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升级版微生物16s测序报告|解读

谷禾健康

微生物多样性测序(扩增子测序)是基于二代高通量测序对16S/18S/ITS等序列进行测序。可以同时检测样本中的优势物种、稀有物种及一些未知物种的检测,获得样本的微生物群落组成以及相对丰度。

相信关注我们的小伙伴对此并不陌生。

这次我们整合了大家平时会遇到的一些问题,在原有的基础上对报告进一步完善。

报 告 全 新 升 级 

想知道总体结果?先看这

——项目概述

重要指数 :★★★★★

这部分内容必看

主要是汇总信息,包括样本数据量,测序质量,重复性效果评估,分组信息,组间差异评估,代谢途径上差异,功能预测等。

这里会给出本项目中的一些重要提示,帮你从众多的报告信息中获取关键的部分。

实验、分析流程怎么写?

——技术介绍

重要指数 :★★★

技术介绍这部分内容,就是说我们基于是怎么样一个测序平台、什么方法来获得的最后的数据。

如果你担心  

这么直观的报告,

会不会不够详细?

小问号里有宝藏!

如上图,点击实验流程旁边的小问号,弹出的文件夹里就有详细的英文版方法介绍。

数据质量怎么样  

——OTU/ASVs结果统计 

重要指数 :★★★★

这部分内容主要是数据统计的图表:

Raw-tags:  样本的原始序列数据

Singleton: 无完全匹配的单条序列数量

tagsmatchedASVs: 比对到最终ASVs的序列数据

ASVs:以及ASVs的种类个数

参数自由选择,图片灵活生成

——物种注释及构成

重要指数 :★★★★

经过SILVA138数据库的注释,得到ASVs的物种注释结果。

这一部分可以看到每个样本的物种构成比例,Taxonomic Level 可以选择Level1 ~ Level7 界门纲目科属种,不同分类水平下的物种构成。

这里选择level2就是“界”层级(可根据需求自选),另外比如选一个groups分组,如下:

柱状图太宽?太窄?

一拉即可调整!

同时给出了各分类水平的相关原始数据,可以到对应路径进行查看。

表格任意排序,3D动图自由切换

——多样性分布结果

重要指数 :★★★★

α多样性

评估单个样本内的物种构成的丰度情况

使用Qiime2进行α多样性分析,分别计算获得simpson,ace,shannon,chao1以及goods_coverage数据统计结果。

β多样性

通过降维的方法来考察样本与样本之间的相似度和关系,种属构成特征。

三种聚类方式:

Beta多样性PCA、非加权距离的PcoA、加权距离的PcoA的3D图。

按住鼠标随意拖动,可以看到任意角度的三维坐标自由变换。

大小可自行调整

多色系任你挑选

总有你想要的图

分组统计分析,更懂你想要的

重要指数 :★★★★★

按照你填写的样本信息单,对各分组情况,进行统计学差异分析。

分组Venn图

OTU/ASVs比较韦恩图(样本数/分组数<=5个样本,若分组数大于5出花瓣图)

分组元信息统计

对分组样本及其元数据进行统计

α多样性

分组之间alpha多样性指数使用非参数统计检验

分组是否有意义?——β多样性

Beta多样性分组Anosim检验结果

Anosim分析是一种非参数检验,用来检验组间的差异是否显著大于组内差异,从而判断分组是否有意义。

要PCA结果图?

要PCoA结果图?

要NMDS结果图?

要加权?非加权?

… …

全部都有

Beta多样性PCA结果

使用bray_curtis的PCA组间分布及差异

Beta多样性非加权PCoA结果

使用unweighted_unifrac的PCoA组间分布及差异

Beta多样性加权PCoA结果

使用weighted_unifrac的PCoA组间分布及差异

Beta多样性NMDS结果

非度量多维尺度分析 NMDS 分析与 PCoA 类似,也是一种基于样本距离矩阵的分析方法,通过降维处理展现样本特定的距离分布。

通过对样本距离进行等级排序,使样本在低维空间中的排序尽可能符合彼此之间的距离远近关系(而非确切距离数值)。因此,NMDS 分析不受样本距离的数值影响,对于结构复杂的数据排序结果可能更稳定

你想要的层级或分组都有——组间物种构成柱状图

样本及分组之间聚类热图

了解样品之间的相似性以及属水平上的群落构成相似性。

组间各物种分类水平及功能差异

Tukey检验

如果样本每个分组是完全均等的情况(比如说每个组各有10个样),适合用Tukey检验。

优势:

可以快速在图中表现出多个分组之间,哪两个之间存在显著差异

组间各物种分类水平 

非参数检验

各个层级均有相对应的图展示。

组间菌群比较选取物种标志物

Lefse分析

基于线性判定的方式,筛选组与组间的生物标记物——也就是说找到组间存在特别显著的高丰度的菌属。

Bugbase菌群表型特征功能预测分析

基于文献的一些分类,对菌属进行菌群表征,包括对厌氧/好氧,革兰氏阴性/阳性,生物膜形成等分类。

环境样本工具?——FAPROTAX生态功能预测

整合文献原核功能数据库,偏向于代谢和生物学功能的注释。比较适合环境样本,比如说碳、氢、氧、氮、硫等元素的代谢循环的能力。

基因功能预测?——Picrust2功能预测分析

随着研究的不断深入,很多菌的基因组数据有了,基于基因组数据一旦能确定其物种来源,可以推测它具有的基因的拷贝数、代谢通路的构成特征。

2万多的物种,基因覆盖更完整

还包括了CAZY,GMM,GBM等模块

具体差异的意义要结合你的实际研究目标解释

组间各物种分类水平及功能差异

  MetagenomeSeq分析

  更保守,结果可靠性更高

组间物种及功能差异热图

基于上面MetagenomeSeq的结果中,找到差异的物种种属和代谢通路做的热图。

差异菌属与代谢通路之间有什么关系?

差异菌属和功能代谢关联分析

从菌属上的差异,代谢通路的差异等来看,到底是如何关联,是什么类的菌或代谢通路作出贡献。

不同分组之间相对明确区别的模型?

随机森林预测

判断是哪个层面上的数据能最大程度作为分组样本的区分,以及区分效果。

附录里都藏了Big彩蛋:软件操作,问题解答应有尽有

——STAMP,Qiime2等

我们提供的基础分析包括以下所有内容:

相关阅读:

微生物多样性测序结果如何看?

宏基因组的一些坑和解决方案

生物系统和疾病的多组学数据整合考虑和研究设计

谷禾16s微生物多样性测序分析报告解读 (上)

谷禾16s微生物多样性测序分析报告解读 (下)

微生物16s科研测序分析服务

16S rRNA

16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因,长度约为1542bp,其分子大小适中,突变率小,是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。

16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区,保守区序列反映了物种间的亲缘关系, 而可变区序列则能体现物种间的差异。 

16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列, 16s rRNA是由16s rDNA转录来的 , 一般扩增检测和分析的对象都是16s rDNA

16s测序

16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度系统进化、功能预测以及微生物与环境互作关系等。

样本类型

粪便、动物肠道内容物、皮肤、组织、痰液、血液、唾液、牙菌斑、尿液,阴道分泌物、发酵物,瘤胃,废水,火山灰,冻土层、病害组织、淤泥、土壤、堆肥、污染河流,养殖水体、空气等有微生物存在的样本都可以用于16s测序分析

参数介绍

取样:人/动物粪便,口腔,唾液,阴道,尿液,皮肤等可提供免费常用保存运输取样盒,其他样本可直接送样
测序平台:Illumina Novaseq
测序区域:V4,V3V4
测序数据量:10万 reads(V4); 5万 reads(V3V4)
周期:1-2周(V4);2-4周(V3V4)

送样建议

粪便样本包括肠道内容物:我们提供专门取样盒(免费)。人、大鼠、猪等,直接用取样盒里的棉签沾取约绿豆至黄豆大小的粪便至粪便保存液即可。颗粒状粪便,如小鼠,可根据粪便大小取几颗至粪便保存液即可。

备注:取样盒里有详细的粪便取样操作说明。

人或者动物其他部位:例如口腔,鼻腔,阴道等:我们提供专门取样盒(免费)。取样方式也是用棉签沾取相应部位菌至保存液。但是根据研究项目,取样部位以及方式略有不同,这个不能一概而论,特殊项目最好单独咨询便于提供最佳方案。

土壤,底泥水,污泥:需要5-10g的鲜样,土壤,底泥样若有沙石等需要先过筛后再送样。

水体样,包括河流,湖畔,自来水等:需要先过滤膜,根据水体中含菌量选择一定体积的水体过滤膜,如自来水,一般需要5-15升水过滤膜,然后将滤膜送过来即可。

DNA:浓度不低于5ng/ul, 总体积不少于40ul。

谷禾科研取样盒,常温保存运输,操作简单

报告内容(结题报告和分析软件)

分析图表展示(高级图表免费):

合作流程

售后服务

解决了从前期准备到怎么看报告、如何利用数据等问题,包括个性化图表的制作,离发表文章也就不远了,就像长跑已经能看到终点。

但仍然会有零星小问题,如何 “跑赢最后一公里”?

我们能做的就是为大家创建一个良好的交流环境,提供的交流平台致力于用最少的时间,最高效地解决问题。

案例 一 :样本:环境样本,检测时间:2018年7月,项目数据文章已发表在环境领域顶级SCI期刊(ENVIRONMENT INTERNATIONAL),文章介绍如下:

售后服务:

案例二 :DNA样本,检测时间:2018年9月,项目数据文章已发表环境顶级SCI期刊ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY,文章介绍如下:

某老师项目,DNA样本,检测时间:2018年9月,项目数据文章已发表环境顶级SCI期刊ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY,文章介绍如下:

售后服务:

案例三人粪便样本,谷禾开放基金项目。检测时间:2018年5月,项目数据文章已发表在SCI期刊Frontiers in Physiology,文章介绍如下:

售后服务:

谷禾优势

样本需求量低:常规宏基因组建库建议样本量在500ng以上,公司研发实现了低当量微生物样本提取和建库,保证提取丰度以及片段完整性同时,样本量需求低于同行其他公司要求;对于样本获取困难的样本,也可以选择微量建库,样本量可低至10ng。

免费取样盒和针对性取样建议:粪便及环境样本提供取样盒助力临床/科研取样,人体口腔、痰液、腹水、脑脊液、尿液、皮肤等高寄主细胞含量样本可根据我们的处理方案简单处理后大幅降低宿主DNA比例。

 严格标准的实验流程:自动化样品处理平台辅助,每轮设置阳性对照,上轮检测样本对照,阴性对照。评估污染,轮次比对,最大化减少误差,保证样本重复性和稳定性

Illumina测序平台:宏基因组测序(PE150)采用先进的Illumina Novaseq测序平台,快速、高效地读取高质量的测序数据、结合样品特点和数据的产出,充分挖掘环境样品中的微生物菌群和功能基因

大数据分析流程质量流程控制严格:优化的数据质量控制,包括过滤比对质量低、非特异性扩增、覆盖度低、低复杂度的序列,从而快速准确获得样本中微生物信息及其丰度信息,最大化提高质量数据

分析内容丰富全面:物种分析,基因预测与分析,多样性和相似性分析,功能分析,网路互作分析,代谢网络,关联分析等

完整详细的报告:提供质检实验报告,分析统计报告,分析报告解读,原始数据

 高效个性化服务:在线项目系统方便您及时查看项目动态和下载报告以及与分析人员高效交流,免费支持个性化图表修改以及重新分组出报告。

 价格低,周期快:包括提取,测序到分析,最快一周出报告。

大数据分析团队和多中心大项目分析经验(团队主要源自浙江大学,包括生物信息学,计算机,微生物以及统计分析等专业,积累了多年的大健康项目多中心项目分析经验,有助于宏基因组大数据,多样本,多表型,多组学联合分析

兼容性强的合作模式:有专门团队负责,提供切实可行的项目方案,兼顾临床和科研双需求模式。

案例解析

研究背景:全球塑料产量飞速增长,而且呈持续上升的趋势,因此导致大量塑料废物排放到环境中,从沿海河口到大洋环流,从东大西洋到南太平洋海域。塑料废弃物具有化学稳定性和生物利用率低的特点,可长期存在于海洋中,从而影响海洋环境包括海洋生物的生存。

作为一个独特的底物,塑料碎片可以吸附海洋中的微生物并形成个“塑性球”。以生物膜形式存在于塑料碎片上的微生物群落。许多研究表明,无论是在海洋还是淡水生态系统中,附着在塑料碎片上微生物群落的组成明显不同于周围环境(水和沉积物),而且易受位置、时间和塑料类型的影响。

主要图表

两两群落差异指数的PCoA图

PCoA 图可以清楚地看到,SW区细菌群落的置信椭圆与pd和sd的置信椭圆有显著的偏差(p<0.05),而sd上细菌群落的置信椭圆几乎覆盖了pd的置信椭圆(p>0.05),这表明pd和sd上的细菌群落有相似之处。

不同样本和处理下的细菌群落( 前 10 位)丰度分布

底物(SW、SD和Pd)上的主要属为细菌和假互斥单胞菌,暴露两周后,这些菌可能是分布广泛和适应性强的三种底物(SW、SD和PD)。暴露4周后,弧菌相对丰度增加.此外,暴露6周后,自养细菌(如扁平菌和硝酸菌)的数量增加。这三种底物上个细菌群落的生长模式也与3.2的结果一致。图5还显示,在6个星期内,在429个原位点中,假单胞菌在pd上的相对丰度高于sw和sd(anova,p<0.05)。

研究结论:首先,营养物质 (TN 和 TP) 与生物膜的平均生长速率呈正相关,而盐度与生物膜的平均生长速率呈负相关。盐度是影响PD的个细菌多样性的主要因素,而温度、溶解氧和养分(TN和TP)在类似的盐度条件下可能具有二次效应。尽管种聚合物类型对PD上的细菌群落的多样性具有较少的影响,但是在细菌群落中的一些属显示对PD的聚合物类型的选择性,并且倾向于将其优选的基质定殖。大的相对丰度SW、PD、SD间属显著差异。盐度是改变河口地区Pd条件致病菌富集的主要因素。另外,在种病原物种丰富的基础上,PD具有较高的致病性。

案例解析

研究背景:研究表明遗传和环境影响都在I型糖尿病的发展中起作用,增加的遗传风险不足以引起疾病,环境因素也是需要的,而且起着至关重要的作用。肠道菌群也许就是这个重要的环境因素,肠道菌群在免疫系统的成熟中起重要作用,此外还影响自身免疫疾病发展。

不同遗传风险儿童的LDA差异菌群

不同遗传风险分组中包含的常见菌属,部分存在特定分组中

PCoA分析揭示不同遗传风险儿童肠道菌群的在不同地域样本中均存在显著差异

点评:针对I型糖尿病疾病发生过程中遗传HLA分型风险和对应肠道菌群菌的关联分析,揭示了特定肠道菌群与宿主特定遗传风险共同作用推进疾病发生。某些特定菌属可能无法在遗传高风险儿童肠道内定植,可能对疾病发生存在特定作用。此外对于其他遗传风险的自身免疫疾病也具有重要提示意义,例如乳糜泻和类风湿性关节炎。

点击下载示例报告

点击下载报告解读

最近提供服务发表文章示例:

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