两次])

铋四联疗法 10 天(BQ10,三重柠檬酸 30 mg,四环素 500 mg[每日四次],甲硝唑 50 mg [每日三次],兰索拉唑 30 mg[每日两次])

药敏试验和生理指标试验

所有患者至少在治疗结束后至少 6 周和 1 年后使用 C-UBT 确定 H pylori 状态,并在 C-UBT 前至少停用 PPI 和组胺-2 阻滞剂 2 周。

在基线(治疗前)、第 2 周、第 8 周和根除治疗后 1 年收集粪便样本进行粪便微生物菌群分析和培养及药敏试验。粪便样本在 35℃下用血琼脂-伊红-亚甲基蓝混合平板进行培养。通过基质辅助激光解吸电离 Biotyper 系统鉴定的大肠杆菌和K肺炎菌落被提交进行传代培养和药敏试验。在根除治疗后的基线、第 8 周和 1 年分别测量体重、身高、腰围和臀围以及血压。空腹血糖、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、胰岛素和糖化血红蛋白 (HbA1c),分别在根除治疗后的基线、第 8 周和 1 年后测定。

分析方法

使用 χ² 检验或 Fisher’s 检验对分类数据进行分析, Student’s t 检验或方差分析检验对连续数据进行分析。采用 McNemar 试验,通过配对样本,分析根除治疗前后抗生素耐药性的变化。SPSS 用于统计分析。16s rRNA(V3-V4)高通量测序。α 多样性代表微生物生态系统中物种的丰富度(即有多少不同的物种)和均匀性(即相似的丰度或某些物种占主导地位)。PCA分析用于基于其相似性矩阵来可视化样品的聚类。加权UniFrac 距离矩阵上的 PEARANOVA (一种用于比较生物群落,占观察到的生物体丰度的距离度量)是通过原始数据的不受限制排列与 9999 随机排列来计算的,并用于分析两组之间微生物区系的不同。Kruskal­Wallis 和 Wilcoxon 检验用于分析群体之间和群体内的生态相似性。

主要结果展示

根除治疗前后三种方案的差异性比较

1. 基线(治疗前)时,三个治疗组之间的 α 多样性( p= 0.50,图 A ) 和 β 多样性( 图 E )没有显着差异。

2. 在接受三联疗法、联合疗法和铋四联疗法的患者中,在第 2 周(图B,F)、第8周( 图C,G )和 1 年( 图D,H )的 α 多样性和β多样性有显著差异。

3. 随着时间的推移,α 多样性表示微生物群有恢复的趋势,但与第 8 周时(图C)接受三联疗法的患者相比,同时接受联合治疗( p=0·0081 )和铋四联治疗法( p=0·0004 )的患者的α多样性仍然显著降低。与 1 年时(图D)接受三联疗法治疗的患者相比,接受联合治疗( p=0.013 )和铋四联疗法( p=0.014 )的患者 α 多样性仍然显著降低。

治疗前、治疗 2 周、8 周和 1 年每个方案内 α 多样性(A,C,E)和 β 多样性(B,D,F)变化

1. 图 A-B,与基线相比,三联疗法后的第 2 周物种丰富度(α 多样性)显著降低(p=0·0002),粪便微生物群结构(β 多样性)有显著差异(p=0.0010)。但在第 8 周和 1 年后 α 多样性(p=0·14,p=0·81)和 β 多样性(p=0·92,p=0·44)均恢复到基线水平。

2. 图 C-D,与基线相比,联合疗法后的 α 多样性在第 2 周(p=5·1×10−¹⁵),第 8 周(p=0.0001)和 1 年时(p=0.019)显著降低,β 多样性也有显著差异(p=0·0001,p=0·013)。然而,β 多样性似乎在 1 年后恢复(p=0.064)

3.图E-F,与基线相比,铋四联疗法后的 α 多样性在第 2 周(p=7·6×10−³),第 8 周(p=2·1×10−⁸)和 1 年时(p=0·0010)显著降低,β 多样性也有显著差异(p=0·0001,p=0·0002,p=0·029) 

三联疗法、联合疗法和铋四联疗法对肠道微生物群、抗生素耐药性和代谢健康参数的明显短期和长期影响

与基线相比,三联疗法 14 天(T14)、联合治疗 10 天(C10 )和铋四联疗法 10 天(BQ10)组在第2周、第8周和1年在属水平上的丰度发生了显著变化。大肠埃希菌对青霉素衍生物、头孢唑林、头孢美唑、氟喹诺酮类、庆大霉素和甲氧苄啶-磺胺甲恶唑的耐药率在第 2 周的 T14 和C10 组瞬时增加,在第 8 周和 1 年恢复到基础状态。虽然体重和体重指数略有增加,但在 T14、C10 和 BQ10 后 1 年,代谢参数有明显改善,胰岛素抵抗、甘油三酯和低密度脂蛋白降低,高密度脂蛋白增加。总体而言,在 T14、C10 和 BQ10 之后的第 8 周和第 1 年,代谢综合征的患病率没有明显变化。

Fuso = 梭杆菌  Pro = 蛋白杆菌  FIR = 厚壁菌 BAC = 拟杆菌

AMP = 氨苄青霉素SAM = 氨苄西林 – 舒巴坦TZP = 哌拉西林 – 他唑巴坦

cfz = 头孢唑啉CMZ = 头孢美唑CIP = 环丙沙星LVX = 左氧氟沙星GEN = 庆大霉素TMP/SMX = 甲氧苄啶 – 磺胺甲恶唑

BMI = 体重指数bw = 体重 HOMA – IR = 胰岛素抵抗的稳态模型评估HDL = 高密度脂蛋白TG = 甘油三酯MS = 代谢综合征,代谢综合征是根据修订后的国家胆固醇教育计划成人治疗小组III分类定义的

Reinfection/recrudescence = 再感染 / 复发

结论

Hpylori根除治疗在短期和长期不会增加代谢综合征的患病率。

根除幽门螺杆菌治疗的长期安全性与肠道微生物群、抗生素耐药性和代谢健康参数有关。虽然在H pylori根除治疗后立即出现短暂的肠道微生物区系变化,但这些变化大部分在8周后消失并恢复到治疗前水平,当然是在1年前。然而,恢复的速度和程度因方案而异。同样,虽然大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对某些抗生素的耐药性患病率在三次和联合治疗后立即瞬时增加,但在第8周和1年时耐药性患病率恢复到治疗前的水平。

值得注意的是,经过铋四联疗法后,大肠杆菌的抗生素耐药率没有显着增加。根除治疗后8周和1年代谢综合征的患病率没有显着变化。虽然体重指数和体重略有增加,但胰岛素抵抗和甘油三酯浓度降低,表明根除H pylori后存在潜在的有益代谢效应。这些结果共同支持H pylori根除疗法的长期安全性。

微生物群和社会行为

原创:谷禾健康

你可能听说过

肠道微生物群会影响大脑的生理和行为

但你是否清楚

肠道微生物群究竟是如何调节社会行为?

研究微生物群和社会行为之间的关系可以为我们带来什么?

近日发表在Science期刊上的一篇最新综述或许可以帮助你进一步了解微生物群和社会行为之间的关系。

肠道微生物群与中枢神经系统之间的双向通路,即微生物-肠-脑轴,影响动物王国中各种复杂的社会行为。一些动物已经进化出了它们自己与肠道微生物群的独特关系,这可能有助于它们与同种动物间的互动。肠道微生物群与社会行为之间的关系可能有助于解释在自闭症谱系障碍(ASDS)等情况下观察到的社会缺陷,并可能引领开发新的治疗方法。

微生物-肠-脑轴与社会行为的关系

背景

微生物群-肠-脑轴

研究表明,胃肠道微生物可以通过多种途径向大脑发出信号,包括免疫激活微生物代谢产物肽的产生迷走神经的激活以及肠道内各种神经递质和神经调节剂的产生。这种双向途径被称为微生物群-肠-脑轴。

虽然对肠道微生物在自然种群中的功能和生态影响的研究正在增加,但从进化的角度来看,目前尚不清楚微生物与社会大脑之间的关系是为什么和何时出现的。跨物种分析可以帮助我们理解人类的社交能力。

进展

社会行为

社会行为可以定义为只有当动物出现在一个群体中时才能观察到的行为。

社交性包括一系列复杂的互动行为,这些行为可以是合作的、中立的,也可以是敌对的。

社交能力可以促进互利的结果,如分工、合作照顾和增强免疫力,但社交能力也能促进消极结果,包括冲突、侵略和胁迫。

了解调节社会行为的内在和外在因素,对于揭示个体和种群如何繁衍生息,对于确定某些动物物种为什么进化成比其他物种更善于交际,对于阐明社会行为障碍的潜在病因,都是很重要的

1973年,Konrad Lorenz等人在哺乳动物的遗传起源、发展和社会行为模式的启发方面的突破性研究获得了诺贝尔奖,为评估影响社会行为的各种内在因素和外在因素提供了基础。

从那时起,人们在理解行为方面取得了巨大的进步,尤其是社会行为,已经成为生物学研究中最有趣、最复杂的领域之一。

社会行为由多个相互连接的大脑边缘区域控制

临床前和临床影像学研究有助于描绘人类和其他哺乳动物社会行为的神经回路。社会行为受几个皮质下前脑结构控制,如前额叶皮质(PFC)、前扣带皮质(ACC)、杏仁核(AMG)、海马体(HIPP)和下丘脑室旁核(PVN)构成一个完整网络的一部分,以促进这种复杂的行为。

对这些大脑区域中任何一个的损伤或功能障碍都会引起社会行为的不安。事实上,AMG和PFC等区域的神经生物学已经被证明在自闭症谱系障碍(ASDs)等社会大脑疾病中发生了改变。

动物界的研究

对宿主微生物相互作用的新认识导致人们前所未有地关注动物体内的微生物世界,包括无脊椎动物(如白蚁、蜜蜂、黄蜂)和脊椎动物(鸟类、鬣狗、人类)。

开创性的研究已经确定了胃肠道微生物群对健康的影响,微生物群在从早期到成年的神经发育过程中发挥作用,并影响神经传递、神经炎症和动物行为等神经过程。微生物产生的信号可能直接或间接地改变大脑功能,并且由于动物是在微生物世界中进化的,这些信号可能在整个进化过程中影响了动物的大脑。

动物界微生物群与社会行为的关系

对社会物种和非社会物种的微生物群组成的研究表明,在许多动物物种中都存在相同的细菌门。然而,不同的物种以不同的方式利用它们的相关微生物群,以促进各种形式的社会互动

对无脊椎动物和脊椎动物物种的观察表明,饮食和免疫等因素会产生选择压力,从而推动微生物群与社会行为之间的关系。

虽然微生物群可能通过调节肠脑轴而影响内源性行为,但一些动物物种可能已经进化成利用共生细菌来介导相同物种的成员之间的通信。例如,鬣狗从它们的气味腺体中产生一种有气味的糊状物,其中含有发酵细菌,这被认为是为了促进同种动物之间的社会凝聚力。动物和微生物群之间的这种复杂的关系提出了这样的假设:微生物可能影响着社会大脑和行为的进化,以此作为传播它们自己的遗传物质的手段。

肠道微生物群调控社会行为机制

越来越多的证据表明,在动物界观察到的许多行为反应可能在动物生命的不同阶段受到肠道微生物群的调节,在这个范式中,越来越强调阐明肠道微生物群与大脑交流的机制

代谢产物

胃肠道中的细菌发酵和代谢导致神经递质短链脂肪酸(SCFAs)等代谢产物的产生。SCFAs可能通过与迷走神经上表达的游离脂肪酸受体(FFAR)结合和激活,间接影响脑的生理和行为。

此外,它们在胃肠系统局部抑制组蛋白脱乙酰酶的能力可能间接影响各种介质对大脑的信号传导。

迷走神经

迷走神经最近被证明与肠内分泌细胞形成突触联系,这有助于通过谷氨酸能神经传递将营养信号传递给大脑

迷走神经纤维富含5-HT3、Toll样受体4(TLR4)、游离脂肪酸受体(FFARs)和肠肽受体等受体;因此,它们是从肠腔向大脑传输信号的理想场所。

迷走神经切断术研究提供了经验证据,证明迷走神经是微生物群与大脑沟通的另一条途径。

免疫机制

肠道微生物群与免疫系统之间的联系是另一个被高度探索的途径,共生细菌可以通过这种联系对大脑生理和行为施加影响,在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌细胞壁上表达的细菌肽聚糖能够通过激活在大脑(中枢神经系统插件)中表达的特定病原体识别受体,如PGLYRP2,影响社会行为的发展。

嗅觉机制

微生物群还可以通过排泄代谢物影响社会行为,代谢物充当嗅觉信息素。小鼠尿液中分泌的三甲胺可通过激活嗅觉受体(嗅觉系统插件)促进小鼠的社会凝聚力通过这些不同的途径,肠道微生物群已经被证明可以调节多种中枢生理过程,如神经炎症、5-羟色胺转换、髓鞘形成和亲社会激素催产素的分泌,从而提供了肠道菌群如何影响社会行为的机制性见解。

暴露于应激源后,促肾上腺皮质激素(ACTH)从垂体前叶(垂体内叶)释放,并刺激应激激素糖皮质激素的释放。

糖皮质激素影响新陈代谢和介导免疫激活等全系统效应。共生细菌暴露于糖皮质激素会降低它们的相对丰度。此外,在慢性应激条件下,糖皮质激素释放增加与肠道微生物多样性和丰富性降低有关。

社会大脑受到多种生物和环境因素的影响

社会行为受多个相互关联的大脑区域(如下丘脑、杏仁核、前扣带皮质和前额叶皮质)支配,这些区域受多种外在和内在因素(如性别、遗传和表观遗传机制以及环境)的影响,这些因素都可能直接影响社会行为,也可以相互结合来塑造这种行为。例如,宿主遗传可以影响宿主胃肠道微生物群的组成,从而影响肠道菌群对社会行为的相对贡献。此外,饮食、精神药物和环境等外在因素也会影响微生物群的组成,从而间接地改变行为。

以微生物群为基础的干预治疗社会行为缺陷的临床和临床前研究自闭症谱系障碍

微生物群与社会失调之间的联系表明,瞄准微生物群可以改善社会行为缺陷。基于微生物群的策略已经证明了在各种临床前模型中改变社会行为的潜力,一些初步证据表明对人类的影响。

ASD,自闭症谱系障碍;ATEC,自闭症治疗评估清单;CFU,菌落形成单位;PBS,磷酸盐缓冲生理盐水;FOS,低聚果糖;GABA,g-氨基丁酸;GOS,低聚半乳糖;poly(I:C),聚肌苷:多胞苷酸;Shank3,SH3和多个ankyrin重复结构域3

展望

了解影响整个动物王国社会行为的发展和规划的因素不仅对重新思考大脑生理和行为的演变很重要,而且还有助于更深入地了解人类社会大脑的紊乱[包括自闭症谱系障碍(ASD)、社会恐惧症和精神分裂症]。

微生物群与这些疾病之间联系的证据正在增加,临床前和新出现的临床数据提出了这样的假设,即通过饮食或活的生物治疗干预以微生物为目标可以改善这类神经发育障碍的相关行为症状。需要进行更大规模的临床试验,以确认这种干预措施的有效性,然后才能被认为是神经发育障碍的一线治疗方法。

虽然目前肠道菌群和神经发育障碍之间的联系是一个有趣的研究领域,但微生物群在动物社会行为进化中的任何作用都不会取代其他因素。相反,它为这些复杂行为的产生增加了一个额外的视角。

参考文献

Sherwin E, Bordenstein S R, Quinn J L, et al. Microbiota and the social brain[J]. Science, 2019, 366(6465).

独特的代谢生态位使菌株能够植入肠道菌群

谷禾健康  

菌株的定植一直是一个重要问题,无论是婴幼儿的早期定植还是希望通过菌群干预改变菌群构成或益生菌补充的方式实现益生菌的定植。但是受原有菌群互作和环境影响,如何提高菌株定殖效率和改善定向增殖效果存在很大困难。通过独特的营养代谢特征使用稀有营养系统可实现控制菌种移植,并且不受原菌群结构影响。通过改造菌株,可以精准的通过营养系统来实现有效可控的定制对基于菌群的生物疗法具有重要意义。

来自斯坦福大学医学院微生物学与免疫学系和 Novome Biotechnologies 公司的研究人员在 一项研究中指出,独特的代谢生态位能使菌株植入肠道菌群,相关研究成果发表在Nature期刊。

通过控制海洋多糖、卟啉和一种含有用于卟啉利用的罕见基因簇的外源性拟杆菌菌株来产生独有的代谢生态位。对外源性菌株给予专有的营养,使得外源性菌株在具有不同肠道微生物群落的小鼠中以可预测的丰度有效的植入,这种针对性的饮食支持足以克服同基因菌株的优先排斥,并使菌株替换成为可能。

他们演示了将 60 kb 的卟啉利用位点转移到幼稚的类杆菌菌株中,并通过改变卟啉的剂量,对肠道内的应变丰度进行多个数量级的精细调控。最后证明了这个系统能够将一个新的菌株引入结肠隐窝生态系统。这些数据强调了营养有效性对形成微生物区群成员的影响,扩大了在复杂微生物群背景下进行广泛研究的能力,并对肠道中基于细胞的治疗策略有意义。


Niche ( 生态位 ):是指一个种群在生态系统中,在时间空间上所占据的位置及其与相关种群之间的功能关系与作用。生态位又称生态龛。表示生态系统中每种生物生存所必需的生境最小阈值。

Bacteroides ovatus(卵拟杆菌):能够利用膳食果聚糖和海洋多糖(marine polysaccharide)

GFP ( 绿色萤光蛋白 ):在细胞生物学与分子生物学中,绿色萤光蛋白(GFP)基因常用做报告基因 (reporter gene)。绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子)上进行表现,并拿来映证某种假设的实验方法。通过基因工程技术,绿色萤光蛋白 (GFP) 基因能转进不同物种的基因组,在后代中持续表达。现在,绿色萤光蛋白 (GFP) 基因已被导入并表达在许多物种,包括细菌,酵母和其他真菌,鱼(例如斑马鱼),植物,苍蝇,甚至人等哺乳动物的细胞。

Priority Effects ( 优先效应 ):在信息呈现顺序中,首先呈现的信息比后来呈现的信息在印象形成中有更大的权重


研究背景

高度竞争和动态的肠道微生物群的微生物组成的变化可以影响宿主生物学的许多方面。尽管肠道微生物组成对人类健康很重要,但控制共生菌株入侵现有复杂群落的规则还没有得到很好的解释。常驻菌株往往排除了与其类似的入侵菌株,在某些情况下,被现有菌株占据的生态位可以被类似的入侵菌株利用。无法预测或控制粪便微生物移植的结果表明,需要对影响新菌株是否能够整合到预先存在的复杂微生物群的因素进行基本了解。

饮食是形成社区成员和功能的主要力量。拟杆菌属的成员通过其多糖利用位点 (PULs) 编码的机制,大量利用饮食来源的微生物可获得的碳水化合物 (MACs)。假设特定的 MACs 可以作为一种杠杆,通过它可以调节不同的社区中定植菌株密度。

拟杆菌种具有有趣的定殖行为,其中早期定殖者将排除具有挑战性的同源菌株,这种现象被称为优先效应。假设这种行为可以通过向具有挑战性的菌株提供特殊营养来克服,从而创造一个独一无二的代谢生态位。

罕见拟杆菌属菌株对卟啉的消耗是通过水平转移的 PUL 实现的,PUL 来源于海洋细菌。

方法

  • 菌株:

废水处理设施的主要废水中分离出来的 NB001(利用卟啉的B.ovatus)和 NB004 (原始的B.stercoris)

  • 细菌培养和菌株分离:

所有细菌的生长都是在37°C的厌氧条件下进行的,在富培养基(胰蛋白胨-酵母-葡萄糖12)中进行生长,不添加抗生素。

所有细菌的生长都是在 37°C的厌氧条件下进行的,在富培养基(胰蛋白胨-酵母-葡萄糖12)中进行生长,不添加抗生素。使用过滤器消毒)中生长 24 小时,在1:200的新鲜培养基中继代培养并生长 24 小时,并在 BHI-BA 上连续稀释。将单个菌落挑选到 SMM 中进行生长确认、低温储存和下游分析。

  • 全基因组测序与分析:

使用 PureLink 基因组 DNA 迷你试剂盒 (Invitgen) 从 NB001 和 NB004 中提取基因组 DNA。基于 Geneious 进行基因注释和比对,NB001 的全基因组测序显示了一个与先前描述的卟啉 PUL 高度同源的基因簇。

  • 卟啉PUL转移和基因敲除 

使用质粒 pWD034 敲除了预测对海藻 MACs 生长至关重要的8个基因。

基于基因注释和赋予 PUL 能力的移动元件的序列比对,设计了三个不同大小的最小PULs(20kb,40kb和60kb)。获得具有短长度和中等长度 PUL 的 B.thetaiotaomicron

通过敲除卟啉利用基因,验证了完整的 PUL 对卟啉体外特异性生长的要求

  • 小鼠实验:

无菌小鼠 (Germ-free) 或限制性植物 (RF) 8-16 周的常规雄性或雌性小鼠被安置在隔离器中。选择大小足以产生统计显著性的样本,在断奶时将动物分组。通过口服 108 c.f.u将所有拟杆菌属菌株接种到无菌或RF小鼠中,用健康人类供体的粪便样本将小鼠人性化 (Hum-1、Hum-2)。在 NB001 导入前一周,小鼠被喂养缺乏 MAC 的食物。NB001 导入7天后,小鼠切换到定制饮食,菊粉或海藻作为唯一可用的 MAC。RF小鼠在水中以指定的百分比给予卟啉。

  • 16S rRNA 分析DNA

从粪便样品中提取 16S rRNA 分析 DNA,并在 16S v4 区域( 515F,806R )进行扩增。使用Qiime1.9 来分析所得到的 Illumina 产生的测序读数。数据被分类到具有最低读数 ( 16384 )的样品,并且通过 UCLUST 和通过 Greengenes13.8 数据库的分类分配执行OTU注释。

主要结果

生态位有效性因微生物群而异,可通过添加可以通过添加一种特殊营养物质来调节。 (privileged nutrient)

a图实验设计方案将具有三种不同肠道菌群的小鼠(rf)或人类(hum-1,hum-2)定植NB001。NB001在粪便中被追踪7天,小鼠被切换到含有菊粉(in.)或富含卟啉海藻的特殊多糖周。

b图为未添加特殊营养物质时定植菌株(NB001)在粪便中的密度。

c图为添加富含菊粉(in.)营养物质时定植菌株(NB001)在粪便中的密度。

d图为添加富含卟啉(por.)营养物质时定植菌株(NB001)在粪便中的密度。

cd图中通过颜色阴影区分在饮食中添加特殊营养物质之前和之后粪便中NB001的密度。

通过KruskalWallis检验查看组间差异显著结果,“*”表示有显著差异,“n.s.”表示无显著差异。灰色阴影框表示检测的限度。

获得特殊营养素可以调节种群大小并克服NB001(PUL+)同基因菌株的优先排斥

Total(可培养厌氧菌总数)

ab 图,被NB001(PUL+)菌株定植的常规小鼠与缺乏MAC食物喂养或富含MAC食物喂养的常规小鼠,在同样给予卟啉后,菌株丰度发生了变化。绿色阴影为给予卟啉的时间周期。

c 图,被NB001(PUL-)菌株定植的常规小鼠与富含MAC食物喂养的常规小鼠在给予卟啉后,菌株丰度没有变化。

d-f 图,常规小鼠进食富含MAC的饮食后,用PUL定植6天,第6天用PUL+进行挑战。

d 图,在没有给予卟啉的情况下,挑战菌株(PUL+)被现有菌株(PUL-)排除了。

e 图,在给予卟啉的第8天,挑战菌株(PUL+)取代了现有菌株(PUL-)。

f 图,挑战菌株(PUL+)与现有菌株(PUL-)在连续3天的卟啉脉冲后稳定共存。

对种群大小的控制是可以设计的,并且具有高度的可调性

c 图,将含有中等长度 PUL 的 B.thetaiotaomicron 菌株在常规小鼠中定植,喂养富含 MAC的食物和添加了1%卟啉的饮用水,展示了添加卟啉前后的菌株丰度变化

d 图,将含有中等长度 PUL 的 B.thetaiotaomicron 菌株在常规小鼠中定植,喂养富含MAC的食物和添加了1%卟啉、0.1%卟啉或0.01%卟啉的饮用水,表现出对卟啉的精细调节(绿色阴影部分)可以影响菌株的丰度。

e 图,图像为宿主的近端结肠,表达GFP标记的NB001菌株在常规小鼠中定植,给予0.01%的卟啉(左)或1%的卟啉(右)

对卟啉的使用使结肠隐窝定殖成为可能

将表达 RFP 标记(红色)的野生型 B.thetotaomicron 引入无菌小鼠体内,7天后再引入表达GFP 标记(绿色)的含有中等长度 PUL 的工程化 B.thetotaomicron 挑战菌株。

a 图 表示在没有给予卟啉的情况下,挑战菌株被从结肠隐窝群体中剔除了。

b 图 表示,当重新给予卟啉时,可以重塑结肠隐窝群体。

c 图 表示在有或没有卟啉的饮食中结肠隐窝中细菌的定量(每组3只小鼠,每只小鼠统计100个隐窝细菌)。双侧t检验,p=0.0395(*)。误差条表示标准差。

总结

利用全基因组测序注释结果改造菌株中的基因,使用小鼠进行动物实验,结合16S rRNA测序监测不同专有营养的给予对定植菌株丰度的影响。对数据使用 KruskalWallis 进行差异检验。研究了一种使用稀有营养系统对控制菌种移植的有效途径,不依赖于背景菌群,并将给予专有营养作为菌种融入肠道群落的关键调控因子。

工业化时代进程下的微生物群落变迁

谷禾健康  

随着现代社会飞速发展,尤其是在医药、食品和卫生等方面都在飞跃,那么在这样条件下微生物群落的变化对人类健康带来哪些影响? 

近日,来自美国斯坦福大学微生物学与免疫学系及人类微生物研究中心的 Justin L. Sonnenburg 和 Erica D. Sonnenburg 在 science 上面发表文章,就工业化对人体肠道微生物群的影响展开讨论,向我们展示了工业化时代新的生活方式驱动的微生物群变化对人健康的有利影响,同时也指出了某些可能被忽略的影响以及应采取的措施。

首先,我们知道每个人都是一个生态系统,由数以千计的物种和数万亿的成员组成,而这些成员大多数是肠道中的微生物群。微生物群与免疫系统、中枢神经系统和新陈代谢之间存在着密切的联系。

肠道微生物群已经与人类共食了数百万年,经历了数十万代。从非工业化环境迁移到工业化环境,人们的微生物群组成的变化与生活方式改变的时间和严重程度相对应。

我们现在处于工业化世界,人们的微生物群是人类从未经历过的结构。这里我们根据时期划分两种类型:“传统”微生物群,“工业”微生物群。相对于“传统”微生物群,“工业”微生物群似乎具有较低的微生物多样性,种类和功能发生重大变化。

处于工业化时代的人们,从刚出生的时候,微生物群定殖的过程就开始受到许多因素的影响,包括出生方式(自然分娩或剖腹产)、营养(母乳或配方奶粉)、饮食(工业生产食品)、环境(卫生习惯)、感染和抗生素使用等。

肠道微生物群反映了传统和工业人群的生活方式

图注:(A)通过Bray-Curtis主成分分析分离的多个研究中肠道微生物群的聚集性16S rRNA计数的差异性。A上图:第一个主成分解释了18个人生活方式的22%的变化,从委内瑞拉的未接触美洲印第安人(上)到完全工业化的澳大利亚、美国、加拿大和爱尔兰人(下)。 A下图:菌在科水平的相对丰度揭示了消失类群的整体模式,这与工业化社会是负相关的,比如拟杆菌科和韦荣菌科。 

(B)热力图修改自 Jha等,显示种属随着生活方式的变化而变化,包括同一个地址位置(尼泊尔)作为觅食者、定居觅食者或农业学家的个体与美国的工业化个体的比较。 

(C)模型修改自Jha等,随着生活方式迁移,菌群损失和/或减少与增益和/或增加的关系。不同的菌群丰度变化模式对应着随着人口从觅食向城市化转移而转变生活方式的特定方面。该模型还可以反映工业化人类从觅食(智人大约20万至30万年前出现)到农业(1万至2万年前开始)再到工业化(100至200年前开始)的历史进程。 

我们不能忘记使用抗生素、增加卫生设施和医疗生产来根除病原微生物的企图是如何挽救了无数人的生命的(特别是在紧急医疗保健方面)。技术和医学的进步具有不可否认的好处,如西方饮食和婴儿配方奶粉,增加了便利性,提高了人类的生产力,满足了日益增长的人口的食品需求。但需要注意的是,在我们并未了解微生物群之前,这些技术已经开始广泛运用

随着工业生活方式在全球的普及,人类微生物群的变化可能是非传染性慢性疾病同时传播的核心,而且很难逆转。在工业化人群中微生物群的变化可能对健康没有影响,也有可能是导致人类免疫系统失调的主要原因,从而导致慢性炎症。非传染性疾病,如中风、心脏病、一些癌症、慢性肾病、糖尿病和痴呆,所有这些都是由慢性炎症引起的,这些疾病可能与世界范围内的工业化生活方式的扩大有关。

一个关键的障碍是确定工业化引起的微生物群变化对人类健康的影响。这种影响的严重程度可能取决于许多因素的具体情况,包括健康状况、饮食、人类基因型和生活方式。可能需要分离和归档对工业化敏感的菌株,以便能够对这些微生物进行更详细的研究。

建议以可持续性和保护为重点来看待微生物生物多样性可能是保障人类健康的一种重要方法。如果我们要与我们的内部微生物世界保持一种可持续的关系,就必须确定一条可持续的医疗实践、饮食和卫生的前进道路,同时铭记微生物群的重要性和脆弱性。

祝贺谷禾顺利通过ISO9001:2015质量管理体系认证

祝贺杭州谷禾信息技术有限公司获得ISO9001质量管理体系评审高分通过,认证组专家根据ISO9001质量管理体系的要求,对杭州谷禾信息技术有限公司所有职能部门按照 ISO标准,审核组通过现场询问、查看和抽样方式等形式,对质量方针、质量目标的完成情况以及全过程的控制情况进行了检查,经过严格审核,审核专家一致通过我公司的认证注册资格,并于2019年10月8日正式颁发ISO9001:2015质 量管理体系证书。 认证专家对各职能部门在工作流程中表现突出的工作给于了充分的肯定,对有待完善的地方,也提出了建设性意见。
谷禾将在今后的工作中一如既往的严格执行质量管理体系及规章制度,进一步优化和规范各项管理制度, 不断提高体系运行的有效性,不断进行积极探索 严格要求各部门严格按照体系文件要求,做到持续改进,给客户提供更优质的产品和服务。

谷禾健康2019年国庆收样及报告安排

收样安排
国庆前实验室的收样时间截止9月30日,客户的样本必须在9月29日前送到实验室会安排节前上机。国庆期间10月1日至10月7日实验室不接收样本。
报告交付
9月26号及之后收到样本及原定10月1-7号出具报告的样本报告将延后于10月8号出具。


杭州谷禾信息技术有限公司
2019年9月23日

如何读懂和利用你的微生物多样性测序结果?

做过16s测序的小伙伴们都知道

测完之后会拿到一份结果报告

但这并不代表可以开始写文章了

看似一大堆数据图表却不知如何下手

这是很多人头疼的地方

那么怎样给报告中的数据赋予灵魂

让它真正成为对你有帮助的分析呢?

今天我们来详细解读下。

一文扫除困惑

首先什么是16S rRNA?

16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因,长度约为1542bp,其分子大小适中,突变率小,是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。

16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区,保守区序列反映了物种间的亲缘关系, 而可变区序列则能体现物种间的差异。 

16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。

二代高通量测序原理

目前二代测序是一个边合成边测序的过程,使用的是荧光可逆终止子。每个可逆终止子的碱基3’端都有一个阻断基团,而在侧边带有一种荧光。由于有4种不同的碱基(ATCG),因此也会有对应4种不同颜色的荧光。开始扩增每次结合上一个碱基,DNA的扩增便会停止,此时能收到一种荧光信号。然后放试剂除去阻断基团,进行下一个碱基的结合,以此类推得到一连串的荧光信号组合序列。而根据荧光的颜色我们便可以确定每一个位点的基因型,即可以得到这一段DNA片段的序列。

环境样品高通量分析需要重复么?

在进行实验设计前,这是有些小伙伴面临的一个问题。环境样本由于来源和条件不完全可控,每个样品之间会存在很大的差异,即便是相同样本的不同取样时间和部位也会存在一定的差异。

基于高通量测序主要是为了了解样品的菌群构成和功能分析,以及寻找不同环境之间的差异,包括菌和功能基因以及代谢。如果仅做单一样本,很可能结论只能代表这个单一取样样本的信息,无法排除不同样本重复之间的差异,也就可能得不到真正代表环境差异的结果。
所以环境样品不仅要重复而且还应该以分组方式取尽量多的样本以全面的代表一个环境条件下的各种变异情况。

测序区段如何选择

确定做重复后,又面临该怎么选择测序区段的问题。目前市面上有v1-v3区/v3-v4区/v4区等可供选择。

16S rRNA编码基因序列共有9个保守区和9个高可变区。其中,V4区其特异性好,数据库信息全,我们通过大量的测序试验证明用v4区扩增出菌群结果的可以很好的反应样本的菌群结构用于后续的数据建模分析,是细菌多样性分析注释的最佳选择。

基本确定好后,就要着手开始实验,实验完送样又是个问题,以往给测序公司送样往往是低温运输,且不说麻烦,还要提心吊胆怕运输过程会不会有什么问题。为此我们免费提供常温保存取样盒,就不用有这样的顾虑,取样及运输全程都只需要常温即可。

样品到公司之后就更不用操心,全套服务等着呢!

16s分析结果详解

很多小伙伴有过这样的经历,在拿到公司出具的报告之后,仍然一头雾水,几十页的报告内容看着丰富却不知该怎么运用。我们一起来理一下关键图表的含义

OTU是我们要搞清的一个重要概念,可以说是后续分析的基石。

OTU(operational taxonomic units) 是在系统发生学研究或群体遗传学研究中,为了便于进行分析,人为给某一个分类单元(品系,种,属,分组等)设置的同一标志。通常按照 97% 的相似性阈值将序列划分为不同的 OTU,每一个 OTU 通常被视为一个微生物物种。相似性小于97%就可以认为属于不同的种,相似性小于93%-95%,可以认为属于不同的属。样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度都是基于对OTU的分析。

有了OTU这个概念之后,就不难理解下表。对每个样本的测序数量和OTU数目进行统计,并且在表栺中列出了测序覆盖的完整度。

其中 SampleName表示样本名称;SampleSize表示样本序列总数;OTUsNumber表示注释上的OTU数目;OTUsSeq表示注释上OTU的样本序列总数。

Coverage是指各样品文库的覆盖率,其数值越高,则样本中序列没有被测出的概率越低。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。计算公式为:C=1-n1/N  其中n1 = 只含有一条序列的OTU的数目;N = 抽样中出现的总的序列数目。

下表是对每个样本在分类字水平上的数量进行统计,并且在表栺中列出了在每个分类字水平上的物种数目

其中SampleName表示样本名称;Phylum表示分类到门的OTU数量;Class表示分类到纲的OTU数量;Order表示分类到目的OTU数量;Family表示分类到科的OTU数量;Genus表示分类到属的OTU数量;Species表示分类到种的OTU数量。

我们可以看到绝大部分的OTU都分类到了属(Genus),也有很多分类到了种(Species)。但是仍然有很多无法完全分类到种一级,这是由于环境微生物本身存在非常丰富的多样性,还有大量的菌仍然没有被测序和发现。

当然,对这些种属的构成还可以进行柱状图展示:

横坐标中每一个条形图代表一个样本,纵坐标代表该分类层级的序列数目或比例。同一种颜色代表相同的分类级别。图中的每根柱子中的颜色表示该样本在不同级别(门、纲、目等)的序列数目,序列数目只计算级别最低的分类,例如在属中计算过了,则在科中则不重复计算。

我们还需要对样本之间或分组之间的OTU进行比较获得韦恩图:

样品构成丰度

稀释曲线

微生物多样性分析中如何验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性?

稀释曲线(丰富度曲线)可以派上用场。它是用来评价测序量是否足以覆盖所有类群,并间接反映样品中物种的丰富程度

不免有同学有疑惑,稀释曲线怎么来的?

它是利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTU的相对比例,来计算抽取n个(n小于测得reads序列总数)reads时出现OTU数量的期望值,然后根据一组n值(一般为一组小于总序列数的等差数列)与其相对应的OTU数量的期望值做出曲线来。

至此,我们虽然知道了稀释曲线的由来,那么这个五彩缤纷的稀释曲线该怎么看呢?

当曲线趋于平缓或者达到平台期时也就可以认为测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种,增加测序数据无法再找到更多的OTU;

反之,则表示样品中物种多样性较高,还存在较多未被测序检测到的物种。

横坐标代表随机抽取的序列数量;纵坐标代表观测到的OTU数量。样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量。

Shannon-Winner曲线

Shannon-Wiener 曲线,是利用shannon指数来进行绘制的,反映样品中微生物多样性的指数,利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线,以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。 

当曲线趋向平坦时,说明测序数据量足够大,可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息。

横坐标代表随机抽取的序列数量;纵坐标代表的是反映物种多样性的Shannon指数,样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的测序数量。

其中曲线的最高点也就是该样本的Shannon指数,指数越高表明样品的物种多样性越高。

好奇的同学又有疑问,Shannon指数怎么算的?

这里有Shannon指数的公式:

其中,Sobs= 实际测量出的OTU数目;

ni= 含有i 条序列的OTU数目;N = 所有的序列数。

Rank-Abundance曲线

该曲线用于同时解释样品多样性的两个方面,即样品所含物种的丰富程度均匀程度

横坐标代表物种排序的数量;纵坐标代表观测到的相对丰度。

样本曲线的延伸终点的横坐标位置为该样本的物种数量

物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度来反映,曲线越宽,表示物种的组成越丰富;

物种组成的均匀程度由曲线的形状来反映,曲线越平坦,表示物种组成的均匀程度越高。

如果曲线越平滑下降表明样本的物种多样性越高,而曲线快速陡然下降表明样本中的优势菌群所占比例很高,多样性较低。

但一般超过20个样本图就会变得非常复杂而且不美观!所以假如没超过20个样可以考虑该图哦~

Alpha多样性(样本内多样性)

Alpha多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性,常用的度量指标有Chao1 丰富度估计量(Chao1 richness estimator) 、香农 – 威纳多样性指数(Shannon-wiener diversity index)、辛普森多样性指数(Simpson diversity index)等。

计算菌群丰度:Chao、ace;  

计算菌群多样性:Shannon、Simpson。

Simpson指数值越大,说明群落多样性越高;Shannon指数越大,说明群落多样性越高。

看了那么多指数,可能觉得有点晕,到底每个指数是什么意思呢?

当然要解释下咯:

Chao1:是用chao1 算法计算群落中只检测到1次和2次的OTU数估计群落中实际存在的物种数。Chao1 在生态学中常用来估计物种总数,由Chao (1984) 最早提出。Chao1值越大代表物种总数越多

Schao1=Sobs+n1(n1-1)/2(n2+1)

其中Schao1为估计的OTU数,Sobs为观测到的OTU数,n1为只有一条序列的OTU数目,n2为只有两条序列的OTU数目。

Shannon:用来估算样品中微生物的多样性指数之一。它与 Simpson 多样性指数均为常用的反映 alpha 多样性的指数。Shannon值越大,说明群落多样性越高

Ace:用来估计群落中含有OTU 数目的指数,由Chao 提出,是生态学中估计物种总数的常用指数之一,与Chao1 的算法不同。

Simpson:用来估算样品中微生物的多样性指数之一,由Edward Hugh Simpson ( 1949) 提出,在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性。Simpson 指数值越大,说明群落多样性越高。

Alpha多样性指数差异箱形图

分别对 Alpha diversity 的各个指数进行秩和检验分析(若两组样品比较则使用 R 中的wilcox.test 函数,若两组以上的样品比较则使用 R 中的 kruskal.test 函数),通过秩和检验筛选不同条件下的显著差异的 Alpha Diversity指数。

Beta多样性分析(样品间差异分析)

也许我们有听说Beta多样性在最近10年间成为生物多样性研究的热点问题之一。具体解释下:

Beta多样性度量时空尺度上物种组成的变化, 是生物多样性的重要组成部分, 与许多生态学和进化生物学问题密切相关!

PCoA分析

PCoA(principal co-ordinates analysis)是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法,通过一系列的特征值和特征向量进行排序后,选择主要排在前几位的特征值,PCoA 可以找到距离矩阵中最主要的坐标,结果是数据矩阵的一个旋转,它没有改变样品点之间的相互位置关系,只是改变了坐标系统。

重要的是,它是可以用来观察个体或群体间的差异的。

每一个点代表一个样本,相同颜色的点来自同一个分组,两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。

另一种相似的是PCA分析

主成分分析(Principal component analysis)PCA 是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法,通过一系列的特征值和特征向量进行排序后,选择主要的前几位特征值,采取降维的思想,PCA 可以找到距离矩阵中最主要的坐标,结果是数据矩阵的一个旋转,它没有改变样品点之间的相互位置关系,只是改变了坐标系统。

详细关于主成分分析的解释推荐大家看一篇文章,http://blog.csdn.net/aywhehe/article/details/5736659 

一起来看看包含PCoA研究的文章

案例解析

研究背景:全球塑料产量飞速增长,而且呈持续上升的趋势,因此导致大量塑料废物排放到环境中,从沿海河口到大洋环流,从东大西洋到南太平洋海域。塑料废弃物具有化学稳定性和生物利用率低的特点,可长期存在于海洋中,从而影响海洋环境包括海洋生物的生存。

作为一个独特的底物,塑料碎片可以吸附海洋中的微生物并形成个“塑性球”。以生物膜形式存在于塑料碎片上的微生物群落。许多研究表明,无论是在海洋还是淡水生态系统中,附着在塑料碎片上微生物群落的组成明显不同于周围环境(水和沉积物),而且易受位置、时间和塑料类型的影响。

主要图表

两两群落差异指数的PCoA图

PCoA 图可以清楚地看到,SW区细菌群落的置信椭圆与pd和sd的置信椭圆有显著的偏差(p<0.05),而sd上细菌群落的置信椭圆几乎覆盖了pd的置信椭圆(p>0.05),这表明pd和sd上的细菌群落有相似之处。

不同样本和处理下的细菌群落( 前 10 位)丰度分布

底物(SW、SD和Pd)上的主要属为细菌和假互斥单胞菌,暴露两周后,这些菌可能是分布广泛和适应性强的三种底物(SW、SD和PD)。暴露4周后,弧菌相对丰度增加.此外,暴露6周后,自养细菌(如扁平菌和硝酸菌)的数量增加。这三种底物上个细菌群落的生长模式也与3.2的结果一致。图5还显示,在6个星期内,在429个原位点中,假单胞菌在pd上的相对丰度高于sw和sd(anova,p<0.05)。

研究结论:首先,营养物质 (TN 和 TP) 与生物膜的平均生长速率呈正相关,而盐度与生物膜的平均生长速率呈负相关。盐度是影响PD的个细菌多样性的主要因素,而温度、溶解氧和养分(TN和TP)在类似的盐度条件下可能具有二次效应。尽管种聚合物类型对PD上的细菌群落的多样性具有较少的影响,但是在细菌群落中的一些属显示对PD的聚合物类型的选择性,并且倾向于将其优选的基质定殖。大的相对丰度SW、PD、SD间属显著差异。盐度是改变河口地区Pd条件致病菌富集的主要因素。另外,在种病原物种丰富的基础上,PD具有较高的致病性。

NMDS分析(非度量多维尺度分析)

NMDS(Nonmetric Multidimensional Scaling)常用于比对样本组之间的差异,可以基于进化关系或数量距离矩阵。

横轴和纵轴:表示基于进化或者数量距离矩阵的数值在二维表中成图。与PCA分析的主要差异在于考量了进化上的信息

每一个点代表一个样本,相同颜色的点来自同一个分组,两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。

排序分析

PCA,PcoA,NMDS分析都属于排序分析(Ordination analysis)。

排序(ordination)的过程就是在一个可视化的低维空间或平面重新排列这些样本。

目的:使得样本之间的距离最大程度地反映出平面散点图内样本之间的关系信息。

排序又分两种:非限制性排序和限制性排序。

1、非限制性排序(unconstrained ordination)

——使用物种组成数据的排序

(1) 主成分分析(principal components analysis,PCA)

(2) 对应分析(correspondence analysis, CA)

(3) 去趋势对应分析(Detrended correspondence analysis, DCA)

(4) 主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)

(5) 非度量多维尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling, NMDS)

2、限制性排序(constrained ordination)

    ——同时使用物种环境因子组成数据的排序

(1) 冗余分析(redundancy analysis,RDA)

(2) 典范对应分析(canonical correspondence analysis, CCA)

比较PCA和PCoA

在非限制性排序中,16S和宏基因组数据分析通常用到的是PCA分析和PCoA分析,两者的区别在于:

PCA分析是基于原始的物种组成矩阵所做的排序分析,而PCoA分析则是基于由物种组成计算得到的距离矩阵得出的。

在PCoA分析中,计算距离矩阵的方法有很多种,包括如:Euclidean, Bray-Curtis, and Jaccard,以及(un)weighted Unifrac (利用各样品序列间的进化信息来计算样品间距离,其中weighted考虑物种的丰度,unweighted没有对物种丰度进行加权处理)。

LDA差异贡献分析

如果说 PCA,它所作的只是将整组数据整体映射到最方便表示这组数据的坐标轴上,映射时没有利用任何数据内部的分类信息,是无监督的。

那么LDA是有监督的,增加了种属之间的信息关系后,结合显著性差异标准测试(克鲁斯卡尔-沃利斯检验和两两Wilcoxon测试)和线性判别分析的方法进行特征选择。

两者相同点:

  • 都可以对数据进行降维。
  • 降维时都采用了矩阵特征分解的思想。

差异:

1)LDA是有监督学习的降维方法,而PCA是无监督的降维方法。(注:监督学习是从标记的训练数据来推断一个功能的机器学习任务。)

2)LDA选择分类性能最好的投影方向,而PCA选择样本点投影具有最大方差的方向。

除了可以检测重要特征,他还可以根据效应值进行功能特性排序,这些功能特性可以解释大部分生物学差异。这部分希望能详细了解的同学可以参考这篇文章http://blog.csdn.net/sunmenggmail/article/details/8071502 。

  • 不同颜色代表不同样本或组之间的显著差异物种。
  • 使用LefSe软件分析获得,其中显著差异的logarithmic LDA score设为2。

LDA分析究竟能做什么

组间差异显著物种又可以称作生物标记物(biomarkers),这个LDA分析主要是想找到组间在丰度上有显著差异的物种

案例解析

研究背景:研究表明遗传和环境影响都在I型糖尿病的发展中起作用,增加的遗传风险不足以引起疾病,环境因素也是需要的,而且起着至关重要的作用。肠道菌群也许就是这个重要的环境因素,肠道菌群在免疫系统的成熟中起重要作用,此外还影响自身免疫疾病发展。

不同遗传风险儿童的LDA差异菌群

不同遗传风险分组中包含的常见菌属,部分存在特定分组中

PCoA分析揭示不同遗传风险儿童肠道菌群的在不同地域样本中均存在显著差异

点评:针对I型糖尿病疾病发生过程中遗传HLA分型风险和对应肠道菌群菌的关联分析,揭示了特定肠道菌群与宿主特定遗传风险共同作用推进疾病发生。某些特定菌属可能无法在遗传高风险儿童肠道内定植,可能对疾病发生存在特定作用。此外对于其他遗传风险的自身免疫疾病也具有重要提示意义,例如乳糜泻和类风湿性关节炎。

物种进化树的样本群落分布图

这是另一款和LDA长得有点像的图,当然功能可完全不一样。它是将不同样本的群落构成及分布以物种分类树的形式在一个环图中展示。数据经过分析后,将物种分类树和分类丰度信息通过这款软件GraPhlAn进行绘制

(http://huttenhower.sph.harvard.edu/GraPhlAn )。

其目的是将物种之间的进化关系以及不同样本的物种分布丰度最高分布样本的信息在一个视觉集中的环图中一次展示,其提供的信息量较其他图最为丰富。

  • 中间为物种进化分类树
  • 不同颜色的分支代表不同的纲(具体的代表颜色见右上角的图例),
  • 接着的外圈的灰色标示字母的环表示的是本次研究中比例最高的15个科(字母代表的科参见左上角的图例)。
  • 之后的外圈提供的是热力图,如果样本数<=10个则绘制样本,如果样本数超过10个则按照分组绘制,每一环为一个样本,根据其丰度绘制的热力图。
  • 最外圈为柱状图,绘制的是该属所占比例最高的样本的丰度和样本颜色(样本颜色见环最下方的样本名字的颜色)。其中热力图和柱状图取值均为原比例值x10000后进行log2转换后的值。

物种相关性分析

根据各个物种在各个样品中的丰度以及变化情况,计算物种之间的相关性,包括正相关和负相关。

相关性分析使用CCREPE算法

怎么画的?

首先对原始16s测序数据的种属数量进行标准化,然后进行Spearman和Pearson秩相关分析并进行统计检验计算出各个物种之间的相关性,之后在所有物种中根据simscore绝对值的大小挑选出相关性最高的前100组数据,基于Cytoscap绘制共表达分析网络图。

网络图采用两种不同的形式表现出来。

物种相关性网络图A

○  图中每一个点代表一个物种,存在相关性的物种用连线连接。

 ○  红色的连线代表负相关,绿色的先代表正相关。

 ○  连线颜色的深浅代表相关性的高低

物种相关性网络图B

 ○  图中每一个代表一个物种

 ○  点的大小表示与其他物种的关联关系的多少

 ○  其中与之有相关性的物种数越多点的半径和字体越大

 ○  连线的粗细代表两物种之间相关性的大小

连线越粗,相关性越

案例解析

研究背景:气候变化导致美国中部草原的降水模式发生变化,对土壤微生物群落构成及代谢影响很大。

研究希望明确土壤微生物群落对土壤水分变化的反应,并确定响应的特定代谢特征。

主要图表

同一样本在不同水分含量孵化处理下土壤菌群的变化

受到水分条件影响的土壤菌群代谢途径和网络分布

研究结论:土壤干燥导致土壤微生物组的组成和功能发生显着变化。相反,润湿后几乎没有变化。由于干旱导致的土壤水分减少对土壤碳循环和土壤微生物组进行的其他关键生物地球化学循环的影响很大。导致渗透保护剂化合物产生的代谢途径受到较大影响。

点评:

相对简单的样本和实验设计,但是从多个维度探寻支持土壤微生物群落对湿润和干燥表型的反应。

与常见的环境采样检测不同,针对同一样本在对照环境下进行环境控制孵化,然后比较菌群变化可以更为有效的控制背景差异。

聚类分析

根据OTU数据进行标准化处理(1wlog10)之后,选取数目最多的前60个物种,基于R heatmap进行作图

 ○  热图中的每一个色块代表一个样品的一个属的丰度

 ○  样品横向排列,属纵向排列

 ○  差异是是否对样品进行聚类,从聚类中可以了解样品之间的相似性以及属水平上的群落构成相似性

Tips:

如果聚类结果中出现大面积的白或黑是因为大量的菌含量非常低,导致都没有数值,可以在绘制之前进行标准化操作,对每一类菌单独自身进行Z标准化。

案例解析

研究背景:妊娠期糖尿病(GDM)的患病率在全球范围内迅速增加,构成一个重要的健康问题和产科实践的重大挑战(Ferrara,2007)。高脂血症是妊娠常见的合并症。在GDM患者中,血脂的生理变化可能导致怀孕期间潜在的代谢紊乱。肠道失调在宿主代谢异常中起着至关重要的作用,最近关于2型糖尿病(T2D)和肥胖的研究就证明了这一点。这些研究表明,妊娠期间肠道微生物ME的主要变化可能在GDM的发展中起着至关重要的作用。

GDM加高脂血症(M队列)妊娠期间与显著改变的脂质相关的肠道微生物群(属)

研究结论:我们的结果表明,血脂水平可能反映了GDM发展过程中的一些异常变化。所鉴定的多种生物标志物对GDM合并高脂血症的防治有一定的参考价值。

组间物种差异性箱形图

组间物种差异性盒形图描述在不同分组之间具有差异显著的某一物种做盒形图,图中以属水平为例做物种差异性盒形图,展示如下:

 ○  图中不同颜色代表不同的分组,更直观显示组间物种差异

 ○  每一个盒形图代表一个物种,图上方是物种名。

Anosim检验

Anosim分析是一种非参数检验,用来检验组间的差异是否显著大于组内差异,从而判断分组是否有意义

展示如下:

R-value介于(-1,1)之间,R-value大于0,说明组间差异显著。

R-value小于0,说明组内差异大于组间差异。

统计分析的可信度用 P-value 表示,P< 0.05 表示统计具有显著性。

对Anosim的分析结果,基于两两样本之间的距离值排序获得的秩(组间的为between,组内的为within),这样任一两两组的比较可以获得三个分类的数据,并进行箱线图的展示(若两个箱的凹槽互不重叠,则表明它们的中位数有显著差异)

随机森林分类树属分类效果

随机森林是机器学习算法的一种,它可以被看作是一个包含多个决策树的分类器

其输出的分类结果是由每棵决策树“投票”的结果。由于每棵树在构建过程中都采用了随机变量和随机抽样的方法,因此随机森林的分类结果具有较高的准确度,并且不需要“减枝”来减少过拟合现象。

随机森林可以有效的对分组样品进行分类和预测。

物种重要性点图。横坐标为重要性水平,纵坐标为按照重要性排序后的物种名称。上图反映了分类器中对分类效果起主要作用的菌属,按作用从大到小排列。

Error rate: 表示使用下方的特征进行随机森林方法预测分类的错误率,越高表示基于菌属特征分类准确度不高,可能分组之间菌属特征不明显。图中以所有水平为例,取前60个作图。

ROC曲线图

ROC 曲线指受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve), 是反映敏感性特异性连续变量的综合指标,通过构图法揭示敏感性和特异性的相互关系。

ROC 曲线将连续变量设定出多个不同的临界值,从而计算出一系列敏感性和特异性,再以敏感性为纵坐标、(1-特异性)为横坐标绘制成曲线。

曲线下面积越大,诊断准确性越高。展示如下:

FAPROTAX生态功能预测

FAPROTAX是一款在2016年发表在SCIENCE上的较新的基于16S测序的功能预测软件。它整合了多个已发表的可培养菌文章的手动整理的原核功能数据库,数据库包含超过4600个物种的7600多个功能注释信息,这些信息共分为80多个功能分组,其中包括如硝酸盐呼吸、产甲烷、发酵、植物病原等。

FAPROTAX对环境样本更友好

如果说PICRUSt(后续会介绍)在肠道微生物研究更为适合,那么FAPROTAX尤其适用于生态环境研究,特别是地球化学物质循环分析。

FAPROTAX适用于对环境样本(如海洋、湖泊等)的生物地球化学循环过程(特别是碳、氢、氮、磷、硫等元素循环)进行功能注释预测。因其基于已发表验证的可培养菌文献,其预测准确度可能较好,但相比于上述PICRUSt和Tax4Fun来说预测的覆盖度可能会降低。

FAPROTAX可根据16S序列的分类注释结果对微生物群落功能(特别是生物地化循环相关)进行注释预测。

图中横坐标代表样本,纵坐标表示包括碳、氢、氮、硫等元素循环相关及其他诸多功能分组。可快速用于评估样品来源或特征。

基于BugBase的表型分类比较

Bugbase也是16年所提供服务的一款免费在线16S功能预测工具,到今年才发表文章公布其软件原理。该工具主要进行表型预测,其中表型类型包括革兰氏阳性、革兰氏阴性、生物膜形成、致病性、移动元件、氧需求,包括厌氧菌、好氧菌、兼性菌)及氧化胁迫耐受等7类。

Gram Negative 革兰氏阴性菌

Picrust群落功能差异分析

通过对已有测序微生物基因组的基因功能的构成进行分析后,我们可以通过16s测序获得的物种构成推测样本中的功能基因的构成,从而分析不同样本和分组之间在功能上的差异(PICRUSt Nature Biotechnology, 1-10. 8 2013)。

Picrust对肠道菌群样本更友好

通过对宏基因组测序数据功能分析和对应16s预测功能分析结果的比较发现,此方法的准确性在84%-95%,对肠道微生物菌群和土壤菌群的功能分析接近95%,能非常好的反映样品中的功能基因构成

怎么做出来的?

为了能够通过16s测序数据来准确的预测出功能构成,首先需要对原始16s测序数据的种属数量进行标准化,因为不同的种属菌包含的16s拷贝数不相同。

然后将16s的种属构成信息通过构建好的已测序基因组的种属功能基因构成表映射获得预测的功能结果。(根据属这个水平,对不同样本间的物种丰度进行显著性差异两两检验,我们这里的检验方法使用STAMP中的two-sample中T-TEST方法,Pvalue值过滤为0.05,作Extent error bar图。)

此处提供COG,KO基因预测以及KEGG代谢途径预测。当然,跃跃欲试的小伙伴也可自行使用我们提供的文件和软件(STAMP)对不同层级以及不同分组之间进行统计分析和制图,以及选择不同的统计方法和显著性水平。

这里提到的STAMP有些小伙伴说不太了解,别急,后面会有更多介绍。

COG构成差异分析图

图中不同颜色代表不同的分组,列出了COG构成在组间存在显著差异的功能分类以及在各组的比例,此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。

KEGG代谢途径差异分析图

通过KEGG代谢途径的预测差异分析,我们可以了解到不同分组的样品之间在微生物群落的功能基因在代谢途径上的差异,以及变化的高低。为我们了解群落样本的环境适应变化的代谢过程提供一种简便快捷的方法。

本例图所显示的是第三层级的KEGG代谢途径的差异分析,也可以针对第二或第一层的分级进行分析。

图中不同颜色代表不同的分组,列出了在第三层级的构成在组间存在显著差异的KEGG代谢途径第三层分类以及在各组的比例,此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。

案例解析

研究背景:尽管普遍认为肠道微生物组的生态多样性和分类组成在肥胖和T2D中发生改变,但与单个微生物或微生物产物的关联在研究之间不一致。缺乏大样本群体研究,从而确定肠道微生物组,血浆代谢组,肥胖和糖尿病表型以及环境因素之间的几种关联。

主要图表

按照肥胖和糖尿病对人群分为三组,同时进行了16S,代谢和宏基因组的检测。

与肥胖相关的菌属以及代谢途径

研究结论:确定了肠道微生物组,血浆代谢组,肥胖和糖尿病表型以及环境因素之间的几种关联。与肠道微生物组变异相关的主要是肥胖,不是2型糖尿病。存在与肠道微生物组变异相关的药物和膳食补充剂。高铁摄入量影响小鼠的肠道微生物组成。微生物组变异也反映在血清代谢物谱中。

点评:

相对大人群的队列研究,同时涵盖了菌群、代谢和疾病表型以及膳食补充调查的数据。

从结果看菌属和血浆代谢存在关联,但是贡献度都较低,如果样本数量不足很可能找不到显著的联系,这也是这类大样本队列研究的意义。

本研究在人群分组时针对性的研究了肥胖-II型糖尿病和菌群的关联,因而构建了三个主要分组人群,结果显示肥胖与菌群的关联度更大,解释了大部分的菌群差异,而糖尿病的菌群变化较小。

本研究其中较为重要的是发现了不同膳食补充对菌群的影响,并在小鼠实验中得到证实。

基因的差异分析图

除了能对大的基因功能分类和代谢途径进行预测外,我们还能提供精细的功能基因的数量构成的预测,以及进行样本间以及组间的差异分析,并给出具有统计意义和置信区间的分析结果

这一分析将我们对于样本群落的差异进一步深入到了每一类基因的层面。

图中不同颜色代表不同的分组,列出了在组间/样本间存在显著差异的每一个功能基因(酶)以及在各组的比例,此外右侧还给出了差异的比例和置信区间以及P-value。

很多小伙伴总希望能亲自上手做点分析,机会来了!

在获得标准报告后如果希望单独修改分组或对某些组之间进行显著性差异分析,可以使用STAMP软件在自己的电脑上进行数据分析。STAMP提供了丰富的统计检验方法图形化结果的输出。

在使用STAMP之前需要首先准备需要的spf格式文件和样品分组信息表,但是如果数据不会处理,那也很不便。

而在我们的报告中已经将KEGG和KO以及COG的结果文件后经过转换生成了适用于STAMP软件打开的spf格式文件,还有对应的分组信息表文件groupfile.txt。

使用STAMP时的一些相关问题

1、STAMP作图用的原始数据的来源?

STAMP 可以直接使用来自QIIME的biom文件和PICUST的KEGG和ko 文件,groupfile.txt文件的格式为tab-saperated value (tab键隔开的数据)

2、分组问题?

导入数据之后,viewàgroup legend ,在窗口右侧会出现分组栏,根据需要进行分组。

3、Unclassiffied选项中,remain Unclassiffied reads、remove Unclassiffied reads、和use only for calculating frequency profiles 方法的区别?

remain Unclassiffied reads和use only for calculating frequency profiles方法会保留所有的数据,而remove Unclassiffied reads仅仅保留有确定分组信息的数据。

4、Statistical test 中,Welch’s t-test、t-test、white’s non-parametric t-test的区别,各自优缺点?

为了确保统计学意义和准确度和精确性,需要足够多的样本数目,t-test检验可以在最少样本数为4的时候确保高的准确度和精确性。

当两个样本之间具有相同方差的时候,用t-test更为准确,当两个样本没有相同方差Welch’s t-test更为准确。

当样本数目少于8的时候,可以使用white’s non-parametric t-test,该计算时间较长,当样本数目过多的时候不宜使用该方法。

5、Two-group 中 type: one side和two side的区别?

One side 只会显示前一个group与后一个group差异的比例,而two side 两者之间的比例均会显示

6、STAMP在使用时首先打开了一个分析文件,如果新打开一个可能会导致显示错误?

目前版本的STAMP存在一些小问题,一次分析只能使用一个数据文件,如果要打开新的需要关闭软件后再打开。

详细的STAMP使用教程可以参考我们提供的STAMP使用教程。

环境因子分析

冗余分析(redundancy analysis, RDA)或者

典范对应分析(canonical correspondence analysis, CCA)都是基于对应分析发展的一种排序方法,将对应分析与多元回归分析相结合,每一步计算均与环境因子进行回归,又称多元直接梯度分析。主要用来反映菌群与环境因子之间的关系。

RDA 是基于线性模型,CCA是基于单峰模型。分析可以检测环境因子样品菌群三者之间的关系或者两两之间的关系。

○ 冗余分析可以基于所有样品的OTU作图,也可以基于样品中优势物种作图;

○ 箭头射线:箭头分别代表不同的环境因子;

○ 夹角:环境因子之间的夹角为锐角时表示两个环境因子之间呈正相关关系,钝角时呈负相关关系。环境因子的射线越长,说明该影响因子的影响程度越大;

○ 不同颜色的点表示不同组别的样品或者同一组别不同时期的样品,图中的拉丁文代表物种名称,可以将关注的优势物种也纳入图中;

○ 环境因子数量要少于样本数量,同时在分析时,需要提供环境因子的数据,比如 pH值,测定的温度值等。

个性化图表

除以上部分,还可以进行个性化图表定制,像下面这样:

看完以上内容,也许还有不明白的地方,没关系,我们罗列了一些常见的问题。看看有没有你想问的。

答疑小课堂

Q1

原始数据形式以及数据如何上传?

原始fastq格式是一个文本格式用于存储生物序列(通常是核酸序列)和其测序对应的质量值。这些序列以及质量信息用ASCII字符标识。通常fastq文件中一个序列有4行信息:如

第一行:序列标识,以 @开头。格式自由,允许添加描述信息,描述信息以空格分开。

第二行:序列信息,不允许出现空格或制表符。一般是明确的DNA或RNA字符,通常大写

第三行:用于将序列信息和质量值分隔开。以 +开头,后边是描述信息或者不加。

第四行:质量值, 每个字符与第二行的碱基一一对应,按照一定规则转换为碱基质量得分。进而反映该碱基的错误率,因此字符数必须和第二行保持一致。

Fasta格式

fasta是一种基于文本用于表示核苷酸序列或氨基酸序列的格式。在这种格式中碱基对或氨基酸用单个字母来编码,且允许在序列前添加序列名及注释。由两部分信息组成:如

第一行:序列标记,以 >开头,接序列的标识符,序列标识符以空格结束,后接描述信息。为保证分析软件能区分每条序列,每个序列的标识必须具有唯一性。

第二行:序列信息,使用既定的核苷酸或氨基酸编码符号。

数据提交

原始数据(Raw data),常见的是illumina机器产生的fastq文件,这一类文件需要向NCBI的SRA数据库进行提交,SRA是NCBI为了并行测序的高通量数据(massively parallel sequencing)提供的存储平台。完整提交SRA需要一些独立项目的分步提交,包括BioProject、BioSample、Experiment、Run等,每一部分用以描述数据的不同属性。

Q2

如何判断测序质量是否合格?

原始的Tags数据会经过质控、过滤、去嵌合体,最终得到有效数据(Effective Tags)。所以在判断测序质量是否合格时应该从几个方面去判断。

打开文件01_sequence_statistic/sumOTUPerSample.txt

报告里所有的txt打开如果格式不对的话,可以用excel表打开。

其中tags为经质量过滤后能正确overlap包含正确barcode和高质量序列的数据。

Singleton为非完全相同的序列,只要有1个碱基的差异即为不同序列,该值的高低与OUT数量并无直接关系,OTU是以97%的相似度聚类,测序质量较低导致的碱基错误、PCR扩增过程中的碱基错误、菌种内部的多样性以及OTU数量均会影响该数量。

Chimeras为通过与RDP等标准数据库比对分析判断可能由于PCR过程错误扩增导致的嵌合体比例,chimeras%为百分比,一般低于1。

首先判断下机数据tags和有效数据 clean tags 的数据量是否满足测序要求,一般下机数据量达到3万条reads以上满足测序需要,谷禾16s样本的测序深度可以达到10万条reads左右。如果数据量不够则需要重新补测样本。通过观察嵌合体数chimras 和嵌合体所占百分比chimeras%,可以反应出有效序列的转化率,嵌合体的比例越小序列的利用转化率就越高。

根据稀释曲线可以判断测序深度是否达到饱和,如图中曲线都逐渐趋于平缓,就证明样本的测序深度较好,测序深度基本覆盖能测到的该样本所有的物种,测序深度比较好。同时曲线趋于水平纵坐标的高低也能够反映各样本的微生物多样性情况,曲线越高,证明测到的物种种类越多,样本的微生物多样性就越高。

而从该图可以看出,个别样本的曲线未趋于平缓,证明该样本测序深度不够,测序深度未能很好的反映出该样本的完整菌群构成。如果测序数据量更大的的话会检测到更多物种。

Q3

如何了解分组内部的多个样本的重复性以及多样性情况?

观察分组内部多个样本的重复性如何可以从以下几个方面考虑。

首先在各分类水平的柱状图的菌属构成来看

从构成图来看,Flu组和ZW3.7组,组内样本重复性较好。Ctrl组中Ctrl.2明显区别于组内另外两个样本,可以去掉该样本。而ZW3.8组内样本间差异性较大。

比如人体肠道或小鼠肠道样本本身个体差异性较大,菌群结构组成复杂,即便通过不同疾病的分类的样本,但营养饮食、代谢以及环境的影响都会改变肠道菌群的构成,所以有可能组内样本间差异性会比较大。而经过单因素处理的样本组内差异会比较小。

所以在前期实验设计时,尽量选择同一批次相同处理的小鼠或其他样本,避免组内差异的影响。并且要预留好多余的样本,比如组内只有3个样本,如果去掉一个差异性较大的样本,一个分组内只有2个样本,会影响后续组间差异比较,组间差异性比较分析每组要至少要3个样本。

通过beta多样性分析PCA,PCoA,MNDS 也可以大致观察组内样本重复性情况,左图组内样本重复性较好,右图组内样本间差异性较大,两组间的区割不是很明显。

在加圈图的beta多样性分析中,右下角有给出PC1和PC2的P值,小于0.05则差异显著。

Alpha多样性是针对单个样品中物种多样性的分析,包括chao1指数、ace指数,shannon指数以及simpson指数等。前面4个指数越大,最后一个指数越小,说明样品中的物种越丰富。

其中chao指数和ACE指数反映样品中群落的丰富度(species richness),即简单指群落中物种的数量,而不考虑群落中每个物种的丰度情况。指数对应的稀释曲线还可以反映样品测序量是否足够。如果曲线趋于平缓或者达到平台期时也就可以认为测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种;反之,则表示样品中物种多样性较高,还存在较多未被测序检测到的物种。

而shannon指数以及simpson指数反映群落的多样性(species diversity),受样品群落中物种丰富度(species richness)和物种均匀度(species evenness)的影响。相同物种丰富度的情况下,群落中各物种具有越大的均匀度,则认为群落具有越大的多样性。

稀释曲线是利用已测得序列中已知的各种OTU的相对比例,来计算抽取n个(n小于测得Reads序列总数)Tags时各Alpha指数的期望值,然后根据一组n值(一般为一组小于总序列数的等差数列,本项目公差为500 )与其相对应的Alpha指数的期望值绘制曲线。

Q4

不同的样本之间差异大吗?不同分组之间能否用菌群差异来区分?

观察不同分组间差异的大小可以观察随机森林分类效果图。

路径在07_diff_analysis/RF

图中以该分类水平下选取用于区分不同分组间的差异性起到关键性影响因素的物种作为标志物作图。标志物按重要性从大到小排列,图中随机森林值error rate 表示用随机森林方法预测分组之间的错误率,分值越高代表所选取的标志物准确度不高,并不能很好的用于区分各分组,分组差异不显著。分值越低证明分组效果比较好。

上图中的随机森林按照门和属以及代谢途径分别进行分析作图,各自都有单独文件,报告中仅给出了一个图,其他文件需要到目录中查看。可能存在门或属区分效果不佳,但是代谢途径区分效果较好。

随机森林筛选出来的物种是用于区分所有分组的重要标志。分值越高代表该物种用于区分所有组之间的重要性越大。

Q5

二代测序16s 能用普通酶扩增吗?

16s测序主要为了鉴定菌种,通常在做鉴定的时候区分标准是97%,区分亚种和菌株的时候相似度更高。
普通TAQ酶的复制错误率较高,可能在扩增过程中引入错误,这些错配可能导致相似度下降从而分类错误。
一般我们不建议使用普通TAQ酶进行扩增,都选择高保真酶。

Q6

利用16s rRNA鉴定细菌能确定到种上吗?

16s rRNA长度为1.5k多,作为菌种鉴定一般选择相似度97%的标准,相似度超过97%一般定义为同一种菌。


如果是sanger测序获得16s全长的都可以鉴定到种,甚至能区分亚种。有些细菌并不只有1个16s序列,会包含有1-15拷贝的16s序列,所以单一的16s序列鉴定可能会出现偏差。


利用高通量如454或miseq测序一般由于读长的缘故,通常只有300-500多个碱基被测序,所以在物种鉴定上一般比较可靠的是能分类到属,部分能分类到种。


根据我们的经验,不同的样品会有大约10-50的菌能分类到种。利用新的分析方法,我们现在也可以利用16s rRNA的群落多样性高通测序数据进行亚种级别的分析。主要是利用16s中共同变化的SNP位点进行分型。这样可以大大提高菌种的分类精度,尤其是在有些菌株之间表型差异巨大的时候。

Q7

听说光测16s就可能预测基因和功能,是真的吗?

16s序列能够区分菌的种属,但是并不包含这些菌的基因和代谢功能的信息。不过由于我们已经对大量的细菌基因组进行了测序,所以可以根据16s的菌种信息,利用这个菌属已经测序的细菌基因组的基因信息和代谢功能信息来估计每类基因的上限和下限。


所以答案是可以利用16s序列测序来预测菌群的功能基因分布和代谢途径分布情况。
目前主要使用的软件是PICRUSt和新发表的Tax4Fun。


从我们实际分析和实验结果来看,预测的准确性还是很高的,不过和样品有很大关系。像肠道菌群和土壤以及一些致病菌的测序较多,所以预测的准确度较高可以到85-90%以上。一些海洋的菌由于测序的菌较少,预测准确性要差一些。目前发表的文献基本都是用PICRUSt,新的软件还有待验证。

Q8

测16s rRNA能分到亚种吗?不同菌株都有致病性差异光到种不解决问题啊!

16s rRNA如果是使用sanger测序可以细分到亚种甚至有些可以精确区分菌株,但是要看菌种。

如果是高通量测序,目前的常见分析一般以97%为标准,大部分情况只能到属,少部分能区分到种。如果要进一步细分到亚种甚至更小的区分目前是有可能的,我们在使用oligotype一类的方法时可以将相同变化模式的SNP归类,并对原来的OTU进行进一步细分,理论上可以区分到菌株。


不过这种区分不同菌属差异很大,有些可以很理想的区分,主要用来了解在更细分化尺度上菌株构成的地理和时间变化。
仅通过16s高通量测序恐怕不能完全解决菌株致病性差异这种问题,但是通过对常见OTU的进一步深入分析可以提供可能的解释或方向。如果明确了某一特定类型菌株的变化有关,可以采用比如毒力基因或菌株特异性标记等方法详细了解不同菌株的比例和差异。

多项合作成果发表于Nature communications、PNAS、Plant biotechnology journal、DNA Research、Environmental Science & Technology、Plant、cell & environment、Science of The Total Environment 、Gut Microbes 、Frontiers in microbiologyt、Journal of environmental management 等国际著名学术期刊。

近期发表文章目录

  • Li W, Zhang Y, Wu N, et al. Colonization characteristics of bacterial communities on plastic debris, influenced by environmental factors and polymer types in the Haihe Estuary of Bohai Bay, China[J]. Environmental Science & Technology, 2019. 
  • Mao Z, Li Y, Dong T, et al. Exposure to Titanium Dioxide Nanoparticles During Pregnancy Changed Maternal Gut Microbiota and  Increased Blood Glucose of Rat[J]. Nanoscale research letters, 2019, 14: 26. 
  • He Z, Kong X, Shao T, et al. Alterations of the Gut Microbiome Associated with Promoting Efficacy of Prednisone by Bromofuranone in MRL/lpr Mice[J]. Frontiers in Microbiology, 2019, 10: 978. 
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