消化道炎症 | 细菌蛋白酶失调的作用

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肠道蛋白酶

蛋白水解平衡失调通常与疾病有关。例如丝氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶参与多种生物过程，尤其是炎症反应。

胃肠道拥有数以万亿计的微生物，并暴露于高水平的蛋白酶。研究表明蛋白酶在维胃肠道稳态中的关键作用，它们的上调会导致组织损伤和炎症 。基质金属蛋白酶 (MMP) 被认为是 IBD 发病机制及其相关并发症（如瘘管和纤维化）。

微生物蛋白酶在肠道中的作用在很大程度上已被忽视，部分原因是将宿主蛋白酶与其微生物对应物区分开来的工具有限。早期的研究已经确定了细菌蛋白酶对人类大肠蛋白水解的重要贡献 。大多数已鉴定的蛋白酶属于拟杆菌属、链球菌属和梭状芽孢杆菌属物种。鉴于蛋白酶经常被作为毒力因子进行研究，病原体衍生的蛋白酶主要被探索其在胃肠道中的作用。

此类蛋白酶已被描述为：

(i) 帮助细菌在感染期间成功地与常驻微生物群竞争

(ii) 促进细菌适应性和在恶劣条件下存活的关键因素。

多年前，高温丝氨酸蛋白酶 A (HtrA) 被定义为单核细胞增生李斯特菌的关键毒力因子。

蛋白酶是一种进化上保守的酶家族，可降解肽键，并与几种常见的胃肠道 (GI) 疾病有关。管腔蛋白酶，其中许多是由微生物群产生的，可以调节膳食抗原的免疫原性，降低粘膜屏障功能并激活促炎和促伤害性宿主信号传导。

蛋白水解活性的增加归因于蛋白酶产量的增加和管腔蛋白酶抑制剂的减少。

本文将讨论管腔蛋白酶过度活性如何导致乳糜泻、肠易激综合征、炎症性肠病和胃肠道感染的病理生理学的理解的最新进展。

了解蛋白酶复合物在肠道中的生理作用可以为疾病的发展提供新的见解，以及预防和治疗肠道疾病的新方法。

01
蛋白酶：基于其催化机制的功能和分类

蛋白酶存在于所有生命形式中，这些酶在基本生理过程中发挥着多功能作用，包括膳食蛋白质的消化、细胞凋亡、细胞分化、炎症和伤害感受等等。对所有生物体的生存至关重要。

根据它们的催化机制，它们分为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸或金属蛋白酶（MEROPs 数据库）。

这些酶使用位于活性位点的氨基酸残基（分别为丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸）进行催化反应，金属蛋白酶除外，它使用金属进行催化， Zn²⁺是最常见的。

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宿主蛋白酶

在人类中，蛋白酶是最大的酶家族之一，占人类基因组的 2%，已描述超过 500 种不同的蛋白酶。丝氨酸 (35.1%) 和金属蛋白酶 (29.5%) 是最密集的类别。

除了众所周知的膳食消化功能外，宿主蛋白酶在肠道中发挥着非常重要的作用，包括细胞增殖和分化、组织形态发生和重塑、血管生成、伤口修复、干细胞动员、炎症、免疫、自噬和细胞凋亡。

根据催化位点对蛋白酶进行分类和分布

Caminero A, et al. Gut Microbes. 2023

a) MEROPs 数据库根据用于进行催化过程的催化位点的氨基酸对蛋白酶进行分类。每组蛋白酶通过代表催化类型的氨基酸字母来识别。所有成员都根据结构相似性进行识别和分类。

b) 细菌和人类基因组中蛋白酶家族的相对丰度，包括假定的蛋白酶。丝氨酸 (S)、半胱氨酸 (C)、谷氨酸 (G)、天冬氨酸 (A)、天冬酰胺 (N)、苏氨酸 (T) 和金属蛋白酶 (M)。

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细菌蛋白酶

与哺乳动物蛋白酶相比，细菌蛋白酶在机制、结构和功能上具有高度多样性。

除了谷氨酸蛋白酶之外，微生物还能产生大量与人类宿主相同种类的蛋白酶，而谷氨酸蛋白酶迄今尚未在哺乳动物中发现。

最丰富的细菌蛋白水解酶是：

• 丝氨酸蛋白酶 (39.2%)
• 金属蛋白酶 (35.9%)
• 半胱氨酸蛋白酶 (16.5%)

虽然属于相似的类别，但细菌蛋白酶具有不同的功能活性或底物特异性，并不总是被很好地表征。

事实上，在细菌中发现的许多蛋白酶类的结构域结构与在真核生物中观察到的非常不同，这表明蛋白酶在原核生物中的作用截然不同。

此外，不同蛋白酶的类型和比例因分类群和菌株而异。

从功能的角度来看，蛋白酶在细菌的细胞间通讯、细胞活力、应激反应和致病性方面起着重要作用。

细菌蛋白酶根据功能位置更好地分类为：

• 细胞相关蛋白酶复合物
• 胞外酶

细胞相关蛋白酶复合物

包括细胞内、保守和高度调节的蛋白酶，它们位于多聚体复合物中，对细胞活力至关重要。

这些蛋白酶在真细菌界中普遍存在，包括丝氨酸蛋白酶 Clp、Lon 和耐高温丝氨酸蛋白酶 A (HtrA)、Zn²⁺金属蛋白酶 FtsH 和苏氨酸蛋白酶 HslUV。

除HtrA外，这些蛋白质属于 AAA+ 酶（与多种细胞活动相关的 ATP 酶）的大类。

胞外酶

细胞外酶通常是具有高底物特异性的单体。它们通常被合成为无活性的酶原，保护细胞在分泌前不受不受控制的活动的影响。

许多这些分泌的蛋白酶被认为是毒力因子，并且是某些分类单元或菌株所独有的。

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疾病中蛋白酶失调

蛋白酶受到严格调节，以防止宿主蛋白质过度降解或不适当的免疫激活，并且在患有不同胃肠道 (GI) 疾病的患者中描述了蛋白水解和抗蛋白水解活性之间的不平衡。例如，炎症性肠病 (IBD) 和肠易激综合征 (IBS) 患者的结肠组织丝氨酸蛋白水解活性 (PA) 增加，暗示在疾病的病理生理学中的作用。

微生物释放的蛋白酶与宿主蛋白酶不同

过去，大多数 IBD 和 IBS 研究主要集中在研究宿主释放的蛋白酶上。然而，肠道拥有一个庞大而多样的微生物生态系统，即微生物群，它对人类体内平衡和疾病具有重要影响。

肠道微生物群是蛋白酶的丰富来源，因为微生物释放不同的蛋白酶用于代谢、防御和宿主入侵。肠道微生物也会产生蛋白酶抑制剂和蛋白酶降解酶，反映出严格调节蛋白水解活性的重要性。

在肠道中，微生物蛋白酶首先被确定为病原体的毒力机制

与健康受试者的样本相比，在 IBD 和 IBS 患者的粪便上清液中也观察到结肠组织丝氨酸蛋白水解活性( PA ) 升高，这表明 IBD 和 IBS 中 PA 增强可能是由于宿主和微生物来源的 PA 升高。

例如，病原体铜绿假单胞菌代谢后产生肽，从而增加乳糜泻 (CeD) 患者的免疫原性，和来自肠道细菌联合体的丝氨酸蛋白酶通过激活蛋白酶激活受体 4 (PAR-4) 调节伤害感受器的兴奋性。

然而，肠道疾病中蛋白酶等特定细菌产物的机制表征仍然是一个巨大的挑战。随着越来越多的证据表明细菌蛋白酶在胃肠道疾病中起着关键作用，这里我们主要强调一些关于它们参与炎症性肠病、肠易激综合征、乳糜泻和胃肠道感染发展的关键发现，并考虑它们的生理意义。

02
细菌蛋白酶在胃肠道疾病中的作用

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炎症性肠病

IBD 是一个涵盖性术语，包括与胃肠道慢性复发和缓解炎症相关的多种疾病。

IBD 的两种主要亚型是：

• 克罗恩病 (CD)
• 溃疡性结肠炎 (UC)

虽然这两种疾病在肠道炎症的性质和位置上存在差异，但它们有一些共同的症状，包括疼痛、排便习惯改变、体重减轻和贫血。

尽管可获得针对关键炎症过程以诱导缓解的药物和单克隆抗体，但随着时间的推移，许多 IBD 患者反应迟钝或失去反应。因此，需要针对 IBD 的新疗法，并且一种有希望的候选方法是靶向管腔蛋白水解活性。

IBD 患者结肠组织中宿主蛋白水解的失调

据报道，在克罗恩病和溃疡性结肠炎患者中，结肠组织产生的宿主丝氨酸蛋白酶增加。与健康对照相比，IBD 患者结肠组织上清液中的组织蛋白酶 G 和凝血酶等蛋白酶过度活跃。弹性蛋白酶样活性在 IBD 中也引起了相当大的关注。

显示结肠上皮细胞是弹性蛋白酶样活性的主要来源，并且这种活性在 IBD 患者中显着增加。同一项研究特别确定弹性蛋白酶 2A (ELA2A) 在 IBD 患者中增强。

粪便样本中蛋白酶的来源

与结肠组织不同，粪便样本中含有来自宿主和细菌的蛋白酶，破译粪便样本中蛋白酶的来源仍然是一个挑战。

丝氨酸蛋白酶抑制剂：缓解小鼠结肠炎

与蛋白水解过度活跃在疾病发病机制中的作用一致，丝氨酸蛋白酶抑制剂在 IBD 小鼠模型中具有有益作用。Elafin 是一种乳杆菌的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可降低暴露于葡聚糖硫酸钠 (DSS) 或三硝基苯磺酸的小鼠结肠炎的严重程度。

粪便蛋白水解活性：作为疾病早期生物标志物的可能性

2021 年，有研究提议使用细菌蛋白酶作为溃疡性结肠炎患者疾病的标志物。在溃疡性结肠炎患者的纵向队列中，发现溃疡性结肠炎患者的粪便蛋白水解活性增加，甚至在疾病发作之前。这表明增加的粪便蛋白水解活性可用作疾病的早期生物标志物。

更重要的是，由于蛋白水解对粘膜屏障功能和免疫调节的影响，增强的粪便蛋白水解活性可能是 溃疡性结肠炎发病机制的早期步骤。由于鸟枪法宏基因组检测到细菌蛋白酶基因表达增加，因此提出了这种粪便蛋白水解活性的细菌来源。

细菌对粪便蛋白水解活性有贡献

作者还发现溃疡性结肠炎患者粪便弹性蛋白酶样活性增加。弹性蛋白酶样活性与普通拟杆菌，一种已知具有高蛋白水解活性的分类单元。

重要的是，在疾病发作前将溃疡性结肠炎患者的粪便微生物群转移到小鼠体内会增加结肠中的粪便蛋白水解活性并激活宿主炎症反应。这些结果表明细菌对粪便蛋白水解活性有贡献，并提供了 溃疡性结肠炎患者微生物群的蛋白水解活性足以诱发肠道炎症的概念证明。

细菌蛋白酶的增加与溃疡性结肠炎发病机制有关

后来的研究使用蛋白质组学和代谢组学，可以检测蛋白酶是真核生物来源还是原核生物来源。临床活动性溃疡性结肠炎患者的一个子集具有过量的源自普通拟杆菌（Bacteroides vulgaris，B. vulgatus）。一些相关的蛋白酶包括丝氨酸和金属蛋白酶，它们主要在细胞外空间发挥作用，可能会加剧疾病活动。

总之，有证据表明细菌蛋白酶的增加与溃疡性结肠炎发病机制有关，但这些蛋白酶在多大程度上导致疾病严重程度以及克罗恩病中是否发生类似现象仍有待确定。

普通拟杆菌蛋白酶是治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点

为测试B. vulgatus蛋白酶是否促进溃疡性结肠炎疾病进程，作者首先分析了在患者和细菌培养物中发现的B. vulgatus蛋白酶。使用广谱蛋白酶抑制剂可改善B. vulgatus诱导的体外屏障功能损伤，并预防在IL10 缺陷小鼠中B. vulgatus 诱导的的结肠炎。此外，将具有高丰度 B. vulgatus蛋白酶的溃疡性结肠炎患者的粪便移植到无菌小鼠体内会诱导依赖于蛋白酶活性的结肠炎。

这些结果综合显示普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）蛋白酶是治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点。

金属蛋白酶 MMP

基质金属蛋白酶（MMP） 是内切蛋白酶，在其催化位点包含一个保守的锌结合基序。该酶家族共享一个由前肽、催化结构域、铰链区（接头）和血红素结合蛋白结构域组成的共同结构域组织。

MMP 表达和活性的失调与多种病理过程有关，例如癌症、心血管疾病、肌肉骨骼疾病和慢性炎症。在 IBD 的背景下，许多 MMP 被发现被上调。

金属蛋白酶的失调可通过五个主要过程促成 IBD：细胞因子加工、粘液耗竭、紧密连接失稳、中性粒细胞募集和刺激以及 Th1/Th17 反应。

如下图：

基质金属蛋白酶在健康状况（正常）和炎症性肠病发病机制中的作用机制示意图

Mariaule V, et al. Int J Mol Sci. 2021

由 MMP 脱落膜结合 TNF 引起的可溶性 TNF-α 的释放导致粘液耗竭 ( 1 ) 和紧密连接不稳定 ( 2 )，从而导致上皮通透性和细菌易位增加。

丝氨酸蛋白酶

胃肠道经常暴露于来自宿主和肠道细菌的高水平蛋白水解酶 。从宿主方面，这些蛋白酶可以由常驻细胞或浸润细胞释放。

在浸润性免疫细胞中，中性粒细胞是丝氨酸蛋白酶的主要来源。它们的颗粒含有大量的弹性蛋白酶 (HNE)、蛋白酶 3 (PR3) 和组织蛋白酶 G (catG)，它们在炎症时分泌。

丝氨酸蛋白酶对 IBD 的贡献可以通过四种主要机制来描述：TJ 去稳定化/降解、粘液降解、PAR 激活和细胞因子加工。

如下图：

Mariaule V, et al. Int J Mol Sci. 2021

丝氨酸蛋白酶在健康环境（正常）和炎症性肠病（IBD）病理学中的作用模式示意图。上皮屏障损伤与丝氨酸蛋白酶通过直接切割对紧密连接的作用有关。( 1 ) 间接不稳定源自蛋白酶激活受体 (PAR) 激活 ( 2 )、粘液降解 ( 3 ) 和细胞因子加工 ( 4 )。

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乳糜泻（CeD）

乳糜泻是一种慢性自身免疫性炎症性肠病，发生在对摄入麸质蛋白有反应的遗传易感个体中。它的全球患病率为 1.4%。

乳糜泻主要影响小肠，产生以上皮内淋巴细胞增加、绒毛萎缩和隐窝增生为特征的粘膜免疫反应。目前，唯一被接受的乳糜泻治疗是严格的终生无麸质饮食。

微生物在乳糜泻中的作用最近受到了相当大的关注，这是基于乳糜泻患者肠道微生物组的改变以及纵向研究中肠道感染与乳糜泻发病之间的关联。

蛋白酶在乳糜泻发病机制中起着关键作用

随着微生物组成的变化，一些研究表明蛋白酶在乳糜泻发病机制中起着关键作用。与蛋白酶在乳糜泻中的有益作用相反，在乳糜泻患者的十二指肠和粪便中观察到对麸质蛋白的蛋白水解活性增加。

麸质的蛋白水解活性增加，假单胞菌增加

虽然这些蛋白酶的性质尚不清楚，但最近的报告表明微生物起源。来自活动性乳糜泻患者的十二指肠活组织检查显示，针对麸质的蛋白水解活性增加，这与假单胞菌（一种众所周知的蛋白水解分类群）的丰度增加相关。

事实上，铜绿假单胞菌通过不同的机制在临床前小鼠模型中诱导食物敏感性，如下所述。

这些研究表明，病原体表达的蛋白酶会影响乳糜泻患者小肠中的麸质代谢和免疫激活。

与乳糜泻中蛋白水解活性的致病作用一致，长双歧杆菌产生的丝氨酸蛋白酶抑制剂可减少临床前小鼠模型中麸质诱导的免疫病理学。

缺少消化蛋白酶可能是导致乳糜泻的原因

几十年来，人们一直怀疑缺少消化蛋白酶可能是导致乳糜泻的原因。该理论认为，由于易感个体缺乏未知的宿主消化蛋白酶，乳糜泻中的麸质消化不良。

口服酶疗法是乳糜泻中广泛研究的一种治疗方法

其重点是通过补充肽酶来消化人体胃肠道中的免疫原性谷蛋白肽。在这方面，来自口腔的微生物已成为有可能产生降解管腔麸质的酶的候选者。

细菌蛋白酶在治疗乳糜泻方面具有广阔的潜力

体外研究表明，Rothia菌株（R. mucilaginosa和R. aeria）是专门针对免疫显性面筋肽的面筋降解酶的潜在来源。随后，由R. aeria产生的酶被分离并鉴定为属于 S8 枯草杆菌蛋白酶家族，具有高效降解面筋的能力。

其他研究人员表明，来自Flavobacterium meningosepticum、Sphingomonas capsulate和Myxococcus xanthus在乳糜泻的治疗中具有广阔的应用前景。来自这些微生物的重组蛋白能够分解具有不同亚位点特异性的谷蛋白肽。

这些发现表明细菌蛋白酶在治疗乳糜泻方面具有广阔的潜力，一些制剂已经进入 II 期临床试验。

迄今为止的证据表明，一些蛋白酶可以预防乳糜泻，而另一些则会加剧疾病：这取决于所讨论的蛋白酶的底物特异性及其降低或增加麸质分解代谢产物免疫原性的能力。

未来十年，对有助于面筋代谢的细菌来源蛋白酶的研究可能会显着增加，因为无论疾病如何，人体消化酶都只会部分消化它。

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肠易激综合症

IBS 是一种常见的消化系统疾病，与慢性腹痛和排便习惯改变有关。

由于 IBS 没有伴随 IBD 的明显炎症损伤，因此通常被视为肠-脑沟通障碍。除了中枢神经系统处理肠道信号的改变外，IBS 患者肠道内的一些变化也与肠-脑通讯的改变有关，包括肠嗜铬细胞释放 5-羟色胺的改变、肥大细胞-神经元通讯的改变和微生物的改变。

宿主和细菌衍生的蛋白酶可能促进发病机制和症状的产生

例如，在 IBS 患者的结肠活检中，胰蛋白酶样活性和类胰蛋白酶释放增加。

在最近的一项研究中，对感染后 IBS 患者粪便样本的宏基因组分析显示，与对照组相比，特定宿主丝氨酸蛋白酶驱动的肠道微生物群组成发生了改变，肠道蛋白水解活性升高。

作者还表明，共生微生物释放的 β-葡萄糖醛酸酶抑制宿主 PA，从而保护肠上皮细胞，并表明微生物 β-葡萄糖醛酸酶活性的降低可能有助于 IBS 的发病机制。

与增强 IBS 中蛋白酶活性的作用一致，丝氨酸蛋白酶抑制剂萘莫司他减少炎症后 IBS 啮齿动物模型中的内脏痛觉过敏。

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胃肠道感染

胃肠道感染是急性和慢性疾病的一大负担，而蛋白酶对于许多微生物感染宿主的能力至关重要。

细菌病原体在感染过程中出于各种目的依赖蛋白水解

细胞内和膜蛋白酶如 Clp、Lon 或 HtrA 通过毒力调节剂的及时降解和间接地通过提供对宿主不利条件的耐受性来促进毒力。相反，病原体依赖性细胞外蛋白酶通过降解宿主细胞外基质成分或干扰宿主细胞和免疫信号来促进宿主入侵，这个我们下面讨论。

一个很好的例子是幽门螺旋杆菌，这种细菌感染了世界上大约一半的人口，是消化性溃疡病和胃癌的主要危险因素。尽管在幽门螺杆菌中描述了不同的毒力因子，锌蛋白酶 PqqE 和丝氨酸蛋白酶 HtrA 破坏胃粘膜完整性，从而促进细菌入侵。

扩展阅读：正确认识幽门螺杆菌

蛋白酶也是与胃肠炎相关的感染因子的关键毒力因子

肠胃炎是一种以排便频率和粪便含水量增加为特征的腹泻病，伴或不伴发热、呕吐和腹痛。

肠道感染引起的腹泻是全球发病率和死亡率的一个主要因素。虽然已知有 20 多种微生物病原体会引起急性胃肠炎，但几种大肠杆菌菌株是最常见的，对人类健康构成重大风险，并且仍然是发展中国家婴儿死亡的重要原因。

这组细菌包括不同的致病型，例如产肠毒素 (ETEC)、肠致病性 (EPEC)、肠侵袭性 (EIEC)、肠出血性 (EHEC) 或肠聚集性大肠杆菌(EAEC)。

引起腹泻的其他临床相关微生物有：

• 志贺氏菌属
• 沙门氏菌属
• 空肠弯曲杆菌
• 大肠杆菌
• 霍乱弧菌

肠道病原体利用各种复杂的策略在肠道定植、逃避免疫系统、增殖和损害宿主。与这些细菌相关的毒力因子具有广泛的活性，包括粘附素、毒素、铁获取因子、脂多糖、多糖胶囊、侵入素和蛋白酶。

SPATE 会降解宿主细胞内或细胞外底物，产生不利影响

来自肠杆菌科的丝氨酸蛋白酶自转运体(SPATE) 构成了一个毒力因子超家族。这些是高分子量丝氨酸蛋白酶，通常通过自转运途径分泌到外部环境中，并且在肠病原体中非常普遍，包括志贺氏菌、沙门氏菌、柠檬酸杆菌和所有致病大肠杆菌。

一些研究结果表明，SPATE 会降解宿主细胞内或细胞外底物，从而引发对宿主细胞的各种不利影响。

SPATE 可以分为 2 个类型

• 1 类 SPATE

1 类 SPATE 靶向细胞内底物，对宿主产生细胞毒性和内毒素作用。

• 2 类 SPATE

2 类 SPATE 似乎会破坏粘膜屏障并通过靶向宿主糖蛋白来调节免疫反应。在这一类中，由大肠杆菌(EAEC)、福氏志贺菌产生的丝氨酸蛋白酶 Pic是一种与先天免疫系统的粘附、定植和逃避相关的毒力因子。

福氏志贺菌产生的 2 级 SepA也是破坏屏障不可或缺的。最后，大肠杆菌分泌的锌金属蛋白酶 StcE 和 SslE有助于这些细菌与宿主细胞的紧密粘附，这一过程对于定植至关重要。

其他蛋白酶已被描述为肠胃炎的毒力因子。由于幽门螺杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和空肠弯曲杆菌（一种负责食源性感染的细菌）与宿主细胞上皮细胞相互作用并通过 HtrA 建立感染。

弧菌溶血素与霍乱弧菌的致病性有关

细胞外锌依赖性金属蛋白酶血凝素 (HA) 也称为弧菌溶血素，与霍乱弧菌的致病性有关，霍乱弧菌可引起霍乱，这是一种严重的腹泻病，如果不及时治疗可能会迅速致命，通常通过受污染的水和人与人之间的接触传播。

虽然霍乱毒素是感染的主要驱动因素，但弧菌溶血素具有广泛的潜在致病活性，包括粘液屏障的降解或上皮紧密连接的破坏。

致病性艰难梭菌释放的毒素对感染具有决定性作用

蛋白酶也可以间接介导感染。艰难梭菌就是这种情况，它是许多国家医疗保健相关感染和腹泻的主要原因之一。艰难梭菌会导致轻度至重度腹泻，并可能导致危及生命的情况，例如结肠穿孔、伪膜性结肠炎和中毒性巨结肠。

致病性艰难梭菌释放的毒素 A 和 B（分别为 TcdA 和 TcdB）对感染具有决定性作用。内部 Cys 蛋白酶结构域激活毒素，从而对宿主细胞产生下游影响。

由于蛋白酶对于许多细菌感染宿主和引起疾病的能力至关重要，因此有人提议阻断特定蛋白酶以预防常见的胃肠道感染；但是，仍然没有批准的具有这种作用方式的药物。

与胃肠道疾病有关的细菌和宿主来源的蛋白酶总结

doi.org/10.1080/19490976.2023.2181922

在以下部分中，将在管腔作用、对粘膜屏障功能的影响、细胞和免疫信号以及对内脏感觉的影响的背景下讨论胃肠道疾病中蛋白水解活性的病理生理学后果。

03
细菌蛋白酶在胃肠道中的作用

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细菌蛋白酶的管腔作用：饮食-微生物群相互作用

饮食是微生物组成和功能的主要驱动因素。肠道微生物群能够使用不同的膳食成分来产生具有生物活性特性的微生物代谢物。

微生物蛋白酶活性会受到饮食选择的影响

就像在哺乳动物中发生的那样，微生物使用蛋白酶通过水解宿主或饮食中可用的蛋白质来满足其营养氨基酸需求。因此，微生物蛋白酶活性会受到饮食选择的影响。患有慢性炎症或功能性胃肠道疾病的患者将饮食视为症状发作/严重程度的驱动因素。

在研究微生物蛋白酶在炎症或功能障碍中的作用时应考虑饮食

事实上，微生物蛋白酶可以通过多种机制通过饮食影响体内平衡。

首先，西方饮食的特点是蛋白质含量高，许多消化不当的膳食蛋白质能够在肠道中引起异常的免疫反应。

人类肠道微生物群的功能多样性意味着有参与消化膳食成分的大量代谢途径，甚至是难以被人类酶消化的蛋白质。

因此，宿主未使用的膳食蛋白质成为微生物蛋白酶的底物。这在乳糜泻等食品敏感性中尤为重要。

乳糜泻的主要环境诱因、麸质未被宿主消化酶完全消化。已经表明，人体胃肠道中存在具有代谢麸质能力的细菌。这些包括共生细菌，例如放线菌、芽孢杆菌、Rothia、葡萄球菌、链球菌、乳杆菌或梭状芽孢杆菌，但也包括机会性病原体，例如铜绿假单胞菌。

微生物蛋白酶通过改变麸质的粘膜吸收和免疫原性

在最近的一项研究中，微生物谷氨酸羧肽酶基因与有效的面筋降解有关。另一方面，铜绿假单胞菌是一种从乳糜泻患者的十二指肠中分离出来的机会性病原体，通过产生能够更好地跨肠屏障转运的肽来提高面筋的免疫原性，并激活乳糜泻患者的面筋特异性T细胞。

铜绿假单胞菌通过 LasB 降解面筋，这种金属蛋白酶还通过蛋白酶激活受体 (PAR)-2 激活导致炎症通路的面筋非依赖性上调。在表达乳糜泻风险基因的小鼠中，铜绿假单胞菌LasB 与麸质协同作用，诱导与中度绒毛钝化相关的更严重的炎症。

因此，人体肠道是微生物蛋白酶的丰富来源，有助于消化常见的膳食蛋白质，从而增加或降低其最终免疫原性。

其他顽固的膳食蛋白质如小麦淀粉酶胰蛋白酶抑制剂 (ATI) 也证实了类似的现象。ATI 能够通过 toll 样受体 4 激活在肠道中诱导先天免疫激活，并对肠道炎症和抗原致敏产生下游影响。

肠道微生物蛋白酶能够消化 ATI，从而减少与小麦蛋白相关的肠道功能障碍。例如，乳杆菌菌株会降解面筋和 ATI 肽，从而降低其免疫原性。

微生物还会释放大量影响宿主稳态的代谢物

除了由于蛋白质的分解代谢而导致微生物蛋白酶对宿主产生直接影响外，微生物还会释放大量影响宿主稳态的代谢物，例如支链脂肪酸、氨基酸、氨、酚类、硫化氢。

有趣的是，酪氨酸代谢物，如对甲酚和 4-乙基苯基硫酸盐，可能有助于肠道-大脑交流，在 IBS 中发生了改变。

另一种细菌代谢物硫化氢在肠道生理过程中具有多种作用，并与肠道炎症和结直肠癌有关。

最后，色氨酸是合成多种重要生物活性分子的前体，例如 5-羟色胺、褪黑激素、烟酰胺和维生素 B3，以及许多其他重要的生理中间体。

扩展阅读：色氨酸代谢与肠内外健康稳态

色氨酸一种必需的芳香族氨基酸，存在于不同的饮食来源，例如家禽、鱼、燕麦和乳制品。这种独特的氨基酸可以被肠道微生物群代谢成一系列吲哚化合物，其中一些化合物可以激活关键的稳态受体，如芳基烃受体 (AhR) 或孕烷 X 受体 (PXR)。

事实上，这些受体与肠道炎症有关，并且微生物色氨酸代谢在 IBD 和乳糜泻患者中发生了改变。

因此，微生物蛋白酶可以通过改变常见的饮食抗原或促进肠道中生物活性代谢物的释放来间接调节不同的肠道状况。

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细菌蛋白酶对粘膜屏障功能的影响

肠粘膜屏障

宿主抵御共生细菌和入侵肠道病原体的第一道防线是肠粘膜屏障，它是一种物理屏障，包括生化和免疫成分。物理屏障由通过紧密连接的上皮细胞组成，并受到宿主分泌的粘液层的保护。

肠道中的粘液层在宿主上皮细胞和肠道微生物群之间形成物理屏障。

粘液层不断更新，这一动态系统的缺陷与胃肠道疾病和结肠癌有关。粘液的主要成分是形成凝胶的粘蛋白 2 (MUC2) 蛋白，它由杯状细胞合成。MUC2 缺陷小鼠更易患自发性结肠炎引用与健康对照相比，溃疡性结肠炎和克罗恩病中的MUC2 基因水平被发现发生了变化。

结肠中的粘液组织与小肠中的粘液组织大不相同。小肠中的粘液形成单一且可穿透的层，但细菌通过抗菌介质远离上皮细胞。结肠中的粘液形成双层。内部粘液层牢固地附着在上皮细胞上，细菌无法穿透，并且对于抑制微生物与上皮细胞上的宿主受体的相互作用至关重要。结肠中的外层粘液层（分泌的）被扩张并作为微生物群的栖息地。

尽管分泌的粘液的主要功能是保护宿主上皮免受共生体和病原体的侵害，但该屏障中的糖蛋白也为某些结肠微生物创造了营养来源。粘蛋白为细菌提供碳源和氮源，暴露的 O-聚糖链作为细菌定植的附着位点。粘附在粘蛋白上的共生微生物群通过定植抵抗来保护宿主。几十年来，人们一直在讨论粪便样本中发现的内容物可以降解结肠粘液的想法。

蛋白酶对粘液层的影响

近年来，对粘液降解所需的微生物碳水化合物活性酶 (CAZymes) 进行了深入研究，尤其是拟杆菌属和瘤胃球菌属的成员。来自不同微生物的蛋白酶也表现出很强的蛋白水解粘蛋白酶活性。

来自产气荚膜梭菌的锌金属蛋白酶 ZmpB在糖基化丝氨酸和/或苏氨酸残基附近进行切割。来自不同感染因子的蛋白酶，例如致腹泻大肠杆菌和志，或霍乱弧菌，可降解结肠粘液，这是促进上皮细胞入侵的关键步骤。

StcE 和 SslE，来自致腹泻性大肠杆菌菌株的金属蛋白酶，也可切割粘蛋白糖蛋白，这可能有助于病原体到达上皮细胞。

此外，M60 样蛋白酶家族以依赖于特定聚糖侧链结构存在的方式切割粘蛋白糖蛋白主链。

许多病原体表达这种蛋白酶家族以入侵宿主

不同的粘蛋白降解蛋白酶也已在拟杆菌属（人类肠道的常见共生菌）中得到描述这些包括B. thetaiotaomicron (BT4244) 或Bacteroides caccae中的蛋白酶。

尽管粘蛋白降解能力被认为是许多胃肠道病原体的毒力因子，但其对特定慢性肠道疾病的影响尚不清楚。

蛋白酶可以破坏粘膜屏障的上皮成分

上皮屏障功能需要连续的细胞层以及密封它们之间细胞旁空间的紧密粘附连接。肠道屏障功能受损与许多疾病状态有关，包括肠道和全身性疾病。

微生物蛋白酶也会裂解肠细胞间连接

由粪肠球菌产生的金属蛋白酶 GelE降解 E-钙粘蛋白，导致屏障功能丧失，这在自发性结肠炎小鼠模型的炎症发生前就很明显。紧密连接也是感染因子的目标，例如铜绿假单胞菌（通过 LasB）、幽门螺杆菌（PqqE 和 HtrA），空肠弯曲杆菌(HtrA)，霍乱弧菌（弧菌溶素），志贺氏菌、沙门氏菌或致病性大肠杆菌(SepA)。

因此，微生物利用蛋白酶入侵宿主，对肠道具有重要意义。紧密连接和粘附连接的改变导致上皮屏障的细胞旁通透性增加，这是 IBD 和 IBS 的病理生理学标志。由于粘蛋白和连接降解细菌会造成损害，因此这些酶可能为蛋白酶抑制剂提供治疗或预防肠道疾病的靶点。

管腔蛋白酶激活肠细胞膜上表达的蛋白酶激活受体

管腔蛋白酶可以调节上皮屏障功能的另一种机制是通过激活肠细胞膜上表达的蛋白酶激活受体 (PAR)。关于 PAR 在肠道功能中的作用，PAR-2 激活配体的顶端给药导致前列腺素和干扰素释放以及由于 ZO-1 降解导致的细胞旁通透性增加。

PAR-4 被组织蛋白酶 G 激活，组织蛋白酶 G 是一种蛋白酶，在溃疡性结肠炎患者的粪便样本中升高，导致小鼠体内当 PAR-2 激活受阻时，肠道病原体艰难梭菌感染会很明显。

与 IBD、IBS、CeD 和GI感染有关的蛋白酶

Caminero A, et al. Gut Microbes. 2023

在与疾病相关的情况下，蛋白酶通过多种作用机制诱导肠道结构和功能发生变化，包括对膳食蛋白质代谢、粘膜屏障功能、神经元兴奋性和免疫调节的影响。Luminal 蛋白酶通过 PAR 依赖和独立效应的组合影响 GI 功能。微生物来源的蛋白酶以红色突出显示。*具有治疗潜力的蛋白酶。

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细菌蛋白酶对细胞和免疫信号的影响

蛋白酶是信号酶，可以通过不同的机制途径特异性调节细胞和免疫信号，包括那些由 PAR 激活介导的途径。

PAR 是 G 蛋白偶联受体，具有七个跨膜结构域、一个细胞外 N 末端和一个细胞内 C 末端。N 末端的蛋白水解裂解通过显示栓系配体启动细胞内信号传导。

PAR家族的激活对肠道生理功能的影响

PAR 家族不同成员（PAR-1、2、3 和 4）的激活是蛋白酶特异性的，受到严格调控并影响肠道的许多生理功能，例如运动性、通透性和伤害感受。

特定蛋白酶激活 PAR 的功能结果取决于哪个 PAR 被激活及其下游信号通路是什么，包括是否启动了规范或偏向信号通路。

PAR与肠道疾病发病机制相关

PAR 在胃肠道（上皮细胞、神经元、肥大细胞、成纤维细胞等）中普遍表达，并在被蛋白酶激活后介导广泛的促炎、伤害感受和增殖作用。PARs与结直肠癌、炎症和功能性肠道疾病的发病机制有关。

溃疡性结肠炎患者结肠组织中 PAR-2的不同的微生物蛋白酶已被提议作为活化剂 PAR。

相关的，来自铜绿假单胞菌，粪肠球菌的GelE降解 PAR-2 的 N 末端，导致临床前小鼠模型中的食物敏感性和肠道炎症。然而，微生物蛋白酶在胃肠道疾病中激活PARs的全部意义仍有待解决。

蛋白酶还能够刺激或减少关键宿主免疫介质的产生

例如细胞因子或免疫球蛋白 (Ig)。细胞因子的产生是一个受到严格监管的动态事件。

其动力学紊乱会在宿主中引起加剧的反应，因为它们参与细胞内信号的多个级联。

例如，牙龈卟啉单胞菌中的牙龈蛋白酶-R 对人中性粒细胞上的 PAR-2 进行切割和激活会诱导促炎细胞因子的释放，例如白细胞介素 (IL)-6、IL-8 和肿瘤坏死因子 (TNF)-α。

细胞因子也可以被细菌蛋白酶降解

以前的报道表明，来自铜绿假单胞菌可以降解 IL-2 和干扰素 (INF)-γ。

来自嗜肺军团菌的锌金属蛋白酶也具有降解 IL-2 的能力。同样，牙龈蛋白酶，一种由牙龈卟啉单胞菌产生的胰蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，可以切割 IL-1β、IL-6 和 IL-1ra。

其他基于蛋白质的介质（例如免疫球蛋白）也可以观察到相同的现象。Ig 是由浆细胞产生的糖蛋白，它通过特异性识别特定抗原在适应性免疫反应中发挥重要作用。除了微生物群在宿主体内刺激不同 Ig 亚型的能力外，微生物还可以降解 Ig 帮助免疫系统逃避。许多感染粘膜表面的病原体编码可切割免疫球蛋白的蛋白酶，例如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌或肺炎链球菌。

肠道微生物群可以降解 IgA

IgA 在粘膜免疫学中起着关键作用，并且记录到分泌性 IgA 降解的小鼠更容易患化学诱导的结肠炎。胰蛋白酶等宿主蛋白酶能够降解 IgA，而Paraprevotella（普雷沃氏菌）可防止其在肠道中降解。

扩展阅读：对抗病原菌，帮助共生菌定植的“重要开关”

大多数研究都侧重于了解细菌外毒素与免疫系统在预防疾病方面的相互作用。然而，要了解共生体释放的蛋白酶是否分别促进或中和抗炎和促炎介质的产生，还有很多工作要做。

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细菌蛋白酶和腹痛

在过去的二十年里，宿主来源的蛋白酶对 PAR 的激活与腹痛有关。PARs 的激动剂激发支配胃肠道的脊髓传入神经元。

PAR-2 激活——伤害感受器激活

来自 IBS 患者的活检上清液也被证明可以通过 PAR-2 激活来激发脊髓传入神经元。这些兴奋效应归因于瞬时受体电位 (TRP) 通道的敏化，包括 TRPV1、TRPV4 和 TRPA1 以及电压门控 ^K+通道的抑制。

结肠炎模型也有证据表明 PAR-2 激活会导致伤害感受器过度兴奋。

PAR-4 的激活——抑制伤害感受器兴奋

重要的是，在啮齿动物中，PAR-4 的激活对伤害感受器的激活与 PAR-2 的激活具有相反的作用。PAR-4激活在体外和体内抑制结肠伤害感受器的兴奋性。

细菌蛋白酶在调节腹痛中的作用

IBD 或 IBS 患者的粪便上清液进行的体内实验首次提出了细菌蛋白酶在调节腹痛中的作用。通过量化对结肠直肠扩张的内脏运动反应来测量大鼠和小鼠的腹痛敏感性。来自 IBS-D 和 IBS-C 患者的粪便上清液的结肠内给药增加了对扩张的内脏运动反应，有异常性疼痛和痛觉过敏的证据。

相比之下，溃疡性结肠炎患者的粪便上清液具有相反的效果，以 PAR-4 依赖性方式降低内脏运动反应。

因此，粪便蛋白酶似乎可以加剧或抑制啮齿动物的腹痛，这取决于发生的 PAR-2 或 PAR-4 激活的相对量。

粪便蛋白酶的作用位点与疼痛调节相关

PARs 在肠壁内的许多细胞上表达，包括脊髓传入神经元和肠细胞。

基于对 IBS-C 患者粪便蛋白酶的研究，腹痛的加重似乎不是由于蛋白酶对神经元 PAR 的直接兴奋作用。相反，将 IBS-C 粪便上清液中的半胱氨酸蛋白酶结肠内给药给小鼠，会增加结肠通透性并导致闭塞降解，进而导致内脏疼痛增加。

与来自健康对照的活检相比，来自 IBS-C 患者的粘膜活检也显示出上皮 occludin 降解的证据。

然而，由于本研究未评估粪便蛋白酶对神经元激活的作用，因此对肠道 neu 伤害感受器神经末梢的直接影响仍然可能导致内脏痛，因为粘膜屏障完整性的降低会促进管腔进入脊髓传入神经末梢的蛋白酶。

普拉梭菌的抗伤害感受作用

随后的研究已将Faecalibacterium prausnitzii（普拉梭菌）鉴定为抗伤害性介质的潜在来源，包括 PAR-4 激活丝氨酸蛋白酶。使用导致体内内脏痛觉过敏的两种成熟的 IBS 啮齿动物模型，发现在给予F. prausnitzii后，增强的内脏运动对结直肠扩张的反应被逆转。

这些镇痛作用是由于粘膜通透性增加的逆转，这是这些 IBS 模型的一个特征。背根神经节神经元的体外F. prausnitzii的抗伤害感受作用。

来自F. prausnitzii培养物的培养基上清液直接作用于 DRG 神经元，以抑制它们由于电压门控 ^K+电导增加而引起的兴奋性。这是激活神经元 PAR-4 的组织蛋白酶 G 样丝氨酸蛋白酶的结果。

扩展阅读：肠道核心菌属——普拉梭菌（Faecalibacterium Prausnitzii），预防炎症的下一代益生菌

总之，PAR 激活能够抑制或加重腹痛，这取决于哪种蛋白酶占主导地位以及它们激活了哪些受体。对腹痛患者样本的研究表明，宿主和细菌蛋白酶都可能导致疼痛。鉴于与腹痛相关的疾病（包括 IBD 和 IBS）中管腔蛋白水解失衡的证据，未来旨在进一步描绘这些蛋白酶的细菌来源和细胞靶标的研究将很有价值。

这些见解可能会导致下一代益生菌的开发，这些益生菌通过将 PAR 激活的平衡转移到屏障恢复和伤害感受器抑制作用来抑制腹痛。

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结 语

近年来，共生菌释放的蛋白酶对胃肠道疾病的影响越来越受到关注。很明显，蛋白酶、它们的宿主靶标和蛋白酶抑制剂之间的复杂平衡维持了肠道的功能和完整性。这种平衡的失调对肠道健康有直接影响，其严重后果会导致病理生理状况。

此外，许多致病菌利用蛋白酶定殖宿主组织并引起疾病。随着蛋白酶活性与疾病之间因果关系的确定，以及对细菌蛋白酶如何促进或预防疾病的机制的深入了解，可能会带来治疗常见胃肠道疾病和感染的新机会。

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