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健康的人类微生物组

谷禾健康


识别和纠正疾病患者微生物组的重要第一步,就是要了解健康微生物组的特性,及没有明显疾病情况下的许多不同的微生物生态。

我们知道体内DNA的细微差异引起巨大的表型多样性,也就是说大家都能区分彼此。相比之下,人体微生物的宏基因组(微生物在我们体内的总DNA含量)变化更大,只有三分之一的组成基因存在于大多数健康个体中。所以要理解健康微生物组这些差异是重大的挑战。

本文,我们将对以下方面展开讨论分析:

人类对健康人微生物组的理解史;

健康人肠道微生物群的组成和功能;

健康人微生物多样性的范围;

可能的驱动因素,如地理,饮食和生活方式等;

健康微生物群的核心标志;

微生物群的抵抗力,弹性和稳定性;

有助于人类健康和疾病预防的微生物代谢途径和种类;

现代农业与人类健康肠道微生物。

01

健康微生物组

健康” 是指没有任何明显的疾病。

微生物组” 指人体的整个微生物组,但目前大部分可获得的数据描述的都是肠道微生物组,因此这里讨论的许多发现都来自肠道微生物组。

关于健康微生物组,有两种假设:

第一种假设

试图确定在健康个体中普遍存在一组“核心”微生物群,其假设是不存在此类微生物就表明失调。但健康个体之间的生态多样性研究表明,健康人的微生物组本来就有足够的差异,无法支持这样的假设。

第二种假设

健康的“功能核心”:一种代谢和其他分子功能的补充,由特定栖息地内的微生物群执行,但不一定由不同人体内相同的生物体提供。

这样的核心:

可能要作为遗传潜能存在,就像人类基因组一样必须严格,不能编码出严重的有害突变才能健康;

或者可能要在个体内部有良好的表达和调控,以保持健康(也就是说,它必须由RNA转录组编码或以蛋白质或小分子产物的形式存在);

当然也可能是这两者组合。

当然,功能核心:

必须至少包括个体微生物生命所必需的内部管理功能,这些功能必须通过基因组正确表达;

还可能包括特定于人类生态系统中微生物生态位的功能;

可能包括人类细胞无法完成的过程,因此代表了共生宿主与微生物关系的潜在基础。 

核心功能的适应性

健康的微生物组可能会进一步通过其随时间变化表现出来。直白地说,一个健康相关的微生物群必须对外界或内部变化有一定程度的适应性。外界例如饮食或药物等干扰,内部变化例如年龄的改变。

即使某个特定的群落结构提供了所有必要的核心功能,但如果没有这种适应性,就不能长期保证核心功能。

因此,微生物组对压力和干扰的抵抗力及其之后恢复健康功能的能力是表征健康微生物组的潜在特性之一。

02

对健康微生物组的理解不断发展

早期的研究试图通过培养和表征菌的生理特性来确定正常的微生物群,主要在肠道中。这类研究最能突出在实验室环境中生长良好的生物,例如大肠杆菌。这种偏见导致人们认为大肠杆菌是人类肠道微生物组中丰富而普遍的成员。

在1970年代引入了严格的厌氧技术,仅肠道就可以回收300多种细菌。此外,对选择性培养基中标准系列稀释液中活细胞的计数可以对这些物种进行定量。 

对该时代的四项大型研究的总结,研究了141名美国人在不同饮食下的粪便样本,发现拟杆菌(Bacteroides)和厌氧球菌(anaerobic cocci)属细菌普遍存在且数量丰富,而梭菌属细菌则普遍存在,但丰度较低,尽管没有在所有受试者中均观察到单一物种。其他普遍但含量较低的细菌包括双歧杆菌属(Bifidobacterium),真细菌属(Eubacterium),乳杆菌属(Lactobacillus)和链球菌属(Streptococcus),以及兼性厌氧菌如大肠埃希氏菌(Escherichia)。

当时已经有人怀疑,还有大量与人类有关的微生物种类没有被发现,一项研究估计在一个健康的结肠中同时存在大约400种微生物。然而,发现它们也有很多障碍,比如某些微生物的培养要求严格,以及培养所需的劳动密集型性质等。

此外,并不是所有的微生物都可以通过在选择性培养基上单独培养而被很好地区分为物种或菌株。例如,不同种类的高产拟杆菌属特别难以解开。另外,这种关于群落组成的研究甚至更难扩展到非细菌性微生物,例如病毒和真菌,对于微生物含量低于肠道的人体栖息地的研究更加不切实际。需要新方法来研究健康微生物组的这些方面。

DNA测序和荧光原位杂交(FISH)等与传统培养无关的技术现已广泛使用,它们的民主化使微生物样品的DNA含量得以直接研究。使用针对16S核糖体RNA基因的FISH进行的早期研究表明,在西欧队列中,至少三分之二的肠道细菌可归因于大约六个物种/属水平的一组六组细菌:两个拟杆菌,两个梭菌,链球菌 /乳球菌和直肠细菌。从那以后,这被证明是乐观的,甚至在当时,这些样本之间的丰度也观察到了很大的差异(标准偏差为均值的〜60–80%)。

某些直接从样品中直接测序16S rRNA基因的早期努力表明,对应于已知物种的85%至95%的细菌丰度可归因于与拟杆菌,梭状芽孢杆菌XIVa和梭状芽孢杆菌第四类有关的三个细菌群。16S研究还显示,健康人之间以及一个人内紧密联系的生物地理位点(例如粘膜和粪便样本)之间的生物分类组成存在很大差异。然而,在所有这些研究中,当时的大多数(75–80%)序列簇与任何文献记载的物种都不匹配,这解释了以前工作中对多样性的低估很多。

随着数据库的完善和技术的进步,目前16s尤其是在肠道菌群方面分辨率也已经达到很高了,种方面能达到70%以上,40%左右能分到菌株。而且肠道菌群检测远不是检出了每种菌的含量,还需要大规模人群队列和疾病样本的训练以及模型构建,因此16s有其标准化和相对适合的成本,在肠道菌群中还是首选的方案。

此外,大规模并行shotgun测序(高通量测序技术)的出现已基本解决了这种微生物“暗物质”的分类学组成,虽然功能多样性的显著百分比(高达50%)和非参考群体的组成仍有待确定。 

最初的发现印证了人与人之间的巨大差异(甚至在双胞胎之间),但也暗示了存在着所有个体共有的一组微生物基因。 这有助于建立这样一种模式:就好比在每个生物体中保存的管家基因一样,“核心微生物群”可以在功能层面而不是在分类学层面上被定义。

03

历史上微生物群落的变化

人类和人类文明有上千年的变化,人类肠道微生物群也随着饮食的变化而变化。例如,狩猎-采集社会的肠道微生物群落在一年中显示出剧烈的变化,反映了食物供应的变化。此外,在这些社会中,女性和男性成员的微生物群也存在重大差异,女性的微生物群更像食草动物,而男性成员的微生物群更像食肉动物。

从早期文明到现代文明,肠道微生物群的变化也反映了卫生的变化,这在城市和农村社区之间仍然存在。

在过去的几十年里,随着卫生条件的改善、加工食品和药物(尤其是抗生素)的广泛使用,现代生活方式似乎对人类肠道微生物群落的多样性产生了重大影响,总体上减少了其多样性

人们吃的东西对肠道微生物组成的影响要比基因强得多。设想这样两种情况:

没有血缘关系却生活在一起的人(有相似的饮食习惯和生活方式);

生活在不同地方的有血缘关系的人;

后者的微生物组表现出更大的差异。

04

人口规模基准队列

此后,在测序和其他分子测定法的通量和成本效益仍在不断提高的基础上,开展了大规模项目,以表征微生物成分的多样性及其功能潜力。  

2010年,人体肠道基因组(MetaHIT)研究报告了来自124个欧洲成年人(主要是“健康”人群)粪便样本的肠道基因组,当时该序列超过了以往所有微生物组研究的测序量近200倍。

2012年,人类微生物组计划(HMP)报告了对242位来自美国的健康成年人进行16S谱分析的结果,并对139个人的亚组进行了宏基因组测序,结果代表了分布在五个主要身体区域之间的18个身体栖息地。一项针对2型糖尿病的大型中国研究很快贡献了145个肠道宏基因组,其中大约一半来自非糖尿病对照组。此后,MetaHIT协会继续发布来自欧洲成年人的新的肠道宏基因组。

人类微生物组群项目(HMP)和人类肠道宏基因组学(MetaHIT)倡议是第一个定义健康人体微生物组组成和功能的大型微生物组项目。这些努力为了解宿主相关微生物群落的生理和功能特性提供了基础。

随着新一代测序、全基因组鸟枪测序、全球代谢组学、先进的计算策略以及人性化动物模型和基于培养的人类类器官系统等新技术的出现,对微生物组的理解正在迅速进步。

05

微生物组的典型组成和多样性

健康的肠道菌群因为个体差异较大,很难有一个精确的定义,但通过大量人群样本数据的了解我们可以明确什么样的肠道菌群是不健康的。

# 多样性

首先从多样性的角度,一般除了2岁以下婴幼儿,大部分的健康人的肠道菌群构成大概有200~2000种菌,如果数量过低或过高都不算健康。过低表明饮食结构过于单一或经历了抗生素等处理。过高表明可能出现了很多不属于肠道环境的菌。

# 核心肠道菌群的占比

另外主要从核心肠道菌群的占比来评估。健康的肠道菌群虽然构成多样,但是存在一部分核心的肠道菌群,它们是肠道菌群的基石,如果这些菌的占比不足30%表示肠道菌群环境已不由这些健康菌占主导,很可能为病原菌提供生存环境。

这些核心的肠道菌群包括:

拟杆菌属(Bacteroides)

柔嫩梭菌属 (Faecalibacterium),

普雷沃氏菌属 (Prevotella),

瘤胃球菌属 (Ruminococcus);

此外, 粪球菌属(Coprococcus),Blautia,

Dorea,毛螺菌属(Lachnospira)

罗氏菌属(Roseburia)也属于常见菌属,但占比通常不会很高。

在婴幼儿的肠道菌群中核心菌包括:

双歧杆菌属(Bifidobacterium),韦荣氏球菌属(Veillonella),通常2岁以下婴幼儿的肠道菌群这两种菌一般至少占比30%以上。

如果你的肠道菌群构成中基本见不到这些核心菌或占比很小,那么肠道菌群很可能已经出现问题。

古细菌,病毒,真菌和其他真核生物

古细菌

人类微生物组除了我们关注最多的细菌外,还包括古细菌,病毒和真核生物。在健康的人类微生物组(主要是肠道)中,已鉴定出少量古细菌属。其中产甲烷菌属在肠道中最多,特别是史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)非常适合人类肠道,可优化其他微生物对膳食多糖的消化,并在常见肠道细菌(如多形拟杆菌,Bacteroides thetaiotaomicron)存在的情况下适应其基因表达。

病毒

人类的病毒特别广泛是健康人类生态系统不可或缺的一部分。病毒有高变特性,因此每个人都有一个独特的病毒,主要由噬菌体组成(估计有5%的肠道细菌基因编码原噬菌体蛋白)。噬菌体还提供了另一种途径,在其他亲缘较远的细菌之间进行水平基因转移。由于古细菌,病毒和真核生物的分子谱分析技术仍不及细菌,这些生物的分子功能信息仍然有限。

真核微生物

在人体中发现的最著名的真核微生物(主要是真菌和原生生物)虽然通常是致病菌,但此类真核生物在健康人群中也普遍存在,特别是念珠菌(Candida),马拉色菌(Malassezia) 和Saccharomyces。

不同部位的相互作用至少负责健康微生物组的部分生态和免疫平衡。例如,在皮肤生化环境中细菌和真菌之间存在明显的竞争,或是乳酸菌控制肠道和阴道真菌。

人类与真菌之间存在直接的相互关系:其中最典型的特征是益生菌(Saccharomyces boulardii),最初是为了对抗霍乱而分离的。一些原生动物甚至是健康微生物群落的常见物种,变异比细菌更大。此外,某些原生动物的存在,例如常见的芽囊原虫属Blastocystis,与降低胃肠道疾病的风险有关。

健康微生物组的地理变异

对比来自不同国家的肠道微生物组的研究,已经确定了微生物组成的系统差异。比较欧洲的MetaHIT,美国的HMP和中国的糖尿病队列这三大块,发现国家间的生物分类组成差异大大超过了个体间的差异,这不止是由于技术差异或者实验方法造成的,地理学因素也是微生物组大规模变化的原因之一,包括北美和南美,欧洲和非洲,韩国和日本以及俄罗斯和中国的农村和城市人口之间的差异。

在这种变化的可能驱动因素中,主要因素是饮食,以及其他因素,包括地理,早期生命暴露和遗传等。还没有一项研究表明健康微生物群大量种群间差异的原因是这些因素其中的任何一个。

有意思的是菌株水平上也存在地理差异,特别是当菌株特征比微生物丰度曲线表现出更大的时间稳定性。该领域的研究是初步的,但表明国家或大洲之间的菌株差异不是特别明显。诸如拟杆菌属(Bacteroides coprocola)和普雷沃氏菌(Privotella copri)之类的物种在跨越人群的抗生素抗性基因中表现出最大的差异和菌株水平变异。

06

健康标志(核心功能)

虽然在所有地点的微生物组的分类组成中有巨大的个体间差异,但在一个特定地点,个体间代谢途径的丰富程度相当一致。

此外,微生物组的组成在生命的最初几年发生了巨大的变化,但这种功能性特征在生命早期就已经建立,并在此后保持稳定,至少在肠道。这表明,“核心”健康微生物群的一个定义是,它们的组合、代谢模块和调节途径共同促进了与宿主相关的稳定生态。

这个核心包括至少三类功能

第一,也是最简单的,所有微生物生命所必需的管家功能,例如转录和翻译、能量生产和结构成分。

第二,这一核心包括人体相关的微生物群在身体部位的特定过程,如与宿主细胞表面的黏附,以及与宿主与微生物相互作用有关的化合物的产生(包括必需的维生素,如维生素K和免疫刺激化合物)。

第三,不同的身体栖息地各有其特殊的核心功能。例如,在肠道中,核心功能包括糖胺聚糖的生物降解、几种短链脂肪酸的产生、特定脂多糖的富集以及维生素和必需氨基酸的产生。在一个特定的人群中,哪种功能趋于丰富,会受到长期的选择压力(如饮食)的影响。

健康微生物群的另一个标志是生态系统的恢复力。

07

微生物群的抵抗力,弹性和稳定性

从微生物生态学角度来看,健康的其他标志是抵抗干扰(可能是由于病原体进入,饮食或药物治疗而引起)以及随后恢复健康状态的能力。这些特性分别被称为阻力和回弹力。

系统在冲击(阻力)期间持续存在的能力以及在干扰影响(恢复)后恢复到基线的能力决定了整体的弹性。从概念上讲,下图对此进行了说明。

S. K. Dogra et al., Front. Microbiol.2020

例如,经过抗生素治疗后,健康的肠道菌群通常会在几周到几个月后恢复到以前的状态。因此,微生物健康的最新定义明确地不包括单一静态,而是动态平衡

原生状态、扰动、回到原始状态或过渡到新状态概念图解

S. K. Dogra et al., Front. Microbiol.2020

一个有弹性的微生物群在受到扰动后将恢复到原来的平衡状态,而非弹性微生物群将转向一个改变后的新状态。

在这种观点下,健康的微生物组相当于潜在动力系统的吸引子。吸引子同时捕获抵抗力和弹性,因为系统将抵抗吸引者的偏离,并且除非波动(可能是由于外部扰动或内部随机性引起的)足够大,否则它将倾向于返回到稳态区域。

Lloyd-Price et al. Genome Medicine (2016)

人类微生物组中最明显的例子可能是健康阴道中的群落状态类型之间的转换。不是所有菌群类型都具有相同的稳定性。肠道微生物组也在不断变化,随着时间的流逝而增加和减少物种,不同的分类单元具有不同的稳定性,并且某些微生物在肠道中持续存在多年

特定分类群持续存在的机制还不明确,但是有趣的是推测这种机制是否可能与微生物组组装背后的驱动原理有关。如果特定的群落确实主要是为了组装来填补一组适合栖息地的功能生态位,那么在特定的组装中提供关键的代谢,信号传导,免疫调节或其他作用的物种可能比功能外围的物种在时间上更稳定。

因此,动力学与微生物组的分类学多样性和巨大的分子功能潜力之间的耦合,提醒了人类微生物组的复杂性,因此也难以定义简单的微生物健康概念。

08

现代农业与人类健康肠道微生物

植物和人类微生物群是相互关联的。

健康土壤,健康植物与健康肠道微生物

人类的肠道微生物群和植物的土壤和根茎微生物群在相似的环境条件下存在

Heribert Hirt, EMBO Reports (2020)

最近的研究表明,根部和肠道微生物群落的存在条件相似。

两者都是开放系统,其特征在于氧气,水和pH的梯度会产生多种不同的生态位。 

两种系统都从环境中继承其微生物物种:分别是人类的食物和植物的土壤。植物和肠道系统由大量相似的细菌门组成(Firmicutes,Bacteroidetes,Proteobacteria,Actinobacteria

与人类粪便转移类似,从抑制疾病的土壤中移植有益微生物可以保护植物免受各种疾病的侵害。

 对不同的哺乳动物食草动物和食肉动物的研究表明,肠道微生物组从食用原始植物材料中吸收纳入了一些成员。

根与肠微生物合成必需的氨基酸,维生素和许多其他调节其宿主免疫系统的次生代谢产物。

因此,植物和肠微生物群可以被视为对宿主健康至关重要的代谢器官

植物微生物群对人体肠道微生物群的直接和间接影响

Heribert Hirt, EMBO Reports (2020)

饮食与微生物组

西方饮食中肉类消费量增加,蛋白质的高输入也极大地影响了肠道微生物组,某些微生物会抑制有益菌并改变我们的饮食习惯,以偏爱更不健康的食物。

人类少数必需化合物是由微生物产生的,微生物本身是必需氨基酸和维生素的重要生产者。例如,钴胺素(维生素B12)不能由植物或动物产生;它是由植物微生物群或反刍动物肠道中的微生物合成的。

土壤、气候对菌群的影响

土壤侵蚀和气候变化也影响微生物多样性,并导致大面积耕地及其微生物群的损失。因此,今天的作物缺乏许多重要的共生菌来生产或增加维生素、矿物质、抗氧化剂和其他对植物和人类健康有益的代谢物。

农药对菌群的影响

大量研究表明许多常用农药对人体健康的负面影响。例如,大多数铜基杀真菌剂对固氮细菌具有有害作用。

许多新鲜水果,蔬菜长期保存和运输用到农药,这些化学物质不仅会通过食物进入人体肠道,还会杀死植物微生物。

除草剂——草甘膦杀灭杂草,确保作物高产。然而草甘膦对人类的急性毒性较低,但草甘膦对于人类而言是潜在的致癌物质。草甘膦对土壤、植物和肠道有益微生物的抑制浓度远低于致病微生物。就人体肠道微生物组而言,对有益菌双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)以及肠球菌属的抑制作用比致病菌梭状芽孢杆菌和沙门氏菌的抑制作用大

农业抗生素影响微生物组

农业使用的抗生素大约是人类医学的四倍。 

在农场中滥用抗生素来促进牲畜的生长,这极大地促进了耐药细菌的出现; 

动物排出的抗生素会改变微生物的功能和土壤,水道及其他生物群落的组成;

食用抗生素处理过的动物的肥料施肥的田地上的新鲜农产品的消费可以将抗性基因传播到人类肠道微生物组,并进一步出现具有多重耐药性的人类病原体。

09

总  结

人体胃肠道微生物组对于维持人体健康至关重要。鉴于健康个体中微生物群落结构的复杂性和多样性,目前可能难以界定基线“健康”微生物群的特征属性。随着人类微生物组研究取得了技术进步,需要利用大样本人群来确定这个边界以及哪些关键因素会影响和塑造肠道微生物。重要的是更好地了解数万种不同微生物物种在与宿主之间的复杂相互作用网络中的功能和作用。

此外,减少肥料,杀虫剂和除草剂的使用量提供健康的绿色食品有助于人类建立和维持健康的肠道微生物组。因此,有关微生物群落对宿主代谢和健康的整体作用的研究不应仅仅停留在人体肠道微生物组上,而应扩展到植物的微生物群及其在植物生长发育中的功能。

参考文献:

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​S. pneumoniae (or pneumococcus,肺炎链球菌)是中耳炎、细菌性脑膜炎、败血症和社区获得性肺炎的主要病因。世卫组织将肺炎链球菌列为一种抗生素耐药的“优先病原体”。

肺炎链球菌是下呼吸道感染的主要原因之一,每年在全世界造成近100万儿童死亡。肺炎链球菌在人类宿主中占据不同的生态位,导致共生和致病性存在。侵袭性肺炎链球菌疾病是一个多步骤的过程。它是通过肺炎链球菌渗透进入富含糖的粘液层,然后粘附到人鼻咽的上皮细胞层而引发的。通常,微生物在鼻咽中定殖较长时间而不会引起疾病。

另外,由于未知的原因,它可以扩散到中耳,肺,大脑或血液中。直接从鼻咽或最经常通过肺部进入血液,可以进入中枢神经系统,心脏和脾脏。在所有这些组织中,肺炎链球菌都受到免疫系统和各种环境条件的攻击。

刚刚,来自美国宾夕法尼亚州匹兹堡卡内基梅隆大学生物科学系的一篇综合评论文章题为:“The pneumococcal social network” 综合阐述了人类致病菌肺炎链球菌分泌肽的机制和功能特点。讨论了三大类小肽的序列特征、转运机制和受体:双甘氨酸肽、Rap、RGG、NprR、PlcR和PRGX(RRNPP)结合肽,以及含羊毛硫氨酸的小肽。强调影响携带和致病的因素,特别是遗传多样性、微生物竞争、生物膜发育和环境适应。

注:羊毛硫氨酸是一类结构独特的肽类,因其序列中含有羊毛硫类非常规氨基酸而得名。

革兰氏阳性细菌使用一系列分泌肽来控制种群水平的行为,以响应环境提示。最近肺炎链球菌多肽研究的扩展揭示了一个相互作用的信号系统的复杂网络,其中多个多肽被整合到同一信号通路中,允许多个进入该通路的点,并向新的方向扩展信息内容。

此外,由于多肽存在于细胞外环境中,因此存在串扰、群体感应(QS)以及株内、株间和种间相互作用的机会。关于人群行为导致疾病的方式的知识为设计和开发抗感染策略提供了一条途径。

社会行为在生物体内广泛存在。蚁群的形成、蝗虫的协调运动和鱼类的浅水化都是复杂的社会行为例子。这些行为通过保护人们免受捕食、增加食物供应或比竞争对手具有战略优势而受益。细菌也不例外。

细菌执行群体感应(QS):细胞密度相关的信号传导,导致群体水平的反应。QS的早期证明是在海洋细菌fischeri弧菌中,高细胞密度诱导生物发光,这是细菌与鱿鱼共生关系的一部分。从那时起,细菌群的行为就被牵涉到细胞过程中,比如基因转移、运动、抗生素的产生和生物膜的形成。

细胞-细胞间的通讯是由供体细胞分泌到细胞外环境中的信号分子来协调的,并由产生细胞和邻近细胞感应到。感知导致基因表达的变化,最终触发同步的群体行为。这种细胞-细胞通讯的核心是通过自体诱导剂-2(AI-2)和肽发出信号。

肺炎链球菌细胞间通信系统的总体分类

肺炎链球菌细胞-细胞通信系统可根据肽序列、转运蛋白和受体分为3大类(图1)。这些是(1)双甘氨酸肽,(2)与QS蛋白RRNPP超家族相关的肽,(3)含羊毛硫氨酸肽。从它们的作用来看,肽介导的细胞-细胞通信系统至少履行了三个主要功能:确保遗传多样性、微生物竞争和环境适应。

图1 肺炎链球菌分泌肽的三大类示意图

双甘氨酸肽

最具特征的肺炎链球菌双甘氨酸肽是能力刺激肽(CSP)。其他例子包括细菌素诱导肽(BIP)、感受态诱导细菌素(Ciba和CibB)、细菌素免疫区的肽(BIR)、毒力肽1(VP1)、感受态诱导的生物膜调节肽(BRIC)、RTG位点的肽和LANA(表1)。此外,比较基因组学方法已经揭示了额外的双甘氨酸肽,这些多肽还有待鉴定。

表1:核糖体合成肽在肺炎链球菌中的实验研究

双甘氨酸肽的特征是保守的N末端前导序列,该序列终止于Gly–Gly残基(或更常见于Gly–Ala或Gly–Ser)。前导将这些肽引导至含有肽酶的ATP结合盒(ABC)转运蛋白(具有C39肽酶结构域),其可切割前导序列并将肽输出到细胞外。  CSP和BIP的基因座分别编码同源的输出蛋白ComAB和BlpAB。移码突变使BlpAB在大约60%的菌株中失去功能。

QS蛋白的RRNPP超家族的肽

该组中的肽通过与它们的同源细胞质转录因子直接相互作用而发出信号,它们是RRNPP超家族的成员(图1B)。如前所述,这些肽可以基于多种序列特征进行分类。在肺炎链球菌中,已经鉴定了短疏水肽(SHP)SHP144,SHP939,SHP1518和RtgS,以及磷酸酶调节剂(Phr)肽PhrA和PhrA2。

在整个链球菌中,糖基转移酶(Rgg)蛋白质的调节基因与它们的同源SHP结合后被激活,后者通常在rgg基因附近编码。  SHP仅在出口后才有活性,这是由通常短于35个残基的前体多肽加工而成的。尚未在肺炎链球菌中研究加工蛋白酶,但在其他链球菌物种中,膜结合金属蛋白酶(Eep)有助于加工。 

多种链球菌物种通过ABC转运蛋白PptAB出口SHP,其粪便肠球菌的同源物出口性信息素。在缺乏已知靶序列的情况下,将SHP引导至其转运蛋白的机制仍不清楚。成熟的肽通过寡肽渗透酶系统重新导入细胞,在那里它们与同源的Rgg调节剂相互作用,从而改变细胞的转录状态。

在肺炎链球菌中,RtgS是唯一显示其前体肽由PptAB出口并由Ami寡肽进口商AmiACDEF内化的SHP。鉴于PptAB在物种间的广泛功能,其他肺炎链球菌SHP可能利用相同的机制进行进出口。

含羊毛硫氨酸肽类

这是由革兰氏阳性细菌产生的一族小肽(19-38个氨基酸),具有各种结构和功能。这些是环状肽,其特征是翻译后修饰,导致硫醚氨基酸、羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸的引入(图1C)。当前肽中的丝氨酸或苏氨酸残基脱水并与半胱氨酸硫醇连接时,它们的特征结构由LanM修饰酶形成。该肽通过专用的LanT转运蛋白输出。许多含羊毛硫氨酸的肽形成细菌素的两大类中的一种。

这些肽被称为羊毛硫氨酸抗生素或羊毛硫氨酸的抗生素。用于加工羊毛硫氨酸的肽,修饰酶,免疫蛋白和转运蛋白的基因通常以簇的形式组织。肺炎链球菌中有许多这样的簇。其中,已经研究了与Tpr / Phr和肺炎链球菌素簇相关的瘦肽。

肺炎链球菌细胞间通信系统的功能属性

肺炎链球菌肽介导的细胞-细胞通讯系统提供多种功能,而不是相互排斥。细胞-细胞通信系统可以被概念化为控制种群水平结构和行为的电路。

许多细胞-细胞通讯回路对不同的环境刺激作出反应,如菌群密度、营养状况、pH值、氧气供应和抗生素压力。来自细胞-细胞通讯系统的信号在群体水平的变化中表现为聚合。这些可能会影响生物膜的发育或与细胞表面成分的改变有关,如膜成分和胶囊表达

细胞-细胞通讯系统的行为也可能伴随着DNA摄取、自残或杀菌能力的改变。这些生理变化可能改变细胞获得抗生素抗性基因的倾向,并影响疫苗逃逸株的出现。

此外,细胞间通讯系统还可以调节宿主基质的降解、生物膜的发育和营养吸收能力。因此,这些特性共同影响致病潜能、抗生素耐药性和对疫苗的反应

调节群体反应的能力为肺炎链球菌细胞提供了相对于居住在鼻咽的其他微生物物种的竞争优势。细胞间的通讯系统使微生物能够改变其转录模式,以获得合适的表型,从而优化种群水平的适应性。它能在DNA水平和转录水平上引入多样性,从而能够长期维持鼻咽部的共生生活方式,在无症状时期,肺炎链球菌在高度可变的生物膜中被发现。

此外,一般来说,“转录适应”不仅有助于在动态的鼻咽中存活,而且在感染期间微生物从一个宿主生态位迁移到另一个宿主生态位时也能促进存活。

遗传和表型多样性的产生

检测到CSP双甘氨酸肽家族的典型代表就会被激活。肺炎链球菌泛基因组拥有comC的6个不同等位基因,其中大多数菌株编码2个等位基因变体中的1个。在混合种群中,能力不仅在空间上局限于生物膜内的某个区域;信号可能局限于单个的信息类型(框1)。CSP是由高细胞密度、pH值增加、氧利用率和抗生素压力等因素引起的。

除了在环境中扩散外,CSP还通过其他机制(包括自分泌信号和细胞-细胞接触)向邻近细胞发出信号。激活会导致一个菌株的10%的基因发生转录变化。最典型的反应是激活转化机制,允许通过重组将外源DNA纳入,并且在这样做的过程中,通过等位基因的交换和基因拥有量的变化来促进遗传多样性的产生(图2)。

全基因组内遗传物质的交换测试了新颖的遗传组合,其中单个等位基因或基因片段已经克服了通过选择修剪的问题。

图2  多个双甘氨酸肽的分级活化

微生物竞争

种内和种间竞争是呼吸道肺炎链球菌生活方式的一部分。杀菌活性通过双甘氨酸和羊毛硫氨酸的肽家族中的小分子产生。限制竞争者生长的能力对于细菌定殖很重要。此外,受害者可能成为DNA的来源,增加了进化的可能性。

能力激活导致许多这些效应分子的产生,包括CibAB和BIR基因座。双甘氨酸肽CibAB引发异源分解或反式裂解,并以细胞接触依赖性方式负责非功能细胞的裂解。与乳酸乳球菌IFPL105相似,据信这种杀微生物剂是通过将细菌素插入敏感细胞的膜中而导致其细胞能量消耗而产生的。

此后,细胞壁水解酶(包括自溶素LytA,溶菌酶LytC和莫林蛋白酶水解酶CbpD)的作用引起裂解。跨膜肽CibC保护细胞免受CibAB的同素分解作用。  CibAB从非感受态细胞释放的营养物质和DNA可能会使攻击细胞受益。在定殖的鼠模型中,CibAB诱导的同素分解作用使常驻菌株具有通过入侵菌株抵抗竞争和定殖的能力。

IR编码多种效应基因,赋予其抑菌作用或抑制作用的免疫力。  BIR基因座是同系的,但细菌素(假定的和特征的)和免疫蛋白在不同菌株之间差异很大。blpIJ,blpMN和blpK的产品已证实具有杀菌活性。这些是双甘氨酸肽,由BlpAB输出,并与同源免疫蛋白共转录。所有这些肽都显示出菌株间的活性,并且在体内,BlpMN和BlpIJ细菌素在定植过程中提供了比免疫缺陷型菌株更具竞争优势的菌株

除肺炎链球菌外,细菌素基因座的表达还抑制了一些其他革兰氏阳性细菌,包括化脓性链球菌,链球菌性微生物,口腔链球菌和乳酸乳球菌,但不抑制其他细菌,例如变形链球菌,粪肠球菌或单核细胞增生李斯特菌

BIR基因座的表达是由BIP诱导的,BIP由blpC和BIR的上游编码。与CSP相似,BIP结合膜结合的组氨酸激酶(B1pH),并且在肽及其受体之间具有特异性。这种特异性限制了竞争性表型之间的串扰。与能力途径的激活相似,BIP的表达是由抗生素诱导的,并且会增加pH值。而且,在能力和细菌素系统之间存在串扰,其中BIP的产生是在CSP刺激后诱导的。

另一类细菌素是羊毛硫氨酸的肽,其特征是肺炎链球菌素(pld)。pld基因座在肺炎链球菌分离株中很少见,其特征是有4个串联推定的短肽同源物(PldA1-PldA4)。这4种肽中的3种PldA1-3对细胞的杀菌活性是必需的,而第4种肽PldA4对于该表型是必不可少的

除具有杀菌特性外,肺炎链球菌素(PldA1-3)还可作为自动诱导信号肽,通过位点(pldK)中编码的组氨酸激酶进行信号传导,从而激活pld位点。免疫是由邻近的ABC运输商PldFE授予的。这些肽的信号传导和杀菌作用是相互联系的:当Pld肽的信号传导低时,PldA2不会诱导细菌抑制作用。另外,肺炎链球菌素在小鼠定植过程中为肺炎链球菌菌株提供了竞争优势。

最后,全面的比较基因组筛选揭示了许多其他肽,它们在肺炎链球菌菌株之间分布不同(从稀有到核心),而且是肺炎链球菌特有的或在链球菌种之间共有。许多细胞与推定的转运蛋白,修饰蛋白或免疫蛋白一起组织成操纵子。肺炎链球菌菌株和相关物种内的多样性分布与种内和种间微生物竞争中的作用一致。

细胞间通信系统对环境适应的影响

肺炎链球菌有一个细胞间通信系统网络,可调节其对宿主环境的适应性。肺炎链球菌只能使用糖来产生其代谢能。此外,糖被用于胶囊生产和信号传递。此外,通过磷酸转移酶系统(PTS)转运糖可以触发磷酸化依赖性信号通路。此外,宿主糖的降解不仅是营养的来源,而且还是宿主粘附,定植和致病性的主要因素。

几种细胞间通讯肽的表达对宿主碳水化合物的水平有反应:甘露糖和半乳糖诱导SHP144和SHP939,半乳糖诱导PhrA。另外,这些肽以及PhrA2和VP1在丰富的培养基中被阻遏。Rgg144 / SHP144系统是核心。当自诱导肽SHP144导入细胞并结合Rgg144时,它被激活。Rgg144受主要营养调节剂CodY和谷氨酰胺/谷氨酸代谢的负面控制。

SHP939是一种正向调节Rgg939的自诱导肽。该系统是辅助基因组的一部分。  Rgg939 / SHP939调控的基因多样性随环境条件的变化而变化,当在甘露糖上生长时具有广泛的调节子,而在半乳糖中则具有有限的调节子。

Rgg系统并非孤立运行,而是看起来形成了一个连接的网络。因此,为了最大程度地诱导SHP144和SHP939,需要存在非同源Rgg调节剂。此外,Rgg1518控制其邻近基因座(SPD_1513–1517),这些基因也受Rgg144和Rgg939调控。这种串扰可能会超出物种的范围。  SHP939的序列与化脓性链球菌中发现的SHP3的序列相同,无乳链球菌和米氏链球菌中的SHP序列相差1个残基。SHP序列的相似性可能使肺炎链球菌Rgg系统受到其他常驻细菌的影响。

类似于TprA / PhrA,PhrA2与TprA2相互作用,导致TprA2调节子的阻遏并诱导紧靠下游的羊毛硫氨酸肽(LcpA)的表达。有证据表明TprA2 / PhrA2与TprA / PhrA系统之间存在单向串扰(图3)。

图3 如PhrA和PhrA2所示的肽串扰示例

观点与结论

肺炎链球菌所编码肽的多样性凸显了群落水平表型在引入遗传多样性、微生物竞争和环境适应方面的重要性。一些研究证实了细胞间通讯在肺炎链球菌毒力中的作用。需要更多的研究来绘制这些系统在感染过程中的时空表达

上呼吸道是许多细菌物种的常住栖息地。为了在宿主环境中立足,肺炎链球菌细胞必须在竞争中生存并抵抗住其他寄居物种的挑战。肺炎链球菌产生大量的肽,直接或间接地通过激活下游分子(例如,由CSP激活CibAB或CbpD)介导杀菌活性。虽然其中一些细菌素已被鉴定,但许多假定细菌素有待功能鉴定,尤其是在目标菌株/物种和刺激其合成的环境条件下。

多种肺炎链球菌肽与生物膜形成有关,包括CSP、BriC和VP1。生物膜在运输和疾病中起着关键作用。载体包括一种生物膜生长模式,它本身能够实现局部细胞-细胞通讯(通过肽和AI-2)和吸收生物膜基质中提供的DNA。

此外,生物膜为表型异质性提供了一个平台,这是一个未被充分研究的课题,可能有助于肺炎链球菌适应慢性感染和适应宿主生态位。生物膜促进发病。它们不仅是细菌传播的场所,而且从生物膜中传播的细菌比它们的生物膜或浮游生物具有更强的毒性

综上所述,肺炎链球菌信号肽和生物膜紧密相连:生物膜中的局部环境可能促进细胞-细胞通讯的条件,而肽会影响生物膜的发育和向其他组织和新宿主的扩散。

肽对调控网络的控制使肺炎链球菌不仅在单个细胞水平上,而且在整个群体水平上对其环境作出快速反应。系统间的串扰和由多个肽对一条通路的调节使不同的信号得以整合,可能会增加反应的动态性和复杂性。研究表明,多链肺炎链球菌共定植是一种相对常见的现象,突出了跨菌株肽交换的重要性。PhrA2和PhrA存在串扰(图3)。

来自同一家族或不同家族的肽可以在同一途径中发出信号。例如,通过CSP的信号转导可诱导多个双甘氨酸蛋白,而SHP144诱导VP1(一种双甘氨酸肽)的水平。这种肽激活的层次结构描述了生物途径激活的多个入口点的存在。这表明这些途径的激活是严格控制的,代表了相关但不同的可能性。

一种可能性是,不同的信号组合允许诱导整个通路或通路的一部分,提供与反应相关的类型、幅度和代谢成本的粒度。或者,当遇到合适的条件时,细胞可以激活肽信号,为诱导下游通路做好准备。

抗生素耐药性是一个全球性的公共卫生问题,因此迫切需要开发有效的抗感染药物。非抗生素抗感染药物有望减少抗生素耐药性的出现。开发破坏细胞-细胞通讯的化合物的不同策略包括抑制信号产生、信号降解或阻断信号转导。在化脓链球菌和其他一些链球菌中,化合物的使用会破坏Rgg/SHP信号传导,从而破坏生物膜的形成。在肺炎链球菌中,使用竞争性类似物可以抑制能力发展和水平基因转移。此外,以可溶性LMIP形式靶向PhrA肽的抗感染药物可降低肺炎链球菌介导的小鼠发病率。不同的抗感染药物是如何影响细菌适应度和促进耐药性发展的,还有待检验。肺炎链球菌细胞间通讯系统的多样性为探索不同的可能性提供了许多机会。对肺炎链球菌群体水平表型的研究为开发新的抗感染靶向肽介导系统以及这些系统调控的途径提供了机会。

参考文献:

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革兰氏阳性菌的详细分类及特征

谷禾健康

细菌感染严重威胁人类健康。如果你去医院就医,医生怀疑你有感染,可能会要求进行革兰氏染色检查。该测试还可以帮助医生了解细菌是革兰氏阴性还是革兰氏阳性,从而选择合适的治疗方式。

然而你可能对于革兰氏阳性菌阴性菌这些概念并不熟悉,今天为大家讲解下,革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌的区别,革兰氏染色法,常见的革兰氏阳性菌类型以及相应的治疗。

首先,我们了解下,革兰氏阳性菌和阴性菌各自的特征。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌

革兰氏阳性菌特征

革兰氏阳性细菌的主要特征是它们的结构。一般有以下特点:

没有外膜。革兰氏阳性细菌没有外膜,但革兰氏阴性细菌有。

复杂的细胞壁。包围细胞质膜的细胞壁由肽聚糖、多糖、磷壁和蛋白质组成。它很容易吸收外来物质。

厚的肽聚糖层。在革兰氏阳性细菌中,肽聚糖有40到80层厚。

某些表面附属物。革兰氏阳性细菌可能有鞭毛,可以帮助它们移动。它们很少有被称为菌毛的毛发状结构。

革兰氏阴性菌特征

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有不同的结构。通常,革兰氏阴性菌具有以下特征:

外脂质膜

肽聚糖薄层(2 – 3纳米)

通常不含磷壁酸

可以有鞭毛或毛

主要的区别是外脂膜。它很难渗透,这给了革兰氏阴性细菌额外的保护。革兰氏阳性细菌没有这种特征。

由于这种差异,革兰氏阴性细菌更难杀死。这意味着革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌需要不同的处理方法。

革兰氏阳性菌和阴性菌是怎么鉴定的呢?

——通过革兰氏染色法。

革兰氏染色法

革兰氏染色法是一种根据细菌细胞壁进行细菌分类的方法。它使科学家能够确定一个有机体是革兰氏阳性还是革兰氏阴性。这项使用显微镜的测试是由汉斯·克里斯蒂安·克拉姆在1884年发明的。

在这个过程中,结晶紫染料被应用到细菌样本上。这种化学染料能将较厚的肽聚糖层染色。

在显微镜下,革兰氏阳性细菌呈现紫蓝色,因为它们厚厚的肽聚糖膜可以容纳染料。由于阳性结果,这种细菌被称为革兰氏阳性细菌。

革兰氏阴性菌染成粉红色。它们的肽聚糖层更薄,所以不会保留蓝色。测试结果为阴性。

革兰氏染色可在各种类型的标本上进行,包括:

血液、组织、粪便、尿液、痰液等。

医生将样本送到实验室进行革兰氏染色检测,从而了解是否是细菌导致了该症状,以及存在哪些类型的细菌。他们也可能会要求其他测试来帮助诊断疾病。这对于确定后续的治疗方案很有帮助。

革兰氏阳性细菌的类型

根据不同的特性,革兰氏阳性菌可进一步分为以下几类:

革兰氏阳性球菌

革兰氏阳性球菌呈圆形或椭圆形。术语“球菌”的意思是球形,表明细菌通常是圆形的。

以下是革兰氏阳性球菌:

葡萄球菌属

葡萄球菌呈葡萄状丛生生长。正常情况下,它们存在于我们的皮肤和粘膜上,不会造成任何问题。但如果葡萄球菌进入人体,它们会引起严重的感染。

链球菌属

链球菌呈链状生长。这是因为细胞在分裂后并没有完全分离。

与葡萄球菌一样,链球菌通常存在于体内。它们通常存在于皮肤、口腔、肠道和生殖道。

链球菌可分为以下类别:

S. pyogenes (Group A)、S. agalactiae (Group B)、Enterococci (Group D)、S. viridans、S. pneumoniae

革兰氏阳性杆菌

当革兰氏阳性细菌呈棒状时,它们被称为杆菌。这些细菌大多在皮肤上发现,但有些会导致严重的疾病。

革兰氏阳性杆菌根据其产生孢子的能力被进一步分类。

有芽胞型:

芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌可以形成孢子,这有助于细菌在高温等恶劣条件下生存。

这些杆菌根据它们对氧气的需要被细分。芽孢杆菌需要氧气才能生存(需氧),而梭状芽孢杆菌不需要氧气(厌氧)。

无芽胞型:

李斯特菌(Listeria )和棒状杆菌(Corynebacterium)不产生孢子。李斯特菌是厌氧菌,棒状杆菌是好氧菌。

致病性革兰氏阳性菌

许多革兰氏阳性菌都是致病菌。虽然有100多种致病性革兰氏阳性菌,但最显著的种类包括:

葡萄球菌

葡萄球菌通常是细菌感染的原因。大多数情况是由以下物种引起的。其他致病性葡萄球菌不太常见,很少导致疾病。

金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌是致病性最强的葡萄球菌。它导致了大多数葡萄球菌感染,包括:

皮肤感染,如蜂窝织炎和毛囊炎、感染性关节炎、脓肿、心内膜炎、细菌性肺炎、食物中毒、中毒性休克综合征、烫伤皮肤综合征、MRSA等。

表皮葡萄球菌

通常,表皮链球菌会在免疫系统薄弱或住院的人身上引起感染。会引起:

导尿管等医疗器械感染、菌血症、纵隔炎、手术部位感染、眼部角膜炎、眼内炎(内眼感染)等。

腐生葡萄球菌

通常见于生殖道和会阴。会引起: 无并发症的尿路感染(最常见)、尿道炎、前列腺炎、急性肾盂肾炎 、附睾炎等。

链球菌

链球菌也是常见的致病菌。以下是最常见的生物体。一般来说,其他链球菌群可引起食源性疾病,引起喉咙痛。

肺炎链球菌

肺炎链球菌是社区获得性肺炎最常见的病因。它还引起:红眼、鼻窦感染、脑膜炎等。

酿脓链球菌

会引起脓毒性咽喉炎、蜂窝织炎、咽炎、脓疱炎、猩红热、风湿热、坏死性筋膜炎、肾小球肾炎等。

无乳链球菌

通常会引起新生儿感染,包括:败血症、肺炎、脑膜炎、化脓性关节炎。

肠球菌

肠球菌主要在结肠中发现。它们会引起胆道和泌尿道感染。

芽孢杆菌

作为孢子形成细菌,杆菌产生孢子并释放毒素。大多数杆菌对人类没有致病性,但以下两种可导致严重的疾病。

炭疽杆菌(Bacillus anthracis )

炭疽杆菌孢子产生炭疽毒素,引起严重的疾病。人类可通过吸入或接触受感染的动物而感染炭疽。

根据炭疽热的传播方式,它可以引起各种症状。这些可能包括:恶心、呕吐、腹痛、咳血、高烧等。

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus )

蜡样芽孢杆菌是一种孢子形成细菌,存在于土壤和一些食物中。它与吃未煮熟或重新加热的米饭而导致的疾病有关。会引起:腹泻、恶心、伤口感染、呼吸道感染、眼内炎等。

梭菌(Clostridium)

大约有30种梭状芽孢杆菌会引起人类疾病。像杆菌一样,这些细菌形成毒素,导致严重的情况。梭状芽孢杆菌通常与食源性疾病有关,但最令人担忧的细菌包括:

肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum )

肉毒杆菌的孢子产生肉毒杆菌毒素,这是对人类最危险的毒素。它会导致肉毒中毒,包括:

食源性肉毒中毒(最常见)、婴儿肉毒中毒、伤口肉毒中毒、吸入肉毒中毒等。

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)

产气荚膜通常与肉类生产和加工有关。如果一个人吃了受污染的肉,他们可能会食物中毒。症状包括持续不到24小时的腹泻和腹部绞痛。

艰难梭菌(Clostridium difficile )

艰难梭菌通常影响住院的老年人。一般发生在服用抗生素之后,引起结肠炎、腹部绞痛、严重腹泻。

破伤风梭菌(Clostridium tetani)

破伤风梭菌孢子产生破伤风毒素,一种神经毒性物质。一般它会出现在土壤、灰尘和生锈的工具上,如果这种毒素引起感染,就叫做破伤风。这是个严重的医疗紧急事件。

单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes )

唯一致病性李斯特菌是单核增生杆菌。在健康人身上,它通常会引起轻微的食源性疾病症状。但在免疫系统较弱的人群中,这种细菌会导致危及生命的情况:脑膜炎、败血症、利斯特氏菌病。

白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)

约有30种棒状杆菌与人类疾病有关。然而,这些微生物很少引起疾病,通常影响免疫系统受损的人。白喉是本组的主要致病菌。引起:白喉、咽炎、呼吸道感染、感染性关节炎、皮肤感染、骨髓炎、心内膜炎等。

治疗革兰氏阳性菌感染

治疗革兰氏阳性细菌引起的疾病时,最佳选择取决于:细菌类型、抗生素耐药性、细菌是否形成毒素等。常见的治疗方法包括:

盘尼西林

一种常见的用于多种感染的抗生素。主要是干扰细菌的肽聚糖层,从而杀死细菌。主要用于链球菌感染,包括:链球菌性喉炎、鼻窦感染、尿路感染、蜂窝织炎等。

糖肽类

糖肽类抗生素常用于治疗耐药细菌引起的严重感染。像青霉素一样,它们通过破坏细菌的细胞壁来发挥作用。可以治疗:耐多药肺炎、MRSA、结肠炎。

红霉素

红霉素属于大环内酯类抗生素,大环内酯类抗生素还包括更知名的阿奇霉素和克拉霉素。它是一种能阻止细菌生长的抗生素,对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都有效。

通常,红霉素是给对青霉素过敏的人开的。治疗的情况如下:细菌性肺炎、红眼、咽喉炎、葡萄球菌性皮肤感染等。

液体疗法

在某些情况下,治疗可能包括液体疗法。它有助于补充身体的水分水平和防止脱水。一般来说,治疗毒素引起的疾病需要液体管理。

抗毒素

对于与毒素相关的疾病,如炭疽和肉毒中毒,治疗包括抗毒素。这种药通过靶向和清除体内毒素而起作用。合适的抗毒素取决于具体的毒素。此外,它还与其他疗法结合使用。

革兰氏染色测试可以帮助医生诊断疾病,从而选择最佳的治疗方式,如果能更快速准确地了解是由何种菌引起的疾病,将会为治疗提供捷径。

【参考文献】

Gillespie S, et al. (2012). Medical microbiology and infection at a glance. West Sussex, UK: Wiley-Blackwell.

Kulkarni AP, et al. (2019). Current perspectives on treatment of gram-positive infections in India: What is the way forward?

Mahony J, et al. (2015). Gram-positive phages: From isolation to application. Lausanne, Switzerland: Frontiers Media SA

Malanovic N, et al. (2016). Gram-positive bacterial cell envelopes: The impact on the activity of antimicrobial peptides. 

Sizar O, et al. (2019). Gram positive bacteria.

Vazquez-Guillamet C, et al. (2014). Treatment of gram-positive infections in critically ill patients.

生物数据可视化着色的十个简单规则

谷禾健康

用于生物数据可视化的方法不断改进,但是在一些可视化图形的着色方面仍然存在根本性的挑战。

生物学数据的视觉不应淹没,掩盖或偏倚结果,而应使其更易于理解。这是对于在创建可视化效果时如何有效使用颜色的挑战。

生物数据的可视化处理是计算机图形学,科学可视化和信息可视化在生命科学各个领域的应用。

本文将介绍10条简单的规则来对生物数据进行可视化着色。

总览

规则1:确定数据的性质

规则2:选择色彩空间

规则3:根据所选颜色空间创建调色板

规则4:将调色板应用于数据集以进行可视化

规则5:套用调色板后,检查数据中的颜色上下文

规则6:在数据可视化中评估颜色的交互作用

规则7:要了解特定学科的颜色约定和定义

规则8:评估色差

规则9:考虑网络内容的可访问性和打印实际情况

规则10:黑白分明

1. 确定数据的性质 

数据是有价值的信息记录。可视化数据是将这些数据中包含的想法、经历和故事联系起来的一种重要而有力的方式。

图形和数据可视化促进了生物信息在不同背景下的表达和交流,形成叙述、想法和经验。要使数据中包含的信息具有形状,了解数据的性质是重要的。借用描述性统计的领域知识,数据如性别、年龄、身高、体重和眼睛颜色等被称为变量。变量的类型与数据的性质有关。

区分变量类型的一种方法是依赖于分配给变量的值中的信息的性质。这个被称为测量的水平或尺度,将观察到的变量分为4个级别:名义、序数、区间和比率。这些数据也可以分为两种不同的数据类型:定性或分类(名义、序数)和定量(区间、比率)。

下面我们分别用一个例子来描述和解释:

名义描述了一个变量的属性,只通过名称(类别)来区分,没有顺序(等级、方向或位置)。

例如:性别、生物种类、眼睛颜色,血型(A、B、AB、O),细菌类型(球菌、芽孢杆菌、螺旋菌等)。它们是一个多值变量,没有明确的尺度来适应不同的值。

序数层次描述了按顺序(等级、规模或位置)区分的变量的分类属性,但没有关于它们之间差异相对程度的信息。要注意这种变量可能会用数字编码。

举例:热度(低、中、高);疾病的严重程度(轻度、中度、重度);一致量表,如李克特量表,(强烈不同意、不同意、无意见、同意或强烈同意)。

注:李克特量表是一种心理反应量表。

区间级别描述变量的属性,通过差异程度来区分,没有绝对零度,并且属性之间没有已知的比率。通常,该变量的数值为正、负或零。

例如:公制摄氏温标,温差(摄氏度和开尔文),1年的间隔。20℃和30℃之间的差异与25℃和35℃间的差异相同.。

比率级别描述变量的属性,这些属性通过它们之间的差异程度来区分,绝对为零,并且属性之间的比率是已知的。具有负值是不典型的。

例如:年龄、身高、体重、持续时间、开尔文温标。此外,假设数值的定量数据(区间或比率)可以进一步分为离散或连续。

离散(可计算的)变量仅假设整数和某种计数。

例如:年龄和日期是离散的。年龄在1年内保持不变,而日期在24小时内保持不变。它们都以“1”跳跃或增加。

连续(定义范围内的任何值)变量可以取某个值范围内的任何值。对这种测量的观察会受到测量仪器的限制。

例如:身高(厘米,英寸),体重(公斤,磅),温度(摄氏度,华氏度),时间(小时,分,秒)。温度逐渐升高,时间不断流逝。

当只有两个可能值时,二进制二分变量类型是一种特殊类型。示例:是或否调查问卷和二进制数字(0或1)。

表1根据4个不同的测量相关类别介绍了4个测量级别,包括从最低到最高的测量分辨率。

表1 四个层次的测量

使用4个与测量相关的类别来比较等级:分辨率、属性、数学运算符和中心趋势。

2. 选择一个颜色空间

颜色空间指的是颜色转化为数字的颜色模型。基于一组原色,颜色模型创建许多颜色。每个模型都有其可以产生的特定颜色范围,该范围定义了色彩空间。

通常,红、绿、蓝(RGB)和青色、洋红、黄色和黑色(CMYK)是最常见的系统,当然还有其他系统。例如,色调、饱和度和亮度/值(HSB/HSV)颜色空间是RGB颜色模型或标准红绿蓝(sRGB)颜色空间的替代表示。

注:关于这些维度的更多信息,大卫·布里格斯的网站名为《颜色的维度》是一个关于颜色理论和使用的信息宝库。

传统的颜色工具,如色轮,鼓励艺术/手工颜色选择。颜色或代码的数值是不同的,将颜色视为特定颜色空间中的数字。此外,由于我们选择的数字和输出颜色之间可能会出现差异,颜色空间应该在感知上是一致的

在颜色科学领域,已经努力建立独立于特定颜色显示或复制设备的颜色空间。人们努力创造出感觉上统一的色彩空间。这些颜色空间背后的动机是使空间与人类视觉感知颜色属性的方式紧密一致。

下表是常用的颜色空间(表2),接下来将要讨论的是解决感知一致性问题的颜色空间。

表2  常用色彩空间的优缺点

由于复杂的颜色转换,光线混合的维度反映了人类视觉的工作方式。下面几种是我们需要考虑的各种特征:模型,线性,直观,组件分离以及设备相关

模型

一个有序的系统,用于从一小组原色中创建一个完整的颜色范围

线性

颜色值相同的变化应该会产生视觉重要性大致相同的变化

直观

指颜色维度易于重新映射到不同的颜色模型

组件分离

指相对于其他维度分离1个颜色维度。

例如,色调、饱和度和亮度(HSL)分离亮度分量(明度),在图像处理的领域知识中特别有用。

设备相关

颜色空间依赖于所使用的设备来设置、制作和渲染的情况。

亮度是光的可见能量或根据人类视觉系统的逐波长响应加权的物理光能

色度是一个区域的颜色,它被判断为一个相似的被照亮的区域的亮度的一个比例,这个区域看起来是白色的或高度透射的。虽然色度描述了光的心理物理颜色,但它与光的强度(亮度)无关

所列出的感知一致颜色空间优于RGB和CMYK颜色空间。RGB用来表示颜色,但它不足以进行颜色处理,并且不是行业标准。

由于CMYK主要用于印刷,它有许多缺点,将在下一篇规则9中进一步讨论。然而,它们并非没有混淆的效果,例如亮度随色调而急剧变化。

LUV和LAB都追求感知一致性。虽然两者都已被CIE(国际照明委员会)采用,但通过依靠三个组成部分并计算相邻颜色之间的椭圆距离,可以观察到空间中不同颜色的相对概念差异。

因为它们是独立的,我们建议使用它的颜色空间。如果选择了,就需要为数据创建一个合适的调色板。

3. 基于选定的颜色空间创建调色板

创建一个调色板很像选择一套衣服。重要的是要了解允许选择颜色来给数据可视化着色的规则。

为了根据特定的颜色空间选择调色板,通常使用色轮。它是一种围绕一个圆圈组织不同颜色以显示颜色之间关系的工具。通常,色轮包含12种颜色。

创建色彩和谐是一个选择在图像合成中协同工作的色彩的过程。基于色轮上的颜色组合,有助于为色彩如何协同工作提供共同的指导方针。

我们可以区分有助于使用色轮创建配色方案的软件和/或网络工具,即Adobe color和配色方案设计器Paletton。

除了创造美学上令人愉悦的颜色组合,调和性还可以用来指导调色板的创建。它们包括单色、模拟和互补。

下图描绘了青色调中的三个调和示例。应该注意颜色的小点,以描绘出特定的色调排列(单色、相似和互补)。

单色或单调色度

是一种单一色调,它在色调、色度和饱和度方面有所变化。一个特别的例子是单调方案,但非彩色(没有色调),仅由从黑色到白色的灰度值组成,即灰度。

相似色

是那些位于任何给定颜色的两边或被一个颜色分开的颜色。这些通常是自然界中的配色方案。

互补色

是色轮上彼此直接相对的颜色。他们经常形成对比,相互突出。当用作数据中的高亮颜色时,它们非常有用。

为了更好地将颜色的使用与数据类型联系起来,信息设计师和数据科学家将上述数据类型(规则1)简化为三种主要类型:连续的、发散的和定性的。

这些分类是在ColorBrewer工具中开发的,最初旨在为制图提供颜色建议。这一概念已经被数据可视化社区所采用,反映在蒙兹纳的可视化分析和设计教科书中。该网络工具可以在colorbrewer2.org找到。

下图展示出了每个数据类型的调色板的例子。

顺序调色板

适用于从低到高变化的有序数据。视哪一方对观察者来说最重要,视觉编码是两种颜色之间的变化,分别从白色或较亮的颜色到黑色或较暗的颜色。这种颜色使用是明度逐步变化,通常重要的数据值具有较暗的颜色。这些调色板对应于包含1种颜色变化的单色调色板。

发散调色板

显示两个方向的视觉变化。主要用于在区间数据范围的两端同等强调中间值极值,它们通常是对称的。颜色在黑暗中增加,以表示断点(如零变化或平均值)周围与数据中特定有意义的中间值之间的差异。

定性调色板

不依赖或暗示类别之间的数量差异。通常,色调以一致的亮度来表示名义和分类数据。还有另外两种变体:成对和强调。处理无序数据时,成对调色板通过视觉关联类来处理成对数据,但强调调色板通过更饱和的颜色来强调相关类。

除了前面提到的工具ColorBrewer,还有两个调色板:一个用于连续数据,另一个用于定性数据。

对于连续数据,推荐 viridis调色板。它在感觉上是均匀的,并以多种色调显示单调增加的亮度。多亏viridis调色板和其他调色板,一个连续数据集的所有数据点都具有同等的视觉重要性。此外,我们将在下一篇的规则8中看到,这些调色板对色弱和色盲是友好的。

对于定性数据,Tableau 10调色板可以推荐给大家。它包含几个非常不同的色调亮度值范围很广。虽然它是用10种颜色设计的,而且很适合三色异常,但它所有颜色的使用对其他颜色缺陷是一个挑战。我们将在规则4和下一篇规则8中讨论定性数据的颜色限制。

另外还有一个创建调色板的网络工具,即Colorgorical( http://vrl.cs.brown.edu/color)。

4. 将调色板应用到数据集进行可视化

要应用选定的调色板,需要考虑将颜色映射到数据点的过程。基于规则3,我们考虑了3种不同的颜色映射调色板:连续的、发散的和定性的。

对于连续调色板,色调应该受到限制,只有亮度或饱和度应该变化。根据背景颜色、手头的任务和数据的性质,将较高的值映射到较暗或较亮的颜色非常重要。

在下图中,我们展示了一个热图,描述了不同字符串之间的Jaccard索引和由分层聚类提供的背景信息。

对于发散的调色板,当数据有有意义的或关键的中断时很重要。通常,关键断点应该采用中性颜色,如灰色端点应该采用饱和颜色。一般来说是对称的,临界断点可以是平均值中间值零变化值

在平均值或中位数的情况下,通常有低终点和高终点。在负值和正值有零值中断的情况下,端点应使用不同的色调。为了突出分歧,中断可以去饱和,端点可以饱和。

对于定性调色板,建议仅使用种颜色,如果绝对需要,也可以使用更多颜色。实际上,当使用ColorBrewer时,限制被设置在3到9的范围内。

5. 应用调色板后检查数据的颜色背景

如果有理由的话,我们认为颜色是不变的,即使它们在不同的光线下。事实上,颜色恒常性是感知物体颜色的能力,不受光源颜色的影响。这主要是因为颜色是一种相对的媒介。

举个例子,比如我们可以看到一根香蕉在阳光充足的中午或光线微弱的黑暗房间里呈黄色。然而,在某些情况下,相邻的颜色会改变我们的感知和区分某种颜色影响的能力。

下图显示了一个数据视觉的例子,其中白色可以与灰色背景区分开来,比如在你的电脑屏幕上。然而,同样的白线在白色背景下很难区分,也许当打印在白纸上时。当白线变成黄线时,情况就解决了。

有个“Interaction of color”app可以进一步教会你如何意识到颜色的背景,它是约瑟夫·阿尔伯斯50年前写的《色彩交互》一书的数字化延伸。它为在不同的显示背景中学习颜色提供了练习。该应用还允许在interactionofcolor.com创建个性化的色彩研究和调色板。

在生物数据可视化中,通常会看到红色/蓝色的数据可视化。由于同时对比,对红/蓝颜色组合的偏好是可以解释的。下图就是这种情况。

左:红色/蓝色组合。右图:绿色/紫色补色组合改善了数据可视性。

同时对比是指两种不同的颜色相互影响的方式。这也是蓝色背景下很难阅读红色文字的原因。理论是,当两种颜色并排放置时一种颜色可以改变我们对另一种颜色的色调感知。实际的颜色本身不会改变,但我们认为它们已经改变了。

法国化学家米歇尔·欧仁·切夫勒发展了这种同时对比的规则。它坚持认为,如果两种颜色靠得很近每种颜色都将呈现相邻颜色补色的色调。类似的结果也可以发生在数据可视化中。然而,同时使用对比色可能难以评估数据趋势的变化。

6. 评估数据可视化中颜色的交互

颜色的使用取决于大量数据和介质特性。除了某些颜色的不良相互作用之外,我们会看到颜色可能带有某种意义。

对于交互,存在红/蓝颜色或文本内容的交互。首先,文本看起来模糊不清,伤害眼睛。这是称为色差的现象的结果,色差对应于不能同时聚焦在两种颜色上。

对于下图中提供的例子,还需要解决色彩不足问题的补色组合。绿色/紫色方案提供了两个数据变量之间的转换组合,同时允许有色觉障碍的个人区分这两个变量。绿色和紫色是这种特殊情况下的最佳组合。

在某些情况下,感知的一致性至关重要。一个简单的例子是,在不规则的颜色空间中,选择一种随机的颜色以便在黑暗的背景下可读,这是很困难的,因为相同亮度或光度的颜色看起来非常不同(蓝色和黄色在HSV中都有100%的亮度,但是蓝色比黄色暗得多)。

为了解决这个问题,需要考虑所选色调的复杂计算,以使随机颜色看起来同样明亮。有一个更简单的方法,即选择更好的颜色空间

基于jet或彩虹的调色板是最常用的调色板,因为它是在软件工具中作为标准提供的。它具有很高的对比度,这使得它能够突出手头数据的特征。

然而,当查看颜色图表时,色带或色块尤其出现在青色和黄色区域。这个看似不错的调色板在应用于描述同等重要的顺序数据时会导致急剧的转换,尽管底层数据变化均匀。事实上,由于非恒定的感知颜色变化,这是误导,甚至对色弱的个人更是如此。

下图描述了这些部分。

虽然许多研究人员都在抱怨它的误导,但在实际许多应用中,基于彩虹的调色板仍然在被使用,并且有可能对解决任务的准确性有潜在的负面影响。

不幸的是,由于人类通常将颜色分类,彩虹调色板的使用会给数据的解释带来偏差。此外,由于色调的自然顺序,这甚至可能被放大。然而,不同的方面可以被智能地集成。例如,不同的亮度强调某些标量值,而低亮度颜色(例如,蓝色)可能隐藏高频。

7. 注意特定学科中的颜色惯例和定义

生物学描述了生物组织的不同层次(从分子到细胞、有机体到生态系统),整合了多种领域,如生物化学和生物物理学。这涉及到大量不同风格的数据,这些数据可能受特定领域惯例的约束。

我们简要讨论4个与生物化学、生物物理学、解剖学细菌学相关的显著例子。

生物化学

在化学中,一个分子中不同原子的颜色遵循标准的科里·鲍林·科尔顿(CPK)规则。最重要的颜色是氢的白色(H),碳的黑色(C),氮的蓝色(N),氧的红色(O),硫的深黄色(S),磷的紫色(P)。其余的原子呈现出亮、中、暗、卤素组为深绿色,金属组为银色。生物化学遵循这些惯例,例如,给20种蛋白质氨基酸的生化结构着色。

生物物理学

在过去的几年里,已经开发了广泛的荧光蛋白遗传变异体,其特征是荧光发射光谱分布几乎跨越了整个可见光谱。借助这种分子和显微镜技术,科学家可以看到特定的细胞反应甚至亚细胞机制。例如,这种特定的分子可以在不同的光谱范围内(例如青色、绿色、黄色或红色)发出荧光。当然,最著名的分子是绿色荧光蛋白。如果数据集涉及荧光图谱,或包括光谱范围的信息,惯例是根据它们给数据着色。

解剖学

解剖学上,颜色约定从第一张解剖草图就已经存在。虽然第一幅彩色印刷的医学插图显示了文字颜色的用法,但现代颜色的用法是相当象征性的。事实上,颜色通常用于肤色、内脏、循环和神经系统,甚至是选定的身体组织(如肌肉或脂肪)。尽管在体内动脉和神经呈白色,静脉呈淡蓝色,但既定的颜色惯例是动脉为红色,静脉为蓝色,神经为黄色。

细菌学

在细菌学中,科学家对许多细菌特性机制感兴趣,例如革兰氏染色、形态学、遗传学和抗生素抗性。前者通过细胞壁的化学和物理特性来区分细菌(革兰氏阳性细菌有厚厚的肽聚糖细胞壁,保留了结晶紫的主要染色)。后者发生在细菌和真菌等细菌有能力击败用来杀死它们的抗生素(如青霉素)时。

基于包含3种最流行的抗生素对16种细菌的性能的数据,我们在下图中展示了青霉素与新霉素的有效性的2个实例数据。

虽然选择蓝色/橙色的配色方案是为了为名义比较提供可感知的可分辨颜色(左),但采用革兰氏染色颜色惯例呈现出更适合具体问题的颜色用法(右)。

其他生物领域

其他实践存在于特定的生物研究领域。例如,在分子和进化生物学中,基因表达水平和基因保护的视觉编码依赖于红/蓝发散调色板。然而,我们不能谈论颜色惯例,因为在红/绿、红/蓝以及断点不是白色而是黄色的其他情况下,这个值会有很大差异。

值得一提的是要注意文化习俗。事实上,在不同的国家或文化中,颜色可能具有非常不同的象征意义,如果不是相反的话。一个很好的例子是红色,它在西方社会象征着危险和激情,在东方社会象征着幸福和繁荣。

8. 评估颜色缺陷

人类有3种感光细胞或视锥细胞,每一种都对视觉光谱的不同部分敏感,以促进丰富的彩色视觉。我们需要尊重一些人的颜色感知是不同的,并评估所选择的调色板是否适合有色弱或色盲的人。

如果一个或多个视锥细胞不能正常工作,就会导致色觉缺失。红色锥细胞缺乏症被归类为红色盲。绿色锥细胞缺陷被归类为绿色盲。蓝锥细胞缺陷被归类为蓝色盲。

当创建或选择调色板时,不同的网络工具允许测试色弱和色盲。一方面,可以使用Adobe Color web工具(color.adobe.com)或Paletton–配色方案设计师(paletton.com)来测试调色板的颜色缺陷。另一方面,网络工具Coblis (Matthew Wickline和人机交互资源网络)使我们能够评估数据可视化是否对更大的受众可用,包括颜色缺陷。

另一个值得注意的工具是Viz调色板。它允许通过模拟选定的信息可视化示例来测试特定调色板的颜色缺陷。下图结合了3个工具,ColorBrewer, Viz Palette和 Coblis,提供了一个用例的例子。

9. 考虑网络内容的可访问性和打印实际情况

在许多情况下,生物数据可视化超越了研究工作,成为一般在线(如网站)和印刷(如期刊论文)出版物的一部分。对于这些情况,我们简要讨论了网络内容的可访问性和打印现实。

对于基于网络或桌面和移动设备,我们建议遵循万维网联盟(W3C)制定的网络内容可访问性指南(WCAG)。网站必须是可感知的、可操作的、可理解的和健壮的,根据4个原则组织有12个指南。

虽然有一些技术可以帮助作者满足指导方针和成功标准,但是这些技术会随着时间的推移而发展和适应。在列出的技术中,有8种与颜色有关。我们将范围限制在非交互式数据可视化,并借用有利于数据可视化可访问性的技术:

· 确保通过颜色差异传达的信息在文本中也可用

· 使用颜色和图案

·使用颜色提示时使用语义标记

·当使用文本颜色差异来传达信息时,确保附加的视觉提示可用

·对周围的文本使用3:1的对比度,并在链接或控件的焦点上提供额外的视觉提示,仅用颜色来识别它们

·包括用于彩色表单控件标签的文本提示

事实上,其中大部分是为了网页颜色的使用,但我们认为它们是相关的。所报道的技术解决了如何提高看不见颜色的用户的可访问性,因此可以寻找或倾听文本线索;使用盲文显示器或其他触觉界面的人可以通过触摸来检测文本提示。

此外,一些技术解决了实现文本信息和内容的更好对比度的问题。即G17:确保文本(和文本的图像)和文本后面的背景之间存在至少7:1的对比度。

事实上,这个想法是为了确保阅读文本时亮度有对比,而不是色调有对比。

网络工具 Colorable 允许使用十六进制格式的web十六进制代码测试两种颜色,并提供滑块来控制色调、饱和度和亮度

观看和阅读生物数据可视化取决于目标受众使用的媒。一方面,使用桌面和移动设备,其中光源用于在RGB颜色空间中混合不同强度的红色、绿色和蓝色。当所有颜色混合时,出现白色。

另一方面,使用纸张打印件,其中打印机将不同程度的CMYK颜色与物理墨水颜色(青色、品红色、黄色和黑色)相结合。当所有颜色混合在一起时,就会产生黑色。为了方便起见,我们可在以下工作时提出一项易于遵守的入围名单要求:

台式机和移动设备,最适合的色彩空间是RGB。关于在网页上应用颜色的指导性文件可以在这里找到:w3.org/TR/css-color-3/#rgb-color

小印刷件,如小册子,或期刊纸图,我们鼓励在300 DPI分辨率的CMYK色彩空间的图像。

非常大的图形并不总是控制它们的质量,我们建议从灰度、位图或RGB颜色空间转换到打印机友好的CMYK颜色空间。

10. 黑白分明

在某些需要考虑印刷成本的情况下,黑白配色方案可能是首选。此外,黑白会增加那些色盲者以与您相同的方式看到和阅读数据可视化的机会

在不同的领域,如图形和渲染,甚至摄影,这条规则通常被表述为“检查它在黑白和彩色中是否工作良好”。在数据可视化中,这通常与测试所呈现的故事是否仍然可见或可辨别有关。

黑白分明意味着两件事。当不确定调色板时,尝试用灰度显示数据,或者比较两个彩色版本的数据,当不确定哪个更易读时,用黑白打印出来。大多数情况下,后者是找到对比度更好的可视化。

此外,一个建议是关于影印友好的调色板。为了对抗影印过程的损耗,单色或连续调色板是最有弹性和最合适的。

着色并不容易。如果对颜色有需求,可以选择适合并使用少量的颜色避免饱和的颜色,并且要符合阅读者的期望。

以上两图详细说明了根据示例任务的黑白数据可视化的变化。安全选择的一个例子是选择一种颜色和几种灰色阴影。

最后,总结一下这十种规则。

【参考文献】

Hattab G, Rhyne T-M, Heider D (2020) Ten simple rules to colorize biological data visualization. PLoS Comput Biol 16(10): e1008259.

Rhyne T. M. (2017). Applying Color Theory to Digital Media and Visualization., CRC Press, Boca Raton, Florida, ISBN 9781498765497

Smith N, van der Walt S. A better default colormap for Matplotlib. SciPy2015. 2015

Stokes D., Matthen M., & Biggs S. (Eds.). (2015). Perception and its modalities. Oxford University Press, USA

Gramazio CC, Laidlaw DH, Schloss KB. Colorgorical: Creating discriminable and preferable color palettes for information visualization. IEEE Trans Vis Comput Graph. 2016; 23(1):521–530.

人类微生物组测序数据的聚类:基于距离的无监督学习模型

谷禾健康

在现代测序技术的帮助下,微生物组研究的范围被扩大,通过16S rRNA测序鸟枪法宏基因组测序可以生成大量的微生物组数据。而微生物群落研究中的一个重要问题是对这些微生物的归类,模拟和分析人类微生物群。

通常使用16S rRNA技术量化微生物群落的组成,但量化后的数据是偏斜的,带有过多的0。目前还缺乏对复杂的微生物群落测序数据的标准化的聚类分析方法。

近日,加拿大多伦多大学研究人员在《Microorganisms》上发表的一篇研究,针对上述问题构建了一个参数化的混合模型用于计算聚类分析的距离度量,模型根据观察到的OTU计数和估计的混合权重产生sample-specific的分布。这个方法可以准确的估计真实的0比例,从而构建一个精确的beta多样性度量。

大量的模拟研究表明,与一些被广泛使用的距离度量方法相比,当存在较大比例的0时,该方法取得了较好的聚类效果。  

该研究人员提出了一种具有特定beta多样性度量的聚类算法,该算法可以解决稀疏计数数据遇到的有无偏差问题且能有效的度量样本距离,达到分层的目的。

 背  景 

​微生物群落研究中的一个重要问题是对这些微生物的归类,它们是否能被划分为亚群。如果有,有多少组亚群,如何解释这个亚群。例如,这种分类是否区分了治疗方法、疾病或遗传类型。

为了回答这些问题,需要测量两个微生物群落之间的相似性。beta多样性是为了适应不同的目的而提出的,在评估群落之间的差异时提供不同的结果。对于微生物组成,beta多样性根据测量丰度来衡量群落之间的距离,丰度可以是观察到的计数,也可以是相对丰度,这些丰度是根据不同或距离度量计算出来的,以量化样本之间的相似性。

现如今,已经有许多非参数统计方法来量化距离度量。例如Euclidean和Manhattan距离是最常用的。其它beta多样性指标,例如Bray-Curtis距离、Jensen-Shannon距离、Jaccard指数、UniFrac距离(未加权的、加权的和广义的)也经常用于微生物组研究。

除了距离度量之外,还引入了用于生态关联推理的稀疏逆协方差估计(SPICE-EASI)的图形网络模型。然而这些方法都会有一定的局限性,例如SPIEC-EASI方法依赖于单一的方差-协方差矩阵,由于微生物群落结构复杂,可能无法完全恢复底层OTU网络

于是,研究人员开发了一种创新的聚类方法,以混合模型而不是beta多样性度量作为距离度量,并将聚类算法应用于微生物群落数据来表征亚群。该算法还包括根据选择的内部指标选择最优聚类数,并将结果在几种距离度量不同评估方法之间进行比较。通过全面的模拟研究和一个真实的帕金森病肠道微生物群数据集对该算法的性能进行了评估。

 方 法 概 要 

1. 构建混合模型

混合模型是一种概率模型,用于表示在无监督学习中经常使用的总体内的子群体。该模型关注单个OTU在种群中的分布,可以解决样本间的稀疏性问题。它参数化地模拟了计数的潜在分布,包括低计数OTU和极高计数。对于个体样本之间的成对距离,在L2范数距离中使用公式化的混合概率。

2.  距离度量 

在确定混合模型分布后,使用概率分布通过样本之间的两两距离计算距离度量。为了进行比较,考虑了基于L2范数的三种距离度量(L2-PDF、L2CDF、L2-DCDF、L2-CCDF)。

除此之外还选择了一些其他的距离度量进行比较,即Manhattan距离和Euclidean距离,以及微生物组分析中特有的三个距离度量:Bray-Curtis距离、加权UniFrac距离和广义UniFrac距离。本研究不考虑未加权的UniFrac距离,因为它不包含类群丰度信息。

3.  聚类分析验证指数

这些指数用于衡量集群在集群内部和集群之间的可分离性表现很好。验证指标可以分为内部指标和外部评估,许多内部验证指标被用来选择最优聚类数。外部评估分数是在假设标签在建模阶段没有使用时,通过直接将划分结果与之前的标签进行比较来计算的。

4.  用于聚类的分区算法(PAM)

使用混合分布的聚类过程的详细步骤:

模拟研究及其结果

为了测试该方法在聚类中的表现如何,研究人员推导了其准确性和Jaccard指数。

准确性是指聚类结果与真实的聚类指数的接近程度。它被定义为正确聚集的受试者所占的比例。

Jaccard指数衡量聚类结果与原始聚类标签之间的相似性,原始聚类标签定义为正确分类的主题数量(预测集与真实集的交集 )与两组总样本量(两集的并集)之比。

研究人员用类标签模拟数据来模拟OTU计数及其复杂的结构。研究人员考虑两个有两个子类和三个子类的场景,每个子类包含200个样本,总样本量分别为400和600。所有的结果被重复了100次。

下图展示了模拟数据的准确性。评估了三种不同的0的比例(ZP)情况,左中右分别为高ZP、中等ZP、低ZP。

下图展示了模拟数据的Jaccard指数。同上图一样评估了三种不同的0的比例。

以上两图显示了具有不同ZP和子类数量的不同场景下模拟数据集的聚类结果。通过准确率和Jaccard指数对基于距离的算法性能进行了评估。填充颜色为绿色的箱形图为研究人员建议使用的距离度量。所有的距离都是根据相对丰度计算的。

Table1平均准确率(MA)和平均Jaccard指数(MJI)估计。粗体表示每个方案下的最佳情况。Log表示对输入的模拟数据进行了对数变换。

Table2所有模拟场景的平均集群数。根据Dunn内部指数计算出每次重复的最优聚类数。

Table1 的结果是通过对每个场景中的100个重复结果求平均值计算得出的。观察得到在聚类算法中实现的距离度量(即绿色标识的箱形图)的准确率和Jaccard指数都优于其他距离度量,特别是在数据集中包含大量0时(高ZP)。在MA和MJI方面,L2范数也显示了其优势,在基于100次重复计算的L2范数在两个子类场景下的;平均准确率约为0.6秒,在三个子类场景下的平均准确率为0.45。而广义Unifrac距离(gUniFrac)在准确性估计中有很大的波动变化。

 肠道菌群与帕金森氏病的数据分析

数据集为197名PD患者和130名对照的粪便样本的16S rRNA测序数据。首先过滤掉在80%的OTU中相对丰度都为0的OTU,因此,此次分析中共使用280个OTUs。将基于相对丰度计算的L2范数与其他三个距离度量进行了比较,包括对数变换和不变换的比较。

如Table3所示,距离度量采用各种内部验证指标(列名)进行灵敏度分析。对于Dunn和Xie-Beni指数,l2范数倾向于将数据聚类为两到三个亚群,而在有和没有对数变换的情况下,除了未变换的欧氏距离外,Manhattan、Euclidean和Bray-Curtis更倾向于聚类更多的亚群。(设置了最多聚类数目为10)

接着选择L2-D PDF范数作为进一步分析的例子。

结果在Table4中展示,对数据集中的两个集群之间的OTUs进行了探索,得到了聚类之间差异最大的前5个OTU。

结  论 

研究认为该聚类算法在高ZP和中等ZP的情况下表现最好,因此,当数据中出现大量的0时,建议使用。并且,在PAM框架下,文章中列出的那些距离度量都可以用作聚类的输入。

如模拟研究中显示的那样,在各种场景下,由混合模型计算的成对距离比其他距离度量表现的更好。但是与所有聚类方法一样,都有一个局限性,就是很难为每个新数据选择合适的内部指标,因此很难获得最优和最稳健的集群数。

此外,对于L2范数距离,在聚类中无法进行变量选择。但不可否认,该聚类算法结合了微生物测序数据的特殊距离,所介绍的聚类算法除了目前使用的方法之外,还可以被看作是分析微生物数据的一个很好的辅助工具。

研究人员指出,下一步会基于Dirichlet-Polyomial等模型进行分区,与文章中的方法进行比较,并努力将该方法扩展到其他微生物群落和疾病相关的数据上。

【参考文献】

Yang D, Xu W. Clustering on Human Microbiome Sequencing Data: A Distance-Based Unsupervised Learning Model. Microorganisms. 2020 Oct 20;8(10):E1612. 

肠道微生物群在冠心病中的作用

谷禾健康

冠心病患者的肠道微生物群存在差异,这已成为共识。 研究表明,肠道微生物群与肥胖、糖尿病、血脂异常和高血压有关,这些都是冠心病的危险因素。肠道微生物群通过其代谢产物参与介导胆固醇代谢、尿酸代谢、氧化应激和炎症反应等基本代谢过程,可诱导动脉粥样硬化和冠心病的发生。 干扰肠道微生物群的组成,补充益生菌和粪便捐赠是潜在预防和治疗冠心病的热门研究领域。

肠道微生物群对冠心病危险因素的影响

研究表明,肠道菌群与肥胖,糖尿病,血脂异常和高血压有关,它们是冠心病的危险因素。

肠道菌群与肥胖

2004年,Bäckhed等人首先报道了肠道微生物群与肥胖有关,因为他们发现肠道微生物群可以调节实验小鼠的脂肪储存。在人和小鼠中都发现了与肥胖相关的相似的肠道菌群。在肥胖的小鼠和肥胖的人类肠道微生物群中,厚壁菌/拟杆菌比例更高。 他们的结果表明,肥胖患者的微生物组从饮食中获取能量的能力更强。 这一发现进一步证实了肠道菌群与肥胖之间的关系。

目前的研究表明,肠道菌群可能导致肥胖(图1)。 肠道微生物群会发酵宿主无法消化的物质,将其转化为小分子,例如短链脂肪酸(SCFA),并为宿主提供能量。 肠道菌群抑制禁食诱导的脂肪细胞因子(FIAF)的表达增加脂蛋白脂肪酶的表达,并促进脂肪细胞中甘油三酸酯的储存(乙酰辅酶A羧化酶[ACC]和脂肪酸合成酶[FAS]是关键的调节剂),因此诱发肥胖。肠道菌群还调节内源性大麻素(CB)系统。

CB调节肠的通透性以及肠粘膜中紧密连接蛋白的定植和分布,从而导致肠通透性增强,脂多糖和炎症反应增加,从而导致肥胖。

图1  肠道微生物群对肥胖的影响

肠道菌群和糖尿病

糖尿病是冠心病的主要危险因素。糖尿病患者的冠心病发病率为55%,是非糖尿病患者的几倍。糖尿病的发病机制与环境因素和宿主遗传有关。 作为重要的环境因素,肠道菌群与糖尿病密切相关。 在人类粪便微生物群的研究中,这些有益细菌与改善胰岛素敏感性和改善糖尿病有关。增加糖尿病风险的细菌是有害的。 

对我国345例糖尿病患者肠道微生物DNA的基因组学分析显示,中度菌群失调是2型糖尿病患者正常菌群平衡受到干扰的状态。 为了对2型糖尿病患者的肠道微生物含量进行分析,开展了一个全基因组关联研究(MGWAS),并根据shotgun法对来自345位中国人的肠道微生物DNA进行了两阶段的MGWAS分析。 此外,共生丁酸产生菌数量减少,而条件致病菌的数量增加

对145名欧洲糖尿病女性的肠道菌群进行的研究也得出了相似的结果:产生丁酸的梭状芽孢杆菌数量减少,而乳酸杆菌属和链球菌属增加

普氏菌Prevotella copri和普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)是支链氨基酸合成与胰岛素抵抗之间联系的驱动因素。 胰岛素抵抗者的血清代谢组的特征是支链氨基酸(BCAAs)含量升高,已证明Prevotella copri可以诱导胰岛素抵抗,加重葡萄糖耐量和增加小鼠BCAA的循环水平。普通拟杆菌可以引起胰岛素抵抗并增加循环支链氨基酸水平,从而介导糖尿病。 许多研究表明,肠道菌群通过影响胰岛素抵抗和胰岛素分泌失调来促进糖尿病(图2)。 

图2   肠道微生物群对糖尿病的影响

肠道菌群与2型糖尿病之间的重要联系是Toll样受体(TLR)。 肠道菌群的变化通过调节TLR4参与胰岛素抵抗诱导的肥胖。 来自肠道菌群的脂多糖(LPS)通过肠道吸收进入血液循环,这一过程称为代谢性内毒素血症。TLR4缺失对胰岛素抵抗的保护作用与其对代谢性内毒素血症信号转导的抑制有关 。LPS可以促进胰岛B细胞的凋亡并减少胰岛素分泌。

肠道菌群失衡会导致短链脂肪酸(SCFA)失调,这在调节肠道菌群,维持体液平衡,为肠上皮提供能量,抑制炎症因子形成以及促进肠黏膜修复方面起着重要的作用。增加的SCFA可以诱导TLR4信使RNA表达显着增加,并增强NF-κB与白介素(IL)-6结合。 

SCFA与G蛋白偶联受体41/43结合也可影响抗炎和脑肠肽激素分泌功能,导致胰岛素抵抗和胰岛细胞功能障碍,并导致胰岛素样生长因子-1(GLP-1)分泌障碍(例如GLP-1可降低血糖和胰岛细胞凋亡)。

此外,肠道菌群的结构和体内稳态的变化会改变胆汁酸的转化,从而导致异常的TGR5和法尼醇X受体(FXR)信号通路。 这种变化会导致代谢紊乱,最终导致糖尿病。

肠道菌群和血脂异常

血脂异常与冠心病密切相关。饮食,肥胖,激素,基因和其他因素会导致血脂异常。

肠道菌群的生理和代谢活动对于调节和维持人类平衡的脂质代谢至关重要。厚壁菌和拟杆菌属是影响血脂改变的主要细菌菌群。 肠道菌群的脂质代谢产物(例如胆碱,三甲胺氧化物[TMAO]和甜菜碱)会促进动脉粥样硬化并增加患心血管疾病的风险。肠道菌群会影响血清甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇的转化。

三种机制很可能导致血脂异常

首先,肠道菌群产生胆汁盐羟化酶,将结合的胆汁酸转化为二级游离胆汁酸。二级游离胆汁酸可通过G蛋白偶联受体调节肝脏和脂质的代谢,肠道菌群紊乱可导致胆汁酸分泌异常,从而引起血脂异常。

其次,肠道菌群将胆碱和肉碱从宿主转化为三甲胺(TMA),而TMA在肝脏中转化为TMAO。  TMAO可通过影响胆固醇的运输和代谢以及胆汁酸水平而引起血脂异常和动脉粥样硬化斑块。

第三,SCFAs可以抑制肝脏脂肪合成酶的活性,调节血液和肝脏中胆固醇的分布,从而在降低血清3-酰基甘油和胆固醇水平方面发挥作用。

细菌异常会导致SCFA分泌不足和血脂异常。 益生菌可以降低血清胆固醇并增加高密度脂蛋白含量,这表明正常的肠道菌群间接地参与了血脂水平的降低。

肠道菌群与高血压的关系

高血压是导致心血管疾病的关键因素。 本研究表明,除了公认的高血压病因(例如交感神经系统过度活跃,肾素-血管紧张素-醛固酮系统活化以及水和钠潴留),肠道菌群也与高血压密切相关(图3)。

图3   肠道微生物群对高血压的影响

对原发性高血压大鼠粪便细菌的分析表明,细菌数量和多样性明显降低。厚壁菌和拟杆菌的比例增加,SCFA产量降低

SCFA可通过嗅觉受体78(OLFR78),G蛋白偶联受体41(GPR41)和G蛋白偶联受体43(GPR43结合来调节血压。

SCFA在维持肠上皮屏障功能中发挥作用。它们可以减少炎症反应,直接影响免疫细胞,减少交感神经活动,从而改善高血压。 此外,一项研究还报道了肠道菌群可以影响血管活性激素(如5-羟色胺,多巴胺和去甲肾上腺素)的形成,从而在调节血压中发挥作用。

最近的一项临床研究对高血压患者的粪便菌群进行了分析,并发现了类似的结果。普雷沃氏菌和克雷伯氏菌的比例显著增加。将健康对照组和高血压组的肠道菌群移植到GF小鼠体内。用高血压患者粪便细菌移植治疗的小鼠血压显著升高。这表明肠道微生物群与宿主的血压有关,并进一步证实不平衡的肠道微生物群是高血压的重要致病因素。

肠道微生物群对冠心病的影响

肠道微生物群参与调节基本代谢过程,如胆固醇代谢、尿酸代谢、氧化应激和炎症反应,通过其代谢物,可导致动脉粥样硬化和冠心病的发展。

冠心病患者肠道菌群的变化

在2012年,Karlssion等人使用全基因组测序来确定肠道菌群变化与动脉粥样硬化性心脏病之间的可能联系。与健康人群相比,Collinsella菌的数量增加,而 Rothia 和 Eubacterium 菌数量减少。 使用宏基因组技术进行的进一步功能分析表明,冠心病患者肠道菌群中编码肽聚糖合成的基因增加,而编码八氢番茄红素去饱和酶的基因(与血清中β-胡萝卜素减少相关)减少。  

2016年,Emoto等人使用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)和16S rRNA来研究冠心病患者和健康志愿者之间肠道菌群的差异。结果表明,在冠心病患者中,成熟的乳杆菌数量显着增加,而拟杆菌(双歧杆菌和普氏杆菌)显着下降。此外,厚壁菌/拟杆菌的比例明显增加。  该研究还发现,不使用抗生素的冠心病患者肠道菌群中乳酸菌的比例显着增加,而拟杆菌的比例显着下降。  

2017年,这些作者在两项临床试验中再次验证了这些结果。首次将肠道菌群结构的变化直接鉴定为冠心病的诊断标记。

TMAO在冠心病中的作用

肠道菌群产生的代谢性TMAO是心血管疾病的关键机制(图4)。 食物中的胆碱(例如,磷脂酰胆碱,胆碱,L-肉碱和其他三甲胺[TMA])通过肠道微生物酶复合物来产生TMA。 然后TMA进入门静脉循环,并被宿主的肝酶进一步代谢,从而产生TMAO。

图4  TMAO对冠心病的影响

当前的研究表明,血浆TMAO水平与冠心病风险高度相关。临床研究还表明,TMAO增加了患心血管疾病的风险,并增加了急性心肌梗塞,心源性休克和死亡的发生率。 

一项为期3年的研究(涉及4007名参与者)进行了选择性冠状动脉造影术。 结果表明,空腹血浆TMAO水平在独立于传统心血管危险因素的心脏事件预测中发挥作用。 这项研究表明,最高四分位数患者中,TMAO水平较高的患者恶性心脏事件的发生率比最低四分位数患者高2.5倍。 而且,TMAO的风险比显着高于低密度脂蛋白的风险比。校正传统的危险因素和肾功能后,TMAO水平仍是恶性心血管事件的独立预测因子。

Cyp7al是胆汁酸合成中的主要酶。Cyp7al的表达上调可以帮助扩大胆汁酸库,增加胆固醇的运输,并最终减少动脉粥样斑块的形成TMAO可以降低Cyp7al的表达,抑制胆固醇的运输,引起胆固醇在细胞中的积累,并导致形成泡沫细胞。

TMAO还可以诱导血小板反应过度,因此成为动脉粥样硬化的危险因素。  TMAO与血小板之间的相互作用可能通过改变血小板依赖性钙信号传导而促进血小板高反应性并增强体内血栓形成。据报道血小板高反应性是心血管事件的危险因素。

最近的证据表明,TMAO可以在数分钟内迅速向细胞发送信号。 在内皮或平滑肌细胞中,TMAO可以迅速诱导丝裂原活化的蛋白激酶和NF-κB活化,并引起下游粘附分子的上调。 TMAO水平升高还与SMAD 3 蛋白的磷酸化增加有关。  SMAD 3是转化生长因子β(TGF-beta)途径中的关键信号。 在动物模型中,TMAO促进血管炎症并诱导主动脉内皮细胞活化和粘附蛋白上调。这些作用都是急性冠状动脉综合征的关键机制

肠道菌群通过尿酸对冠心病的作用

血清尿酸水平可能是冠心病的独立危险因素。 尿酸在体内具有氧化特性。 血尿酸水平升高会导致血尿酸增加氧自由基,氧化应激,血管内皮功能障碍,炎症反应以及动脉粥样硬化的发展。

肠道菌群通过调节尿酸代谢来影响氧化应激过程。 大肠杆菌含量越高,尿酸分解越多。 冠心病患者血清尿酸水平升高与肠道菌群功能障碍有关。高尿酸血症也是动脉粥样硬化的危险因素。血清尿酸水平升高会增加氧自由基的产生,引起氧化应激,并引起内皮功能障碍。UA水平与循环类胡萝卜素成负相关

与年龄,性别,总能量,蛋白质和维生素摄入量无关,循环尿酸水平与总类胡萝卜素(尤其是α-胡萝卜素,番茄红素,叶黄素,玉米黄质和硒)呈负相关。 类胡萝卜素作为抗氧化剂,具有抗心绞痛的作用。一项研究分析了动脉粥样硬化患者和正常对照组的肠道菌群结构,发现动脉粥样硬化患者的肠道菌群富含编码肽聚糖生物合成的基因,而正常对照组的肠道菌群富含类胡萝卜素编码基因。肠道微生物疾病会导致含有合成类胡萝卜素基因的细菌减少,从而降低血液中的类胡萝卜素水平并削弱抗氧化作用,从而促进动脉粥样硬化的发展。

肠道微生物是防治冠心病的新靶点

肠道菌群失衡与冠心病的发病机制有关。 这是一种有效的靶向疗法,但缺乏与冠心病和心肌梗塞患者干预相关的数据。 Lam等人使用抗生素抑制肠道菌群,并观察这些变化对急性心肌梗死(AMI)小鼠预后的影响。 研究结果表明肠道菌群变化与心肌梗死之间存在联系,并证明益生菌补充剂可以减少心肌梗死率。  Gan等研究了给予益生菌以减轻心肌梗塞后心肌肥大的小鼠。作者确定,干扰肠道菌群结构并改善急性心肌梗死的预后可能成为AMI的新疗法。

在当前的临床实践中,益生元和益生菌是调节肠道菌群失衡的主要治疗工具。 为了确定益生菌是否可以改变心肌梗塞后患者的预后,研究人员建立了大鼠心肌梗死模型,并在大鼠饮用水中随机给予GR-1或安慰剂和益生菌。  16S rRNA用于对大鼠盲肠微生物组成进行测序,两组之间无明显差异。 但是,心钠素的基因表达有所不同。接受GR-1的动物的左心室肥厚较轻,血液动力学参数更好。 停止使用益生菌后的四个星期,两组仍然存在差异,这表明在治疗结束后GR-1的作用仍然存在。 

益生菌可以用作预防冠心病和改善心肌梗死患者预后的潜在疗法。 益生元作为发酵底物,可以增强有益肠道菌群的活性,并有效改善血糖控制和血浆脂质分布。此外,益生元还可以改善肠道通透性,减少代谢性内毒素血症,减轻炎症,缓解糖尿病患者对葡萄糖不耐的症状

研究人员认为,粪便捐赠是一种治疗由于微生物引起的肠外疾病的新疗法。研究表明,健康人向代谢综合征男性患者捐赠粪便样本后,在6周后就会增加胰岛素敏感性和丁酸水平。 但是,该研究并未证实改善肠道菌群结构是否可以预防冠状动脉粥样硬化或降低AMI发生率。 需要大样本的前瞻性队列研究来进一步探讨肠道菌群与冠心病之间是否存在因果关系。

最近,研究人员发现DMB可以抑制TMA的产生。 抑制TMA的产生可降低小鼠的TMAO水平和动脉粥样硬化斑块形成,且无不良反应。 此外,在一些天然安全食品中也富含DMB,例如醋,红酒,初榨橄榄油和葡萄籽。因此,可以通过食用DMB胆碱来调节潜在的动脉粥样硬化来防止TMA产生

结语

本文介绍了肠道菌群与冠心病之间的关系,以及目前对这种关系的研究。 已经达成共识,冠心病患者的肠道菌群存在差异。 无菌小鼠模型和菌群基因组学技术的出现可以帮助确定肠道菌群与冠心病之间的关系,并将肠道菌群研究的准确性提高到菌株水平。

展望未来,早期发现和抑制冠心病发展,并进行干预调节是预防冠心病发展的关键目标。

【参考文献】

Liu Huagang,Zhuang Junli,Tang Peng et al. The Role of the Gut Microbiota in Coronary Heart Disease.[J] .Curr Atheroscler Rep, 2020, 22: 77.

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CM O, K R. Heartbeat: the gut microbiota and heart failure. Heart. 2016;102(11):811 TMAO increases the risk of cardiovascular disease

Richards EM, et al. The gut, its microbiome, and hypertension. Curr Hypertens Rep. 2017;19(4):36 

Pedersen HK, Gudmundsdottir V, Nielsen HB, Hyotylainen T, Nielsen T, Jensen BAH, et al. Human gut microbes impact host serum metabolome and insulin sensitivity. Nature. 2016;535(7612):376–81

乳腺癌和妇科恶性肿瘤辅助化疗后的肠道微生物组成

谷禾健康

辅助化疗可导致约三分之一的女性体重增加,葡萄糖耐量下降和高血压。这些事件的潜在机制尚未定义。这项研究评估了乳腺癌和妇科癌症辅助化疗患者的微生物组与体重增加之间的关联。近日发表在《BMC Medicine》上题为“The intestinal microbiome, weight, and metabolic changes in women treated by adjuvant chemotherapy for breast and gynecological malignancies”的一项小样本研究评估了乳腺癌和妇科癌症辅助化疗患者的微生物组与体重增加之间的关联。

方法:在开始辅助治疗之前招募患者。前瞻性收集有关肿瘤治疗,更年期状态和抗生素使用的数据。如果在研究期间接受抗生素治疗,则将患者排除在外。在治疗前和治疗结束后4-6周测量体重和身高。体重增加定义为体重增加3%或更多。治疗前收集粪便样本。并进行16S rRNA基因可变V4区扩增测序。数据使用QIIME 2进行处理和分析,并使用DADA2通过q2-dada2对读取进行了去噪和聚类。每个样品的读数均> 9300。使用Swiss Webster无菌小鼠进行了患者的粪便移植实验。

结果:招募了33名患者;其中9人增加了基线体重的3.5–10.6%。在治疗后体重增加的妇女的治疗前微生物组的多样性和分类学与对照妇女明显不同。与使用对照妇女的粪便样本进行移植的小鼠相比,从体重增加的患者的样本中进行粪便微生物菌群的移植诱导了无菌小鼠的代谢变化。

结论:肠道化学组的组成及其多样性与乳腺癌和妇科恶性肿瘤辅助化疗后体重增加有关。小鼠FMT实验表明,微生物组介导了化学疗法的不良代谢作用。值得进一步研究微生物组的预测价值,以及其对化疗后体重和代谢变化的作用机理。

 图一:化疗后体重增重的妇女的肠道微生物组与对照组妇女的肠道微生物组成不同 

图二:对GF小鼠使用化疗后体重会增加的妇女的预处理样本进行FMT,与不会增加体重的妇女的FMT相比,FMT会引起显著体重等指标的变化。

  图三 对GF小鼠使用化疗后体重会增加的女性预处理样本的FMT,与不会增加体重的女性(对照)相比,会引起显著的微生物变化。

参考文献:Uzan-Yulzari, A., Morr, M., Tareef-Nabwani, H. et al. The intestinal microbiome, weight, and metabolic changes in women treated by adjuvant chemotherapy for breast and gynecological malignancies. BMC Med 18, 281 (2020). https://doi.org/10.1186/s12916-020-01751-2

最新研究进展 | 行为和神经退行性疾病中的肠道微生物分子

谷禾健康

越来越多的证据表明,肠道微生物组会影响大脑的发育和功能。肠脑连接可能是由胃肠道中产生的各种微生物分子介导的,这些微生物分子随后会渗透到许多器官,包括大脑。

动物模型研究确定了从肠道细菌传播到大脑的分子线索,这些线索可能影响神经功能和/或神经发育和神经退行性疾病。

本文描述了已知或疑似神经调节活性的细菌代谢产物,定义了从肠道菌群到大脑的信号传导机制,并讨论了肠道细菌分子可能对特定脑细胞发挥的直接作用。 许多发现是最近才发现的,本“观点”中描述的发现在很大程度上是新颖的,尚待广泛验证。 

01

肠道微生物组-脑相互作用

肠道微生物群(肠道菌群)包含细菌或其他微生物,包括病毒,真菌,原生生物和古细菌,它们永久或短暂地栖息在下胃肠道,特别是小肠和结肠。尤其是结肠,数量最多并且拥有高度动态的代谢活动,微生物与宿主之间的分子不断双向流动,其范围从肠道延伸到整个体内。

这好比一个化学“工厂”,它会影响孕产妇的环境,并在产前使胎儿受到微生物信号的影响。

出生后,肠道菌群迅速建立并在在生命的头两年趋于稳定,从而使宿主与共生微生物之间形成终生且非常密切的关系。个体之间的多样性水平和微生物群的特定成员之间可能存在很大差异,并且可以根据年龄,遗传,健康状况,饮食和生活方式在个体内发生变化。

胃肠道包含许多不同类型的细胞紧密相邻,并且在管腔侧暴露于包含饮食成分和肠道微生物群的外部环境中。肠道组织内含有约70人体免疫细胞,不断地采集微生物成分保持体内平衡。

此外还有完全位于肠道组织内的丰富的神经元(108个内在神经元)以及连接肠道与脊髓和大脑的神经元沿着肠道进行密集的神经支配。

迷走神经是肠道与大脑之间的主要神经元连接,包括一束神经元,它们直接在肠道组织(和其他器官)与脑干之间发送和接收信号。这些信息进一步传递到整个大脑。

通过研究比较了传统定植小鼠(也称为特定的无病原体小鼠)与完全没有微生物接触(无菌小鼠)的小鼠,肠道微生物群影响大脑发育和功能的证据开始出现。

未经抗生素治疗的动物表现出神经营养因子水平的改变,例如脑源性神经营养因子(BDNF)以及异常的神经肽和神经递质水平,所有这些反过来可以影响关键的神经发育过程,如神经发生,突触发生,突触成熟和修剪,以及神经活动。

在特定的无病原体和无菌小鼠之间,大脑的总体形态和体积也有所不同,尤其是在杏仁核,海马和丘脑区域,在各种细胞类型的细胞水平上都观察到了形态变化,包括神经元,少突胶质细胞和在无菌和抗生素条件下的小胶质细胞。

微生物暴露还会改变宿主的神经系统状况,并导致信号传导途径发生变化。例如,在无菌和经抗生素处理的小鼠中,下丘脑-垂体-肾上腺轴失调,这会导致糖皮质激素反应过度。

这些下丘脑-垂体-肾上腺轴的变化与一些测试模式中的行为模式有关,这些测试模式对社交活动,焦虑,认知功能和抑郁行为进行了建模。具有某些健康问题和健康对照的个体之间的肠道微生物群不同。肠道微生物群落的失衡与各种神经系统疾病和心理疾病有关,尽管还需要确定其中哪些因果关系是相关的。

在自闭症,多发性硬化症,焦虑和抑郁症,认知缺陷的小鼠模型中,更成熟的细菌操作(例如用特定细菌治疗或用抗生素消灭细菌)已显示出改善疾病症状的作用。 同样,在帕金森病,自闭症,多发性硬化,焦虑和抑郁的人类模型中,细菌治疗对人脑活动的某些影响已可以通过在功能磁共振成像中观察到变化。 因此,越来越多的证据表明神经系统状态可能会受到肠道微生物及其副产物的影响

已经描述了改变的微生物组谱与大脑疾病之间的各种关联,并且微生物群或特定细菌物种对行为,认知和神经变性的贡献不断建立。

此外,肠道微生物组具有惊人的遗传多样性,从人类肠道微生物种群中测序出超过2200万个基因,并且拥有庞大的独特库,能够产生和修饰多种化学结构基团。 我们基于这些基础发现来描述和概念化化学信息的解码,这些化学信息如何介导肠道-脑轴的观察效应,从而为理解和治疗多种神经系统疾病提供希望。

以下各节将按肠道细菌和微生物代谢产生的生物活性分子(下图)转化的前体来源(从新细菌,宿主或饮食中获取的来源)来描述类别。 还提供了对特定分子作用的简要描述。

肠道菌群代谢物

02

细菌分子的产物

微生物会产生许多蛋白质,维生素和结构成分,这些物质或有益于宿主或对宿主产生负面影响。其中许多是通过多步生物合成途径产生的,而哺乳动物则没有这种途径。这些分子维持细菌功能,例如信号传导,结构成分和能源,尽管有些分子,如蛋白质毒素,主要以其影响宿主系统的作用而为人所知。

 微生物相关分子模式(MAMP)

微生物相关的分子模式(MAMP)是微生物细胞保存完好的成分,它们在整个身体中会被宿主(包括脑部)敏锐地发现。MAMPs对所有种类的微生物的结构完整性和基本功能都起着至关重要的作用,是由核苷酸、脂类、碳水化合物和肽等不同化学基团组成的复杂分子。

无菌小鼠中缺乏MAMPs会导致免疫和神经发育不完全,但是如果宿主对MAMPs的反应仍然升高或不受控制,它们的存在会诱发与各种神经系统疾病有关的急性或慢性炎症

两个主要的细胞表面成分MAMP似乎足以改变大脑发育和功能的是肽聚糖脂多糖(LPS)。

肽聚糖是几乎所有细菌细胞壁的结构成分,最近被证明可转移到发育中的大脑中,影响基因表达和社会行为。

LPS是革兰氏阴性细菌的另一种普遍存在的表面分子,已在大鼠大脑中与其受体共定位。LPS注射诱发小鼠疾病行为,认知障碍急性抑郁样行为,并影响胎儿大脑发育

此外,在自闭症,抑郁症,帕金森氏病和突触核病模型中,慢性或急性暴露于MAMPs可促进疾病相关症状的发生。

这些保守的微生物分子可能通过免疫介导的途径来调节哺乳动物的行为,它们通过大脑中表达的受体直接感知,或者激活全身炎症和细胞因子的产生,从而导致神经功能的改变、神经元应激或细胞死亡

MAMPs的存在,结构和免疫调节活性随细菌种类的不同而变化,因此肠道菌群的变化可能会影响宿主对特定MAMPs的暴露水平和反应水平,进而影响后续的健康状况和行为。

 毒 素

一些细菌产生的蛋白质毒素会对宿主神经系统产生负面影响。这些毒素在一般结构上通常是相似的,有多个亚基可以激活细胞表面或细胞内受体,并且可以由条件致病菌产生,它们可能在共生菌群中存在很长一段时间而不会在肠道或大脑中引起明显的疾病。

已知几种梭状芽胞杆菌会产生多种毒素,例如致命毒素,毒素B,ε毒素和肠毒素,它们可以通过全身循环到达大脑,破坏并穿过血脑屏障(BBB),抑制神经递质的释放和 /或降低从肠道到海马的目标神经元活力。 

Staphylococcus spp.和 Bacillus spp.产生毒素,葡萄球菌肠毒素和蜡样芽孢杆菌毒素Cereulide,刺激迷走神经,向大脑发送信号并诱发呕吐疾病行为

其他种类,如沙门氏菌和大肠杆菌产生一类称为淀粉样蛋白的蛋白质,这些蛋白质在肠内聚集,并可能以朊病毒样疾病模式扩散到大脑,并可能导致神经退行性变,例如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。

03

宿主代谢物的转化

随着营养物质的吸收和废物的分泌,持续的代谢流量通过肠上皮屏障得以维持。微生物群暴露于许多宿主分子并与其发生化学相互作用。肠道-大脑相互作用证据最多的两类宿主衍生代谢物是胆汁酸类固醇激素

胆汁酸 

初级胆汁酸是宿主胆固醇代谢的产物,在脂肪代谢和能量代谢中(甚至在大脑中)也起着主要作用。

循环中的胆汁酸可以穿过血脑屏障,并可能直接作用于大脑中的受体,或者通过激活肠受体而具有更间接的作用,导致成纤维细胞生长因子和胰高血糖素样肽1等信号的释放,从而影响多个脑区或迷走神经的神经元活性。

许多肠道细菌物种通过脱水酶的脱羟基作用、氨基酸基团与胆盐水解酶的解偶联作用以及其他酶机制的进一步降解作用,将初级胆汁酸修饰成次级胆汁酸,从而帮助维持胆固醇稳态。

细菌修饰改变了胆汁酸在膜和核受体上的信号传导,并改变了它们的溶解度循环

胆汁酸的存在和清除的调节与大脑的正常功能有关,因为这些途径中的缺陷会导致小鼠和人类出现许多神经表型,例如脱髓鞘,运动功能障碍,神经炎症,癫痫发作和学习障碍。

细菌对胆汁酸结合和水平的影响可能正在影响这些脑表型。 例如,在帕金森病,阿尔茨海默病,多发性硬化症,酒精依赖和自闭症的人和小鼠模型研究中已观察到细菌相关胆汁酸水平的改变,已知胆汁酸会影响下丘脑—垂体—肾上腺轴。

实际上,在阿尔茨海默氏病患者的大脑中检测到了细菌产生的所有次级胆汁酸,并且次级胆汁酸比例的增加与它们的认知障碍脑影像学改变有关。

一些胆汁酸甚至被用作神经系统疾病的潜在药物,如肌萎缩性侧索硬化症和中风。肠道中细菌的存在会改变整个宿主的胆汁酸水平,肠道菌群中的群落变化会影响胆汁酸的水平和性质。这些变化可能是有利的,也可能是有害的。

胆汁酸的微生物代谢与潜在神经功能之间已知的最机械的联系可能是微生物群直接增加的脱氧胆酸水平足以诱导肠道肠嗜铬细胞中主要神经递质血清素的产生

肠道5-羟色胺水平可能以未知的方式影响大脑功能,因为海马体中5-羟色胺的水平受小鼠微生物群的影响,但尚不清楚肠道与大脑5-羟色胺水平之间的任何进一步联系。 生物对胆汁酸的操作与脑功能之间的因果关系仍有待明确定义。

类固醇激素 

类固醇激素信号对于正确的大脑结构发育,认知,记忆,决策和性行为至关重要,并且在防止社交孤立和抑郁样表型中起着重要作用。 每天产生的这些激素中,有多达15%在肠道中可以检测到,因为它们在体内循环,使它们与微生物群接触。 

肠道菌群可以通过不同的降解和活化途径改变活性非活性类固醇水平的比例来影响某些激素的水平。 两个研究最好的类别是雄激素雌激素

在许多情况下,可以结合激素排泄,细菌可以通过水解酶(例如β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUSs)和β-葡萄糖苷酶)去除结合基团,水解酶可重新激活该分子,从而持续循环并具有活性。 

微生物群还可以将胆固醇转化为雄激素,激活前雄激素,并将睾丸激素代谢为其他有效的雄激素。人体粪便样品中的雌激素在氧化和还原反应中被分解。

实际上,“雌激素组”一词的产生是为了描述能够代谢雌激素的大量肠细菌基因。绝经后妇女肠道微生物群类固醇激素水平的变化相互关联,但是,尽管宿主激素的微生物代谢潜力很大,但对脑功能的直接影响仍未经测试。

如果受微生物影响的雌激素确实具有直接的神经学作用,则它们可能具有神经保护作用,因为雌激素对小胶质细胞具有抗炎作用,并且由于微生物群落改变而引起的雌激素水平降低似乎会增加认知障碍和慢性炎症

微生物可能足以满足这些表型的需要,因为某些类固醇激素水平可以通过微生物粪便移植在小鼠之间转移,但是需要进一步的工作将肠道微生物群产生的激素代谢物直接与神经系统疾病联系起来。

04

饮食代谢物的转化

肠道菌群的组成在很大程度上取决于寄主的饮食投入。进餐的频率食物的类型会影响被细菌代谢的底物的数量,这些细菌会大量吸收和减少,最终影响所产生的下游细菌代谢物的类型和数量

此外,大量证据表明氨基酸复杂植物多糖多酚等微生物代谢产物对大脑产生影响。

氨基酸 

微生物编码遗传机制以产生许多氨基酸,其中一些可以促进循环宿主水平。 但是,很可能微生物通过氨基酸水平对中枢神经系统的任何影响都是通过脱氨和脱羧途径对膳食氨基酸的修饰而发生的。 

细菌氨基酸代谢的副产物包括氨,短链脂肪酸(SCFA),单酚,吲哚衍生物,神经递质,有机酸,气态化合物和胺。 那些最有可能影响脑功能的物质如下所述。

肠道细菌编码多种基因途径,这些途径将芳香族氨基酸酪氨酸,苯丙氨酸和色氨酸代谢成一大串下游产物,其中许多是神经递质。 酪氨酸代谢为酪胺,然后代谢为两种儿茶酚胺多巴胺去甲肾上腺素。 无菌小鼠肠中的酪胺也诱导5-羟色胺的产生。 去甲肾上腺素是由肠道细菌产生的,但人们对此尚不清楚。

然而,已显示多种细菌在体外合成去甲肾上腺素至毫摩尔范围。 由微生物群产生的儿茶酚胺可能足以改变行为,因为用抗生素治疗的小鼠对可卡因的多巴胺信号传导和行为影响更为敏感。 这些神经活性分子是否影响局部肠道神经系统,甚至间接影响大脑,是研究的一个活跃领域。

色氨酸被微生物群分解为吲哚衍生物以及色胺和犬尿氨酸代谢产物,所有这些都具有神经活性属性。 其中一些似乎仅是由微生物群产生的,因为直到细菌定殖之前在无菌小鼠中都无法检测到它们。其中许多可穿过血脑屏障,因此源自肠道的循环色氨酸代谢产物可有助于大脑中的水平。

吲哚衍生物(如吲哚丙酸)具有抗氧化性能,使其成为阿尔茨海默氏病的诱人靶标,而其他衍生物(如吲哚酚硫酸盐)在慢性肾脏疾病模型中诱发神经炎症。

Kynurenine代谢物作用于神经元谷氨酸受体,并影响记忆,焦虑样和压力样行为。实际上,在饮食色氨酸(以及所有色氨酸微生物代谢物)耗尽后,用于模拟抑郁样表型的行为测试中,无细菌小鼠与无特定病原体小鼠的反应不同。

除神经递质外,酪氨酸还可以被微生物群代谢为其他简单的酚类,例如4-乙基苯酚或对甲酚。 这些代谢物被宿主迅速硫酸化为4-乙基苯基硫酸盐(4EPS)或对甲酚基硫酸盐。

在患有自闭症和精神分裂症的小鼠模型以及患有自闭症的儿童样本中,4EPS升高,且注射入野生型小鼠中引起焦虑样表型。 对-甲酚硫酸盐已被确定为自闭症幼儿的潜在尿液生物标志物,并且与社交和抑郁样行为小鼠模型中的少突胶质细胞标志物相关,尽管这些发现目前仍具有相关性。

受肠道微生物影响的另一种氨基酸是主要的兴奋性神经递质谷氨酸,它被细菌的谷氨酸脱羧酶系统代谢,成为主要的抑制性神经递质GABA。

GABA可以被细菌进一步代谢,通过GABA氨基转移酶和琥珀酸半醛脱氢酶进行琥珀酸化。此外,还已经确定了影响宿主GABA系统的微生物群产生或受其影响的代谢产物,例如γ-谷氨酰胺基氨基酸,其降低的水平是饮食诱发的癫痫发作模型改善的介质。 

已证明,产生GABA的细菌可减轻小鼠模型中的抑郁样和焦虑样行为,工程产生GABA的菌株足以降低对大鼠内脏痛的敏感性。产生GABA的微生物群与患者的抑郁呈负相关,并且据推测大脑中谷氨酸/ GABA回路的异常是焦虑症,重度抑郁症,双相情感障碍,精神分裂症和自闭症的关键。

精氨酸可被微生物群代谢为四种多胺,它们存在于所有哺乳动物细胞中,并在细胞生长和分化的许多一般过程中发挥作用,并通过谷氨酸受体调节突触可塑性和记忆形成。 这些多胺从精氨酸到胍丁胺依次产生,然后是腐胺,然后是亚精胺,然后是精胺。胍丁胺是大脑中α2-肾上腺素能和咪唑啉受体的配体。

多胺系统的失调与情绪障碍,抑郁症和阿尔茨海默氏病有关,并且多胺已被研究作为抑郁症和焦虑症行为,认知能力下降和药物依赖性的临床前治疗药物。 由于大多数哺乳动物神经递质是从氨基酸前体衍生的,因此我们推测,细菌将氨基酸转化为影响行为的分子可能代表了神经科学中新的微生物内分泌学重点,值得进一步研究。

复杂的植物多糖 

由复杂碳水化合物多糖制成的膳食纤维不会被宿主消化并到达结肠,在结肠中,肠微生物会通过肠道微生物将其与各种糖苷水解酶和多糖裂解酶一起发酵,形成毫摩尔水平的SCFAs。

SCFA主要是丁酸,丙酸和乙酸,是结肠上皮细胞的丰富能量来源,剩余的钙进入体循环,可能随后影响神经系统的功能和发育,视情况而定会变好或变坏。

例如,SCFA足以加重无菌帕金森病小鼠模型中的运动症状,但它们改善了实验性中风小鼠模型的恢复能力。 醋酸盐已被证明可穿越小鼠的血脑屏障,并减少进食行为。

由复杂碳水化合物多糖制成的膳食纤维不会被宿主消化并到达结肠,在结肠中,肠微生物会通过肠道微生物将其与各种糖苷水解酶和多糖裂解酶一起发酵,形成毫摩尔水平的SCFAs。SCFA主要是丁酸,丙酸和乙酸盐,是结肠上皮细胞的丰富能量来源,剩余的钙进入体循环,可能随后影响神经系统的功能和发育,视情况而定会变好或变坏。

例如,SCFA足以加重无菌帕金森病小鼠模型中的运动症状,但它们改善了实验性中风小鼠模型的恢复能力。 醋酸盐已被证明可穿越小鼠的血脑屏障,并减少进食行为。

多 酚 

多酚包含数千种至少包含一个酚基团的植物衍生分子,目前正在广泛研究作为神经疾病的治疗剂。

大多数多酚通常很难被吸收,直到被肠道菌群转化为可利用的生物活性代谢产物。 细菌解,酰化和/或酯化后,在这些代谢物重新进入胃肠道或到达其他周围组织之前,通过甲基化,硫酸化,羟基化或葡糖醛酸化来修饰宿主。

口服母体多酚后,大脑中酚类代谢物的水平会发生变化。在大脑中检测到的口服多酚治疗的特定细菌代谢物,例如3-羟基苯甲酸和3-(3′-羟基苯基)丙酸,能够抑制标志性淀粉样蛋白聚集并减缓阿尔茨海默氏病的病理生理学进展。

多酚还通过减少炎症并通过代谢产物(例如槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸和麦维京-3-O-葡萄糖苷)调节突触可塑性,来预防应激诱导的抑郁样行为

带有阿魏酸酯酶基因的肠道微生物将一种多酚阿魏酸释放到循环中。 阿魏酸的施用刺激了皮质酮治疗的抑郁症小鼠模型的神经发生,并且在阿尔茨海默氏病和脑缺血的小鼠模型中具有保护作用。

葡萄籽提取物和白藜芦醇等治疗中的多酚显示出有望治疗阿尔茨海默病,帕金森病和tauophathies小鼠模型的神经病理学和认知缺陷,但还需要进一步用纯多酚进行测试。

最近,在帕金森病模型中,表明植物来源的表没食子儿茶素没食子酸酯可以预防由特定肠道细菌引起的运动症状。 一些多酚是植物雌激素,被肠道细菌代谢成雌马酚和肠内酯衍生物。植物雌激素代谢物可以是雌激素受体的激动剂或拮抗物,并且可能对经典雌激素受体配体激活的神经保护途径有影响,尽管该结构类别很大且是异质的,对大脑的直接影响仍有待确定。

其他代谢物 

肠道中的微生物GUS酶可去除标记代谢物以被宿主排泄的葡糖醛酸基团。结果,微生物群恢复了原始分子并促进了该分子重新摄取回到血液。已证明该过程直接调节本文所述的许多外源和内源化合物的水平

肠道菌群还产生维生素B和K,以及独特的脂质代谢物,例如共轭亚油酸,羟基脂肪酸和鞘脂,其中一些在宿主健康和疾病中显示出生物学活性,并且已知由 特定细菌。 由于大脑发育过程中需要维生素B和K,大脑中的高脂质含量以及脂质在信号传导途径中的重要性,未来的工作可能会阐明微生物脂质和维生素代谢产物与脑功能的联系。

对细菌代谢产物的产生和功能的研究已经确定,从肠道到大脑都会发生活跃的化学信息传递。 其他细菌分子可能具有尚未定义的神经活性特性,包括来自肠道微生物群的数千种最近鉴定(但仍未表征)的短肽中的任何一种。 鉴于鉴定和表征微生物群产生的小分子和肽谱是一项相对较新的尝试,可能会继续发现更多的神经活性微生物代谢产物。确定作用机制可能导致各种健康应用。

05

微生物-大脑信号通路

肠道菌群与大脑之间的通讯管道包括迷走神经的激活,内分泌细胞(包括肠嗜铬细胞)的刺激,免疫介导的信号传导以及肠道衍生代谢产物从循环系统向大脑的运输。 认为所有由肠-脑轴组成的路径都被微生物群所影响,以影响大脑的活动和行为,并且通过它们中的任何一条发出的信号都可能与其他路径交织在一起。

迷走神经激活 

迷走神经直接沿着胃肠道将肌肉和粘膜层连接到脑干,并且是建立良好的信号通路,影响进食,焦虑样,抑郁样和社交行为。

肠道病原体和益生菌通过迷走神经元的激活影响这些行为,然后改变下游的神经活动,包括脑中BDNF,GABA和催产素信号的改变。 这些反应在迷走神经切断迷走神经后被消融,但是介导这些作用的特定细菌代谢物仍不清楚。 

最近的一项研究确实通过迷走神经信号传导来测量特定代谢物的作用,尽管也可能涉及其他信号传导途径。在这项工作中,将大鼠转化为能转化的大肠埃希氏菌菌株饮食中将色氨酸与TnaA色氨酸酶或吲哚生产缺陷的突变大肠杆菌转化为吲哚。 暴露于肠道吲哚的大鼠表现出增加的焦虑样和抑郁样行为并激活迷走神经元。

肠嗜铬细胞刺激 

肠嗜铬细胞是肠壁中的内分泌细胞,可响应持续的肠道信号而产生并分泌人体90%的血清素。血清色素的肠嗜铬细胞产生会影响其循环水平,并具有直接或间接影响大脑活动的潜力。

通过双歧杆菌属菌的益生菌治疗,已显示出在抑郁症小鼠模型中性能的提高。在一项研究中,该研究同时观察到大脑中5-羟色胺水平的增加以及体外肠嗜铬细胞中5-羟色胺前体的分泌增加。 然而,细菌处理,潜在的5-羟色胺调节与抑郁样表型之间没有机械联系。结肠肠嗜铬细胞确实表达各种微生物代谢物的受体并对其作出反应,包括MAMP,SCFA,芳香族氨基酸代谢物和次级胆汁酸。

最近鉴定出的一种细菌亚群可以极大地促进肠嗜铬细胞合成5-羟色胺生物合成的细菌,是孢子形成细菌,如梭状芽胞杆菌。

已证明这些细菌在体内产生的代谢产物足以在体外产生5-羟色胺诱导活性,包括α-生育酚,丁酸酯,胆酸盐,脱氧胆酸盐,对氨基苯甲酸酯,丙酸酯和酪胺。 还通过暂时的肠内给药单独测试了一个子集,并且脱氧胆酸盐,α-生育酚,对氨基苯甲酸酯和酪胺都足以诱导肠嗜铬细胞分泌5-羟色胺。 

有趣的是,最近的研究表明,口服选择性5-羟色胺再摄取抑制剂可提高肠道5-羟色胺的生物利用度并用于治疗抑郁症,可能依赖迷走神经的激活来改善小鼠的抑郁样行为。 这支持了5-羟色胺的肠嗜铬细胞产生的潜力,可能通过在发育和急性环境中与其他已知的肠脑信号传导途径相交,将信号传递到肠外并到达大脑。

免疫介导的信号传导 

肠道菌群为神经免疫系统的成熟提供了线索,而在发育过程中这些线索的丢失导致该系统终身功能失调。但是,由于肠道菌群变化和肠道通透性增加而导致的慢性暴露于炎症也可能会导致各种神经系统疾病。

用作MAMP的细菌代谢物(例如LPS)已被用于在ASD和精神分裂症模型中激活免疫系统,并在小鼠中诱发抑郁样症状。

其他肠道代谢物可能会减轻慢性炎症。 例如,SCFA通过激活GPCR和抑制HDAC活性而与免疫系统密切相互作用。 高纤维饮食会导致较高水平的SCFA,从而导致较低水平的循环促炎细胞因子。  

SCFA激活GPCR(FFA2和GPR109a)可以抑制炎症信号通路,SCFA(尤其是丁酸盐)对HDAC的抑制作用可以降低体内炎症。

这些例子可能代表了微生物分子对神经免疫信号的潜在影响的初步发现。

代谢物直接转移到大脑 

肠道中产生的许多微生物代谢产物可以不同水平和速率进入全身循环。 一个例子是多酚代谢物组,最近的研究表明,在血液或尿液中几乎检测不到母体多酚,但由多酚前体产生的细菌代谢物进入循环的水平足以发挥生物学作用。

实际上,大脑似乎是某些多酚类微生物代谢产物的主要目标。尽管仍然缺乏体内证据,但体外培养物显示多酚代谢物能够穿越BBB模型系统并对神经元培养物发挥保护作用,主要是通过减少炎症反应。 

此外,在大鼠的血液和脑中测定了口服多酚治疗的衍生物,发现它们可减少神经毒性聚集物的聚集并促进神经可塑性。

尽管建立了良好的肠道与大脑的联系,但通过每个导管工作的细菌分子的清晰机械细节仍然有限。 了解从肠道到大脑的微生物组信号的方式可能会提供对针对胃肠道靶标的合理药物发现平台的见解,这可能会克服当前将药物输送到大脑靶标的挑战。

06

大脑中的细胞特异性作用

研究继续建立在对肠脑轴的基础上,以探索大脑中哪些细胞受到特定细菌代谢产物的直接或间接影响。 需要大量工作来系统地证明源自肠道细菌的这些化学信使会影响特定脑细胞的发育或功能。 在这里,我们总结了肠道微生物代谢产物可能影响大脑细胞的现有证据。

神经元 

作为大脑控制行为的主要信号传导细胞,神经元从本质上讲可能是受此观点中描述的每种代谢物影响的最终靶标。 发挥影响迷走神经的细菌群落作用的所有未知代谢物都可能激活神经元。 

更具体地说,神经毒素是细菌分子影响神经元的一个明显例子。 一些神经毒素由微生物群落的共生成员产生,并发挥局部或中枢神经系统的作用,从而使神经元失调或杀死神经元。

微生物群还产生或诱导神经递质及其前体的产生,包括5-羟色胺,肾上腺素,GABA,组胺,乙酰胆碱,谷氨酸和多巴胺,它们可显着影响肠,迷走神经,周围神经和中枢神经元中兴奋性和抑制性神经传递的平衡。

神经元还表达模式识别受体,并且这些受体的激活已显示出可以调节神经元分化,增殖轴突生成以及神经炎症。 其中一些可能是由于宿主配体引起的,但是在大脑中也检测到MAMPs,例如肽聚糖,并且可能是激活受体,例如TLR2,PGLYRP2或NOD1,它们通过类似的机制在神经元中表达。

神经元也受SCFA的影响,因为乙酸进入大脑并激活下丘脑中的神经元。 最后,体外筛选鉴定了肠道微生物产生的神经活性分子,例如群体感应分子,这些分子会影响神经元的活力,形态,分化和炎症反应。

尽管后者需要在体内验证,它们说明了神经元与微生物代谢产物之间存在大量界面的可能性。

星形胶质细胞 

星形胶质细胞为其他细胞提供支持并修复大脑中的损伤。 代谢物,包括特定的寡糖和多酚,SCFA和色氨酸代谢物,可能会影响星形胶质细胞的功能。

色氨酸代谢物调节星形胶质细胞中的芳烃受体,并通过降低其炎症状态改变它们与小胶质细胞的相互作用来影响其活性

多酚代谢产物和纯短链脂肪酸(例如丁酸)对星形胶质细胞具有体外影响,并已显示出可减少神经炎症和氧化作用

大脑中的这些细胞将SCFA乙酸盐用作能源。 寡糖和多酚(例如来自植物巴戟天的多酚和多酚)已被细菌代谢成SCFA和其他脂质衍生物,已显示通过星形胶质细胞功能对阿尔茨海默氏病具有保护作用。星形胶质细胞还表达G蛋白偶联的胆汁酸受体1(TGR5),其可以被胆汁酸激活,从而导致神经炎症的减少,并且可能与肝性脑病有关。

少突细胞 

少突胶质细胞产生隔离神经元轴突的髓鞘,,即使在整个成年期,两种细胞类型之间也会发生动态串扰

代谢产物对少突胶质细胞增殖,分化和功能的影响可能对神经系统健康产生广泛影响。 在脱髓鞘疾病多发性硬化症的小鼠模型中,治疗性肠道菌群的操作已经成功,并伴随着与减轻的疾病症状相关的代谢组学谱的改变。

有一些证据表明,这种改善可能是由于炎症性LPS水平降低,SCFA升高以及胆汁酸改变所致,尽管尚不清楚是否存在对少突胶质细胞的直接活性或它们是否间接受益于炎症减轻。在体外,细菌性酚类代谢物对甲酚可能直接损害少突胶质细胞的成熟和髓磷脂的产生。

已知影响少突胶质细胞分化和髓鞘形成的另一类分子是雌激素分子。 微生物确实修饰了许多雌激素代谢物,但尚未证明这些代谢物的体内微生物产生与少突胶质细胞之间的结论性联系。

内皮细胞 

血管内衬有内皮细胞,内皮细胞是负责维持血脑屏障BBB的主要细胞类型,BBB在很大程度上决定了分子进入大脑的速度。 微生物代谢产物对血脑屏障通透性的调节可极大地改变药物,宿主分子和其他肠道代谢产物的吸收,但是这种机制的具体例子仍然难以捉摸。

例如,细菌代谢物(例如来自某些细菌物种的LPS)以剂量依赖性和细菌应变依赖性的方式增加体内渗透性,并且无菌小鼠的BBB似乎比常规小鼠泄漏。  LPS刺激内皮细胞也会导致脑海绵状畸形,进而导致癫痫发作和中风。 已经显示SCFA通过激活内皮细胞中表达的SCFA受体来降低BBB的通透性,并同时增加紧密连接蛋白的表达,紧密连接蛋白将这些细胞密封成成功的屏障。

小胶质细胞 

大脑中的主要免疫细胞称为小胶质细胞,因此,它是许多与神经炎症相关的损伤的罪魁祸首,如帕金森病,阿尔茨海默病。

因此,来自MAMP的促炎信号会诱导成熟并产生细胞因子的小胶质细胞,而通常来自多酚,SCFA和胆汁酸代谢产物的抗炎信号会通过小胶质细胞来降低大脑的氧化应激。 但是,这些信号中的某些信号对小胶质细胞的影响是复杂的,因为SCFA和其他微生物信号可能会加剧帕金森氏病无菌小鼠模型中的症状。

另一项最新研究发现,微生物色氨酸代谢物(如硫酸吲哚-3-)可控制小胶质细胞的活化,进而改变星形胶质细胞的行为。

尽管迄今为止,微生物组对细胞的特定作用的例子都很少,而且还进行了表面描述,但这些基础研究仍是揭示肠道微生物组-脑轴的潜在神经元回路,大脑区域和系统级连接的关键步骤。

07

展  望

对肠道微生物群研究的日益重视可能会导致生物医学的变革性进步。 识别和表征特定微生物和微生物群落的原因或贡献,应该是肠道微生物组-脑研究的主要重点。直接和间接化学信号传递的各种途径并不互相排斥,某些代谢物可能会对通向大脑的多个导管产生影响。随着微生物分子信息及其肠脑信号传导途径的特殊作用不断被发现,开发新的治疗原理和方法的潜力不断增加。

随着神经疾病中肠—脑连接的机制研究深入,微生物组和神经科学研究的合并为理解肠脑轴的基本“线路”和功能的提供了可能,并且还为人类健康可采取的行动提供了潜在的机会。

参考文献:

Needham Brittany D,Kaddurah-Daouk Rima,Mazmanian Sarkis K,Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions.[J] .Nat Rev Neurosci, 2020, undefined: undefined.


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微生物需要能源和细胞构成的材料。他们还需要使用液态水来达到自然条件,并且细胞损伤率要低于修复。当缺乏资源和自然条件时,微生物通常会进入某种形式的休眠状态(例如,通过停止细胞分裂,减慢新陈代谢速度或形成内生孢子),直到它们再次生长。例如,在晚上,营养养分等待太阳回来。在冬季,土壤微生物会等待温度升高。导致结核病等疾病的微生物可以保持多年休眠状态,等待抗生素或免疫系统轰炸的停止。

但是更长的时间尺度呢?与多细胞生命不同,微生物可以在极为广泛的条件下生存,并且在没有细胞分裂的情况下可以获取各种资源来维持细胞功能。这意味着它们有可能休眠数月或数年以上。从理论上讲,没有理由说微生物无法依靠维持能量生存数百年或数千年,甚至更长的时间,而几乎没有细胞增殖。由于缺乏对微生物休眠间隔时间的理论限制,因此出现两个问题:

(i)是否有证据表明存在休眠期很长的生物? 

(ii)这么长的等待时间有什么好处?

确定微生物生理学的唯一方法是将其与自然环境隔离,并在实验室中进行培养。许多处于休眠状态的种群具有充当“侦察兵”的单个细胞,它们会在随机时间退出休眠状态,以定期采样以恢复有利于生长的条件。这些侦察兵中的一些可以被赋予生长因子并进行培养。但是,依靠营养生长来研究能够长期休眠的微生物存在两个问题。 

第一个问题:

首先是来自许多环境的DNA的直接测序表明大多数微生物细胞在系统发育上不同于任何人曾经培养过的细胞。这可能是“平板计数差异法(the great plate count anomaly)”背后的驱动力,它认为许多样本中不到1%的细胞可以轻松培养。重要的是要注意,并非所有环境都会受到极高的平板计数异常的影响。经历快速环境变化或具有丰富养分的环境,例如人的肠道和最近被火山灰淹没的湖泊通常以易于培养的细胞为主。 

然而,对于许多条件稳定的环境,尚未培养的微生物进化支配着总细胞的丰度,并且存在巨大的平板计数异常现象。有充分的证据支持以下观点:这些群体尚未屈服于培养的原因是他们专心于慢速生长,在正常的实验室时间尺度上不容易加速生长。长期以来,人们认识到,如果将它们培养数月,可以从天然样品中获得更多的培养物。事实上,在培养耐培养演化支方面,最近最大的进展是在生长非常缓慢的生物体中。

高丰度的海水微生物(如Nitrosopumilus sp. Pelagibacter ubiquitans 和 Prochlorococcus sp. )一天或更长时间会翻倍,这意味着它们需要一个月或更长时间才能达到稳定阶段。

海洋沉积物微生物的培养和富集需要更长的时间,其中 Atribacteria 在5天内增加一倍,Lokiarchaeota 则在14-25天内增加一倍,而未培养的甲烷菌(ANME-2)在7个月内会增加一倍。这些培养物发展得如此缓慢,以至在人类时间尺度上几乎不可能进行详细的生理评估和基因操作,即使它们是经过技术培养的。

第二个问题:

依靠培养物来研究寿命极长的微生物的第二个问题是,营养状态下的生理状态可能与微生物以低代谢活动生存数千年时的生理状态大不相同。因此,虽然培养对于确保生物体的生理至关重要,但它不能用于研究每种情况下每种类型的超慢生长微生物。

因此,必须将培养工作直接研究天然样品中的超慢生物结合起来。然而,在自然样本中识别等待不频繁事件的多年休眠微生物是具有挑战性的。对于人类时间尺度的观察者而言,这种超慢速生物似乎无所作为。打个比方,加州海岸线是在地质时间尺度上不断搅动的岩石,但对人类来说,它足够稳定,可以在上面建造房屋。这些房子必须坚固到足以承受偶尔的地震,但在数百万年的旋转,淹没和挖掘中,它们将无法承受土地重新定向的影响。

幸运的是,现代海洋沉积物提供了一个天然实验室,可在其中研究长期休眠的微生物,而无需加快实验室培养中微生物的生长或等待数千年才能发生变化。通过将养分浓度的变化与沉积物的沉积速率进行比较,可以在很长时间内量化细微的地球化学变化。由此产生的反应-运输模型表明,向海洋沉积物微生物群落的总能量传递速率通常比支持实验室培养所需的能量传递速率很多数量级。这意味着这些微生物群落没有足够的能量来维持稳定的细胞分裂速度。

进一步的证据表明,在海底沉积物中埋藏在数米以内的微生物群落基本上处于非生长状态,这是因为即使种群正常生长也会发生突变或生态竞争的时间尺度之后,很少出现遗传上的新变化。这些生存的微生物群落的周转时间已被计算为几十年。这并不一定意味着细胞每30年经历一次传统的复制和细胞分裂。生物质量的改变可以通过逐渐取代所有的细胞物质来实现,脂质被脂质,核苷酸被核苷酸取代,从而在大约半个世纪的时间里,所有分子都被替换了。实际的细胞分裂事件可能需要更长的时间,或者可能永远不会发生,直到资源恢复,这可能需要数亿年。

这些微生物细胞几十年、甚至几百年、几千年或几百万年都没有复制,是因为它们在等待一个事件在这些时间尺度上发生吗? 

 另一种可能是,这些微生物不适应超长休眠,而只是在它们最终被俯冲到大陆之下并在俯冲带被压碎或烫伤致死之前,碰巧发现自己处于某种休眠状态数百万年。

尽管必须坚持多年静止生计的偶然选择,但有一些证据表明,在这种困境中发现自己的生物在进化上已准备就绪。随着河口沉积物深度的增加,微生物表达的酶对地下可用的底物具有更高的特异性,这表明它们具有一定的代谢活性以适应地下休眠。地下微生物还具有针对超慢代谢和细胞分裂的生理适应性。

此外,在地下发现的微生物进化枝不仅是持久存在的浮游动物群落的残余物,而且在被掩埋时不会消失。相反,它们不同于海水中发现的那些。

因此,在海洋沉积物中发现的生物虽然不能在那里真正生长,但很可能已经适应了在海洋环境中生活。但是,即使它们在长期休眠过程中经过了充分的调整和“快乐”,它们也必须在某个地方生长——自4.5亿年前地球开始以来,这些细胞就不可能一直处于休眠状态。

然后,我们必须问第二个问题:他们还在等什么?如果冬天在土壤中遇到休眠的微生物,我们可以假定它渴望在夏天变成营养状态。对于潜伏了数千到数百万年的深埋海洋沉积物生物来说,这相当于什么?他们的夏天是什么版本?

为了确定哪些事件导致长期休眠的生物体恢复其营养状态,我们必须假设一个进化框架,其中长期休眠是一种适应性的方法,最终在进化中获得回报。回报是有一天休眠的微生物会“醒来”,并产生后代,当这些资源可用时,它们首先获得这些资源,从而获得生存收益。

该模型的证据来自已在固定阶段研究多年的实验室培养。当在饥饿条件下将静止培养数月或数年的大肠杆菌培养物与新鲜生长的大肠杆菌培养物竞争时,预先适应的培养物会胜过新鲜生长的培养物,这种特性被称为静止期的生长优势。如果生活在海洋沉积物中的微生物也是如此,那么如果它们有机会竞争贫乏的资源,它们就会比更新鲜的生物有优势,就像习惯了匮乏的瑜伽士在饥荒中与贪吃的人竞争一样。

对长期休眠的适应可能是由生长资源的变化所驱动的,这些生长资源随相当长的时间尺度的周期变化而变化。由于海洋沉积物微生物处于数百至数百万年的休眠状态,因此它们很可能“等待”在这些时间范围内发生的事件。地质过程发生在足够长的时间范围内。在较短的时间范围内,微生物可以适应多年的洪水,干旱或暴风雨周期,就像蝉经历了长达17年的滞育期一样。但是,在更长的时间尺度上发生的地质事件也可能导致休眠。

海洋沉积物中休眠的微生物回到营养新鲜的海底后,可以重新进入营养状态。由于生物扰动作用、小重力流或极端风暴事件,上层公尺以上的沉积物可以被挖出并重新沉积在海底(如果水足够浅)。埋藏得更深的沉积物可能在更长的时间尺度和更大的事件中被挖掘出来。整个海底悬崖可能会因海底滑坡,塌陷或浊流而重新分布。

在更长的时间范围内,当大洋板块撞击俯冲带中的其他大洋板块或大陆板块时,那些埋藏在数百米深的海洋沉积物中幸存下来的微生物可能会被挖出来。在这里,增生棱柱或火山泥喷发为使一些深埋的微生物脱离休眠提供了潜在的机会。

其他环境,例如古老的多年冻土也可能具有长期休眠的生物。尽管重要的是要指出,由于气候变化,现代多年冻土的融化速度快于预期,但这类生物的进化回报可能是在米兰科维奇循环之后的冰川期结束。

注:米兰科维奇循环是指一个地球气候变动的集合影响。以十万年为主要周期,伴随着四万年以及二万年左右的周期。与三种地球绕日运行轨道的变化有关。这三个影响因素也造成了地球的冰期与间冰期,大都与太阳辐射变化量有关。

正如微生物不依赖于氧气一样,它们也不依赖于达到一定的增长率。众所周知,厌氧呼吸的能力会增加微生物的环境范围,从而防止将其囚禁在有氧环境中。同样,微生物在长期,甚至是非常长时间匮乏中的生存能力使它们的栖息地在更大的时间范围内扩张。时间本身成为一种资源,微生物可以利用它进入新的栖息地。他们可以等待资源补充事件,而这超出了受限于更快生长速度的生物体的时间范围。

这种超慢的微生物可以被看作是在经典的 r vs. K 策略的生态框架中的K策略者,它们具有较慢的繁殖速度,更长的寿命并保持稳态种群,以最大程度地利用环境的承载能力。

注:物种有两种生存策略。K策略:培育一两个,每一个个体都是高质量和长寿命。R策略:培育很多很多个体,以数量来博取生存概率,每个个体都比较脆弱,死亡很多。

当然,需要注意的是,像这样的生态范式是围绕多细胞真核生物而设计的,包括对后代繁殖和体型的预测,而这并不能完全转化为在地质时间尺度上存活的微生物。因此,将时间视为微生物资源的新颖性并不意味着一种新的生态范式,而是一种新的生态位。通过积极关注微生物是如何利用大范围的时间尺度,或许比以前所认为的更长的时间尺度,我们可以为微生物和地球系统如何相互作用开辟新的认识。


参考文献:

Karen G. Lloy, Time as a microbial resource, Environmental Microbiology Reports, 04 October 2020

细菌拮抗作用在细菌生活中的核心作用

谷禾健康

大多数细菌可能存在或至少有一部分时间处于单细胞状态。在这种单细胞状态下,细菌将更容易受到一系列威胁,包括其周围环境的物理或化学性质的简单波动,更容易受到更直接的生物威胁,如抗生素、噬菌体、拮抗细菌,甚至是捕食性单细胞真核生物。因此,每一个细菌细胞都必须具备应对这种威胁的能力,微米尺度上单细胞生命的所受压力和威胁是形成细菌进化的主要力量。考察拮抗作用在自然群落中的研究表明,拮抗作用可以发挥多种作用,从促进原始生境的定殖到维持细菌群落的稳定性

细菌与其环境相互作用的研究历史上一直集中在获取营养和抵抗非生物胁迫的策略上。这种关注淡化了细菌生命的第三个方面,而这是它们存在的同等重要的方面:即,拮抗细菌对生存的威胁。刚刚,发表在Current Biology上的一篇来自美国华盛顿大学医学院的一篇题为:“The Central Role of Interbacterial Antagonism in Bacterial Life”的文章对这一问题进行详细的讨论和论证,证明了细菌间拮抗作用的普遍性和重要性。细菌间拮抗途径的多样性和普遍性越来越明显,细菌间毒素解除其靶标的隐蔽方式强调了这些过程的高度进化性。拮抗途径的普遍性必然与同样广泛的防御策略相匹配。这些与特征明确的中央应激反应途径重叠,突出了细菌相互作用对塑造细胞生理的贡献

背景:

一种细菌可能比另一种典型的细菌具有同等甚至更高的地位,并对这种典型的细菌来造成威胁。在一项综合分析中,考虑并权衡了地球上细菌的主要栖息地,得出的结论是,20-80%的细菌是表面相关的,并且证明了在细菌小尺度上的多样性,常常是细菌物种之间直接的细胞-细胞接触。这些观察结果延伸到栖息地,如土壤、深海和大陆亚结构,人类肠道和口腔。因此,存在一个合理的“物理证据”,表明细菌通常彼此紧邻生活。 现在,要了解在这些相互作用过程中发生了什么,即它们在本质上是拮抗的还是合作的,我们必须从体外实验基因组证据和理论模型中进行推断。

拮抗途径的多样性和普遍性

自二十世纪初从链霉菌属中分离出首批抗生素以来,人们就已经意识到细菌杀死或抑制其他细菌生长的能力。 

  然而,随着细菌学逐渐发展成为一门专注于纯培养中有机体研究的学科,细菌间相互作用的表征不再受欢迎,细菌拮抗作用的研究也主要局限于寻找与临床相关的抑制分子。在21世纪早期,人们发现细菌也可以通过特殊分泌系统的作用,用抗菌毒素来对抗密切接触的邻居。很快就发现这种机制很普遍,这促使了细菌间拮抗作用研究的复兴。

随着研究兴趣的增加和基因组数据的大量涌入,发现细菌间拮抗机制的速度正在增加。所有主要的细菌门现在已经被证明具有拮抗途径,在许多情况下包括接触依赖和非依赖机制(表1和表2)。确定的可扩散毒素包括经典的小分子抗生素,它们是链霉菌的研究重点,也包括蛋白质毒素,其大小从肽到多亚基组合。接触依赖性拮抗作用由多种特殊分泌系统介导,包括革兰氏阴性菌的IV型、V型和VI型途径以及革兰氏阳性菌的Esx分泌系统。这些系统中的每一个都向邻近细胞传递毒性效应蛋白,并利用同源免疫蛋白来防止自身和亲属中毒。

接触依赖性的细菌间拮抗作用也可以通过其他途径发生,如外膜融合介导的粘液球菌毒素交换,茎杆菌中淀粉样细菌素的表面相关产生,以及芽孢杆菌中带有羧基末端毒素结构域的肽聚糖锚定YD重复蛋白的产生。

从整个系统发生学的角度来看,不仅细菌间的拮抗机制是多种多样的; 单个物种本身可以编码多方面的拮抗武库。

   多样化发生在许多层面上,包括携带多种独特拮抗机制的物种(图1),给定机制的非冗余形式(即多种毒素输出分泌途径)以及通过单个传递系统传递的过多效应子。 在生物体中发现的拮抗途径之和可占细胞总编码能力的重要部分。例如,铜绿假单胞菌编码至少六种不同的使竞争对手中毒的方法,它们共同构成了基因组的190 kb(3%)(图1A)。其中一些包含相关系统的非冗余版本,包括三个VI型分泌系统(T6SS),每个系统与多达七个独特的分泌效应子相关。 该细菌还拥有编码两种接触依赖性抑制(CDI)和三种可扩散的蛋白质毒素(称为pyocins)的基因。 革兰氏阳性枯草芽孢杆菌编码相似而广泛但不重叠的拮抗机制(图1B)。

细菌间毒素的潜伏性

细菌间拮抗途径的有效性不仅仅是其毒素内在效力的函数。毒素必须克服由细胞防御系统产生的耐受性,这些防御系统因其造成的损害而被激活,作用于细胞质分子的毒素必须突破细胞包膜,而成功的中毒策略应该相对不受抵抗力的影响。

  许多抗菌毒素作用于不易从细胞外部进入的分子。 例如,似乎大多数T6SS毒素在周质中起作用,尽管有一些争论,但证据表明至少在铜绿假单胞菌中,该分泌装置最初将其抗菌蛋白传递至该隔室。 因此,具有细胞质靶标的T6SS底物需要一种穿过细菌内膜的手段。尽管这些蛋白的胞质进入细节仍然未知,但是T6SS毒素似乎并不需要通过接触依赖性抑制(CDI)系统传递毒素的特定内膜受体。

   确实,铜绿假单胞菌的一种T6SS毒素Tse6似乎通过一种相当独特的机制克服了这一障碍。 该毒素可降解基本的细胞内代谢产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),与细胞中最丰富的蛋白质之一,延伸因子Tu(Ef-Tu)紧密相互作用。 这种相互作用对于生化活性和毒素分泌都是必不可少的,但是破坏Tse6-Ef-Tu相互作用会使蛋白质完全无法作用于受体细胞。缺乏详细的机理理解,但简约产生了一种模型,其中Ef-Tu相互作用可能通过在细胞质内动态捕获Ef-Tu-相互作用基序来促进内膜上的Tse6易位。

通过T6SS,T4和Esx分泌系统传递毒素需要长时间的细胞间接触,这阻止了在流体条件下使用这些拮抗机制。 相反,由T5SS介导的CDI途径可以在液体培养物中生长的细胞之间起作用。  CDI毒素共有的一系列独特特征,它们在与靶细胞发生相对短暂的接触后介导其摄取。  CDI毒素以前被描述为“棒上的毒素”,因为它们由一个延伸的氨基末端细丝组成,该细丝通过b-barrel蛋白和一个羧基末端固定在分泌部位的生产细胞上 毒素结构域传递到细胞。 该报道表明,在没有靶细胞的情况下,在挤出毒素或相邻的FHA-2结构域之前,细丝的分泌会停止。 这导致发夹形结构的表面呈现,该结构由毒素的丝状部分的前半部分组成,该部分的末端具有负责靶细胞中受体结合(RBD)的域,而其余部分则由 蛋白在分泌之前向分泌通道延伸或位于周质中。 当RBD与其靶细胞上的受体结合时,分泌停滞得以缓解,并且FHA-2结构域与靶细胞的外膜缔合并嵌入其中。这随后促进了羧基末端毒素结构域向靶细胞周质的移位。 毒素中特定的脯氨酸丰富结构域被证明与分泌停滞有关。值得注意的是,缺乏该结构域的细胞在固体培养基生长条件下仍能够使靶标中毒,但丧失了在液体培养中起作用的能力。 这项研究说明了抗菌毒素访问其靶分子的途径如何对有效递送它们的条件产生深远的影响。

毒素的独创性远远超出了它们到达目标的阴险方式;如果没有办法颠覆抵抗的出现,毒素将很快被解除武装。一种“数量上的优势”方法,即通过不同机制同时传递多种毒素,可能在一定程度上已经在接触依赖型毒素传递系统中进化出来,以解决这一问题。这种策略还有一个额外的优点,即允许毒素协同作用,并便于在一系列环境条件下中毒,否则这些环境条件可能会使单一毒素的活性失效。

个别毒素也可以拥有自己的抗性颠覆解决方案。 例如,Serratia proteamaculans的ADP-核糖基酶和T6SS底物Tre1所采用的主要中毒机制是通过修饰细胞分裂蛋白FtsZ来阻止细胞分裂。然而,Tre1的活性并不局限于这个靶点;它对核糖酯表面可接近的精氨酸残基的随意修饰能力使得Tre1能够修饰其他一些必需的蛋白质。因此,如果FtsZ获得了一个突变,使其对修饰具有抵抗力,那么Tre1原则上仍然可以通过其他方式使细胞失活。

自然环境中的细菌间拮抗作用

尽管基因组证据和实验室研究对跨域细菌拮抗机制的普遍性毫无疑问,但这些机制在自然环境中的作用才刚刚开始受到关注。生物体之间的相互作用很难在原位进行监测,特别是在高度多样性的生境中或在难以实时访问的地点,如哺乳动物的肠道中

尽管如此,采用一系列方法和不同模型系统的研究已经开始出现,这表明拮抗作用可能是细菌栖息地的一个普遍特征

土壤包含地球上最多样化的微生物组合之一,长期以来被认为是具有拮抗能力的有机体。最近,来自特征不明显的Acidobacteria, Verrucomicrobia, Gemmatimodetes 和 Rokubacteria的土壤细菌被证明编码多种途径,以产生可作为抗菌药物的次生代谢物。然而,在土壤细菌中也经常检测到诸如交叉取食和降解协同作用等合作特性,这导致一些人质疑这种环境中拮抗作用的作用。经典生态学理论预测,两种生物所居住的生态位越重叠,它们就越有可能参与竞争行为,这就导致了这样一种假设,即土壤细菌之间的拮抗作用在邻近的相关生物之间最为强烈。有两类细菌,链霉菌属(Streptomyces sp.)和荧光假单胞菌属(Pseudomonas

fluorescens)两类细菌,它们能产生小分子抗菌剂,并能参与由细菌素介导的拮抗作用。来自同一采样点的链霉菌对比从远端采集的成对链霉菌更可能表现出拮抗作用,如果它们表现出相似的营养需求。

与链霉菌一样,具有相似营养需求的荧光假单胞菌菌株之间的相互抑制作用比那些有不同需求的菌株更强。值得注意的是,这两项研究都发现,抵抗对抗性的能力比积极抑制另一种菌株的能力更广泛。

从相关土壤细菌之间的相互作用得出了两个进化结果:获得对竞争菌株产生的毒素的抗性和/或营养专业化以避免拮抗作用。对其他细菌种群的研究将有助于解读这些细菌是否是土壤有机体中的普遍现象。

考虑到微生物在哺乳动物肠道中的定殖密度,一系列的拮抗途径是由栖息在这个生态系统中的细菌编码的就不足为奇了。然而,在没有扰动的情况下,肠道微生物群落非常稳定,这就提出了一个问题,即在这种环境中如何以及何时使用拮抗机制。这可能是肠道内的拮抗作用对于介导婴儿最初定植过程中的细菌间竞争至关重要。对拟杆菌属中T6SS基因丰度的宏基因组数据集的分析似乎支持这一点。 脆弱的芽孢杆菌特异性T6SS在婴儿定殖菌株中比在成人中更常见。使用生生物小鼠和模型社区的实验支持了该系统在肠道定植过程中的作用。的确,脆弱芽孢杆菌的T6SS有助于对生食性小鼠中敏感菌株的定植抗性。

然而,对成年肠道群落中包括T6SS在内的拮抗途径的测量表明,它们还起着最初定殖以外的作用。事实上,脆弱的芽孢杆菌的T6SS有助于gnotobiotic小鼠对敏感菌株的定殖抗性。此外,另外两种类杆菌T6SS及其各自的效应器编码在移动元件上,证据表明,在同一宿主上定殖的菌株通过水平转移获得和保持这些元件具有很强的选择性压力,从而导致效应器和免疫基因对的相容性。

在成熟的肠道菌群中,支持拮抗作用至关重要的其他证据来自获得性细菌防御(AID)和重组相关的AID(rAID)系统的发现。 这些由孤儿免疫基因组成的拟杆菌属元素普遍存在于成年肠道元基因组中,并且能够完全中和通过拮抗拟杆菌属菌株而递送的相应毒素。有趣的是,rAI簇显示出活跃基因获取的特征,表明它们可以起到适应性免疫功能的作用-与CRISPR阵列类似,但可以防御细菌间的拮抗作用而不是噬菌体攻击

与rAID簇中编码的许多基因最接近的同源物是与T6SS以外的毒素传递途径相关的免疫基因,这些基因在拟杆菌属的外部发现,这增加了该系统对不同拮抗剂提供保护的可能性。 这些孤儿免疫基因簇在肠道细菌中的流行表明,对局部产生的毒素的抗性的获得促进了原本不相容的菌株之间的共存,这反过来又可能有助于群落的稳定

进一步的证据支持成熟肠道菌群中拮抗作用的关键性质来自获得性细菌间防御(AID)和重组相关的AID(rAID)系统的发现。这些由孤儿免疫基因组成的类杆菌素广泛存在于成人肠道异源基因组中,能够完全中和通过拮抗拟杆菌菌株传递的相应毒素。有趣的是,rAID簇显示了活跃基因获取的特征,这表明它们可以发挥适应性免疫功能-类似于CRISPR阵列,但用于防御细菌间的对抗而不是噬菌体攻击。与rAID簇中编码的许多基因最接近的同源基因是与毒素传递途径相关的免疫基因,而T6SS则是在类杆菌之外发现的,这增加了系统对不同拮抗剂提供保护的可能性。这些孤儿免疫基因簇在肠道类杆菌中的流行表明,获得对局部产生的毒素的抵抗力促进了其他不相容菌株之间的共存,这反过来可能有助于群落的稳定。

作为可扩散抗微生物剂在成熟肠道菌群中作用的一个例子,已经确定了一个四元细菌联合体,它对小鼠的抗万古霉素肠球菌(VRE)具有定植抵抗力。这种预防作用需要革兰氏阳性菌Blautia Producta产生一种广谱的特异性抗菌肽。强调定植抗性可以在临床中发挥重要作用,接受造血细胞移植的患者对VRE感染敏感,他们拥有生产这种抗生素的基因。

革兰氏阴性菌产生的可扩散抗菌剂同样在肠道菌群中起重要作用。拟杆菌分泌抗菌蛋白,称为类杆菌分泌的抗菌蛋白(BSAP),针对靶细胞上的特定表面分子。对BSAPs的抗性是广泛存在的,并且通过与毒素基因相邻的其他靶基因的表达来介导。

在人类肠道易位基因组中,当存在BSAP基因时,具有抗性目标等位基因的菌株会富集;因此,就像由拟杆菌的T6SS介导的拮抗作用一样,这些生物体产生的可扩散的抗菌蛋白可能会在定植于不同个体的菌株之间进行兼容性选择。

上面描述的例子强调了细菌拮抗作用在原始生境定殖和捍卫已建立种群中的潜在作用。 研究表明,这些途径的第三个作用在于介导入侵。肠霍乱弧菌,霍乱弧菌和伤寒沙门氏菌均编码T6SS,有助于肠道菌落定植或表现出针对体内的共生物种。细菌素也可以介导肠道的侵袭。产质粒编码细菌素的粪肠球菌能够特异性地侵入并取代本土的粪肠球菌,并且通过改变共生微生物群落,由单核细胞增生性李斯特菌的强毒菌株产生细菌素可促进小鼠肠道定植[93]。而单核细胞增生Listeria monocytogenes菌强毒株产生的细菌素通过改变共生微生物群落来促进小鼠肠道定殖。

拮抗机制可以与外界干扰协同作用,促进病原菌入侵。发现鼠伤寒沙门氏菌的肠杆菌科特异性细菌素colicin 1b有助于其仅在炎症期间与小鼠肠道中的共生大肠杆菌株竞争,这通常会破坏肠道群落结构并促进蛋白细菌种类的生长。有趣的是,在这种情况下,肠道共生物种可以采取反策略。大肠杆菌Nissle通过产生称为微素的抗菌肽来抑制入侵的沙门氏菌的生长,这种抗菌肽是响应低铁而引起的,这是发炎的肠道的标志。此外,微素通常与铁载体偶联,从而促进铁载体被靶细胞中的铁载体吸收,而靶细胞必须主动清除铁才能维持其活性。

由于实验研究已提供证据证明细菌间的拮抗作用是微生物群落中普遍存在的一个方面,因此关于拮抗相互作用如何影响群落动态的问题也就出现了。报告表明,许多栖息地中存在的高水平细菌多样性可以通过合作代谢交叉喂养来解释。然而,这些研究往往未能明确解释活性拮抗机制,而只关注营养素的竞争。

关于合作以及拮抗和剥削性细菌间竞争对人类肠道群落动力学影响的数学模型表明,与直觉相反,拮抗作用促进稳定性。在这项分析中,合作是不稳定的,因为它有可能在物种之间建立依赖关系,从而对群落产生整体不稳定的影响。相反,对抗促进了广泛多样性水平的稳定。这项研究还确认了空间隔离是一种通过抑制物种相互作用程度来促进群落稳定的机制。

最近对鱿鱼共生菌Vibrio fischeri 的T6SS系统在寄主定殖过程中的功能的研究提供了一个真实例子,说明空间隔离和拮抗协同作用,以构建微生物群落。在这个例子中,作者发现编码T6SS的V. fischeri菌株和那些易中毒的菌株可以在同一种动物中共同定居,但只能通过占据鱿鱼发光器内不同的、空间隔离的隐窝。

对抗性防御

如果细菌间的拮抗作用像上面描述的基因组学、机械学、原位和理论研究所表明的那样普遍存在于微生物生命中,那么细菌也会进化出许多防御这些攻击的方法。一种潜在的防御机制仅仅是为了发动更好的进攻,这可能是导致对抗机制多样化和多样化的一个因素,而这些机制是由单个菌株编码的。一个有机体可以采用的相关策略是,根据特定竞争对手存在时特定活动的选择性优势,对其产生的毒素进行编码。后一种方法的一个例子是Rhs毒素。这些大的,多态性毒素由一个与羧基末端毒素相连的重复区域组成。

然而,这些对缺乏分泌所需毒素的重复部分。在鼠伤寒沙门氏菌中,这种细菌的反复传代选择了一个带有Rhs毒素的克隆,其中祖先的CT域被下游的CT域取代。这种菌株的选择是通过破坏编码这种CT毒素及其免疫决定因子的开放阅读框来实现的。尽管重组介导的毒素结构域交换尚未在该系统中得到实验验证,但编码奈瑟菌物种多态性MafB毒素的基因簇显示出类似的结构。

第二种颠覆对抗作用的方法是获得免疫决定因子,这些决定因子能够保护机体免受特定毒素的侵害(图2)。如上所述,这似乎是肠道拟杆菌的普遍特征。虽然目前为止,这些生物是唯一一个编码免疫基因阵列的群体,这些基因似乎是主动获得的,并且已经被功能性地描述过了,其他一些被称为“孤儿”免疫基因的例子也被描述过,这些基因被预测能够保护它们免受非编码它们的生物体制造的毒素的侵害。

此外,与土壤中的生产者物种相比,土壤中具有抗小分子抗生素抗性的基因更为丰富,这表明它们在保护目标细胞方面发挥着更广泛的作用。

众所周知,在临床环境中,细菌应激反应会导致抗生素耐药性。然而,这在很大程度上被认为是其提供非生物应激源保护作用的真正功能的不幸副作用。

在广泛抗菌拮抗证据的背景下重新审视这些途径,我们认为提供保护免受生物攻击实际上可能是它们在自然界的主要功能。压力反应途径的例子支持了这一点,这些途径提供了复杂的方法来对抗其他细菌产生的特定毒素的作用。例如,土壤细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)利用一系列互补机制来抵抗镧系抗生素(由许多革兰氏阳性细菌产生的多环肽抗菌剂)的中毒Bacillus subtilis对镧系抗生素的防御措施包括合成带负电荷的脂肪酸,它能减缓阳离子肽穿过细胞壁的速度,产生膜信号肽酶SppA,被认为有助于肽抗生素在细胞膜中降解,诱导噬菌体休克蛋白同源物,保护膜不受造孔镧系物的影响。

另一条将应激反应途径与细菌间拮抗联系起来的证据是来自另外一篇研究中,他们称之为竞争感应。这些作者提出了这样一个假设:细胞损伤表明存在拮抗竞争对手,诱导拮抗机制与修复系统协同提供了一种同时抵抗和反击攻击的手段。在铜绿假单胞菌中,应激反应机制和拮抗途径也受到协同调节,但由一种被称为副(绿脓杆菌对拮抗作用的反应)的不同机制。由溶解性抗菌毒素活性释放的细胞内自源性内容物作为旁分泌信号,刺激附近细胞中Gac/Rsm全球转录后调节通路的激活(图2)。随之而来的是T6SS的引入,以及共同提高对抗敌手竞争能力的其他因素。Gac / Rsm调节子中的许多基因没有已知的功能,这表明在这种生物体中尚需表征提供对抗拮抗作用的其他机制。

结论

细菌间拮抗途径的多样性和广泛分布,这些机制有助于细菌适应环境和在无数环境中竞争生存。这一点很重要,因为任何试图改造细菌群落(包括肠道微生物群落)以改变其特性的尝试,都必须包括一种方法,使引进的生物体能够与它们总是会遇到的其他菌相互作用进行抗衡。拮抗途径多样化的一个更微妙的潜在结果是,它们有可能成为毒素的进化库,包括细菌病原体用来对抗哺乳动物宿主的毒素,以及真核生物水平获得的抵御细菌的毒素

表1 细菌拮抗作用的非接触依赖性机制。

表2 接触依赖性细菌拮抗途径

图1  细菌基因组中充满了编码各种细菌间拮抗途径的基因座。

图2 革兰氏阴性细菌对T6SS的多种防御途径。