科普

「哮喘」-更精细和全面的认识

哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病,影响着全世界3亿多人。预计到 2025 年将增加到 4 亿人。

咳嗽、胸闷、喘息、气促等

发作起来的窒息感让人崩溃

喘息是如何发生的?

当一个人没有哮喘症状时,呼吸是顺畅的,空气可以很容易进出肺部,一旦哮喘发作,肺部就发生了变化:

气道外平滑肌收紧,气道或支气管肿胀,管内粘膜开始产生粘液,粘液堆积进一步堵塞导致喘息,哮喘的征兆开始了。

哮喘带来的危险

除了咳嗽,患者会觉得呼吸困难,哮喘发作时,炎症会导致呼气比吸气更困难肺部过度充气,人体超负荷进行肺部空气循环,各个器官和组织氧气输送量减少,甚至无法维持人体正常运作而发生危险。


于是,人们开始积极寻找各种方式来预防或者治疗哮喘。吸入器便出现了,它可以喷雾的形式将药物传送到受感染的呼吸道,以快速缓解症状。然而,人们对哮喘的病因依然缺乏足够的了解。

目前普遍认为,出现哮喘与多种因素有关,例如遗传、环境、感染和营养因素等。

随着研究的深入,逐渐发现在生命早期就已经有了潜在危险。对哮喘的研究也逐渐渗透到更精细的层面。

01

哮喘不是一种单一的疾病

哮喘不是一种简单的疾病,具有许多表型和内型,目前,对于这些复杂致病过程的最佳理解,在于它们的二元分类:分为2型哮喘非2型哮喘

· 2型哮喘

临床上常见的2型哮喘有早期过敏性哮喘晚期嗜酸性哮喘运动性哮喘

· 非2型哮喘

肥胖相关哮喘、中性粒细胞性哮喘和寡粒细胞性哮喘

哮喘表型和内型的示意图

内型是根据病理生理机制对哮喘进行分类,而表型是指疾病的临床和形态描述

涉及哮喘的简化细胞机制及其与微生物的相关性

Th2细胞驱动的炎症与Th2细胞、2型固有淋巴细胞、T滤泡辅助细胞、2型B细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞结合,导致痰、支气管肺泡液体、血清和支气管活检中IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、前列腺素D2和CCR8含量增加。

非2型炎症的特点是Th1和Th17细胞和中性粒细胞浸润,I型干扰素的存在,NLRP3炎症小体的激活,以及IL-1b和IL-17的特征。

02

健康的肺不是无菌的

人体所有表面都充满了微生物群,当然也包括上呼吸道(URT)和下呼吸道(LRT)在内。

呼吸系统的组成

人类的呼吸系统由上呼吸道(从鼻腔开始,然后是鼻咽、口咽和声带上方的喉) 和下呼吸道(一直到声带下的喉部,包括气管、支气管、细支气管和无数肺泡)组成。

而这个上呼吸道,相当于一个看门人,守护着呼吸健康。微生物群主要通过鼻咽部的微呼吸进入肺部,口咽部则更密集、分布更广。微生物也可以通过粘膜表面的扩散进入肺部。

上下呼吸道菌群

上呼吸道和下呼吸道的健康微生物群在呼吸道和整个机体内稳态的发展和维持中起着重要作用。

上呼吸道和下呼吸道的健康微生物群在呼吸道和整个机体内稳态的发展和维持中起着重要作用。

生命早期的“机会之窗”

从生命的第一天起,所有粘膜部位的微生物群都会发生动态变化,从而形成微生物群与人体之间适当的相互作用,并构成决定未来健康或疾病的关键“机会之窗”。

在出生和出生的第一天,母体阴道和皮肤的微生物群只能短暂地转移到婴儿身上,而母亲的肠道微生物群则成为婴儿在四个月大时获得的微生物群的主要来源。

由于这两种解剖结构代表了不同的环境,因此早期生活的背景下,有必要将上下呼吸道分开讨论。

从生命的第一刻起,上呼吸道就不断地暴露在外界环境及其伴随的环境中,从而形成了上呼吸道微生物群。

稳定状态下,下呼吸道菌群的瞬时特性取决于上呼吸道进入的菌群与被宿主免疫消除的菌群之间的平衡。 因此,上呼吸道样本无法完全反映下呼吸道中发生的相互作用。

健康呼吸道微生物群对宿主免疫的总体影响反映了活微生物及其细胞或代谢物成分对宿主局部和全身固有和适应性免疫过程的累积影响。如果健康适时的定植过程被破坏,早期生命肠道和肺微生物群的失调就成为许多呼吸系统疾病发生的重要危险因素。

03

肠-肺轴对呼吸和肠道健康的影响 

不同的肺部疾病会受到肠道微环境变化的影响,反之亦然。由此提出了“肠-肺轴”连接的概念。

在哮喘中,微生物群是导致这两者之间相互作用的重要因素。在人类和小鼠的研究中,肺和肠道之间的联系已经被反复证明。

肺部炎症时的肠-肺轴

这种相互作用可以是双向的;肠道微生物可以影响肺部的免疫反应,而肺部刺激可以导致肠道反应。

此外,在慢性阻塞性肺病(COPD)中还描述了「肠-肺-肝轴」。

来自肠道菌群的短链脂肪酸肺部的促炎反应抑制作用。

肝脏反应增强巨噬细胞活化和肺部炎症

肠道菌群产生的短链脂肪酸(SCFAs)对肺内炎症反应有抑制作用,肝脏通过HMGCoA还原酶抑制甲羟戊酸途径或与G-蛋白受体结合抑制炎症反应。

04

细菌是肠道和肺部最大的微生物种群

我们知道,肠道是人体菌群最密集的定植部位,其菌群及其与哮喘的关系,无论是在早期还是在已确诊的疾病中,都需要特别关注。

在一项研究中,来自加拿大的三个月大婴儿哮喘高风险的粪便样中观察到Lachnospira, Veillonella, Faecalibacterium, Rothia显著下降。这种菌群特征在1岁时不再明显,同时伴随着粪便乙酸的减少和肝肠代谢物失调。此外,预测的细菌群落功能分析表明,哮喘高危儿童微生物群中脂多糖生物合成途径的减少

在卵清蛋白(OVA)诱导的小鼠呼吸道炎症模型中,将哮喘婴儿的粪便浆液补充具有代表性的Lachnospira, Veillonella, Faecalibacterium, Rothia菌属后,移植到无菌小鼠体内,可以减轻呼吸道炎症。

在另一项人类出生队列研究中,厄瓜多尔儿童在3个月大时,粪便样本中链球菌拟杆菌的相对丰度增加双歧杆菌和Ruminococcus gnavus减少的,在5岁的时候有更高的患过敏和哮喘的风险。

最后,根据肠道微生物群的组成,在美国新生儿中,双歧杆菌属、阿克曼菌属和粪杆菌属相对丰度念珠菌红酵母真菌相对丰度较的新生儿患过敏和哮喘的风险最高。

短链脂肪酸

肠道微生物对哮喘的影响至少部分是由细菌代谢物介导的,这可能会影响身体远端的免疫反应。在人类呼吸道炎症中,最著名的具有保护性质的代谢物是短链脂肪酸

1岁时粪便中含有大量丁酸和丙酸的儿童,其特应性敏感性明显降低,3至6岁之间哮喘的可能性较小。此外,可溶性纤维补充可降低哮喘患者痰嗜酸性粒细胞增多和痰组蛋白去乙酰化酶9基因的表达。

怀孕和断奶期间口服SCFAs保护小鼠后代免受过敏性肺炎影响

在小鼠中,短链脂肪酸通过抑制组蛋白去乙酰化而增加转录因子Foxp3的表达,从而支持T调节细胞(T调节细胞)的扩增,增加IL-10的产生。

在OVA和家庭尘螨(HDM)诱导的气道炎症模型中,短链脂肪酸还被证明可以减少炎症。

此外,在怀孕和断奶期间口服SCFAs对小鼠有保护作用,使其后代免受过敏性肺部炎症的影响,尤其是丁酸能有效诱导幼鼠肺部Tregs的产生

哮喘粪便样中组胺分泌细菌数量增多

最近有研究表明,人体肠道细菌能够产生其他具有促炎和抗炎作用的代谢物,如生物胺(包括组胺)和氧化脂质,如12,13-di-HOME。哮喘患者粪便样本中组胺分泌细菌数量明显增多。此外,组胺分泌细菌的数量与疾病的严重程度有关。

然而,在OVA引起的过敏性气道炎症模型中,细菌源性组胺降低了支气管肺泡液中的总细胞数和肺匀浆中IL-4、IL-5和IL-13的含量,突出了细菌源性免疫调节的复杂性。相反,12,13-dihome小鼠腹腔治疗可减少肺部Treg细胞的数量,并增加蟑螂抗原小鼠气道炎症模型的肺部炎症,由肺和肠道细菌分泌的代谢物可能被证明有助于额外的治疗方法

占主导的变形菌——潜在的致病菌

在几项人类研究中,肺部变形菌似乎是哮喘患者中最占主导地位的门。变形杆菌门以潜在的致病菌为代表,包括Haemophilus, Moraxella, and Neisseria菌属。

哮喘炎症表型中,嗜中性粒细胞性哮喘患者,通常接受高剂量吸入性皮质类固醇(ICSs),与嗜酸性哮喘患者比起来,表现出菌群多样性较少,Haemophilus 和 Moraxella、变形菌门相对富集,链球菌、Gemella、卟啉单胞菌的相对丰度降低

克雷伯氏菌在严重哮喘患者中富集

在严重哮喘患者中,代表非2型哮喘的Th17细胞上皮基因特征与变形菌门的表达增加有关,这进一步与哮喘控制的恶化和哮喘中性粒细胞恶化有关。克雷伯氏菌是变形菌门中的一个细菌属,在严重哮喘患者中特别富集,而放线菌门与哮喘控制有关。

哮喘治疗也可能导致肺部菌群变化

哮喘治疗也可能导致肺部微生物群落的变化,这表明在确定因果关系方面的复杂性。例如,放线菌与类固醇反应的分子证据(FKBP5表达)有关。因此,某些气道微生物可能有潜力被用作哮喘对类固醇反应的指标,使临床医生能够改进治疗方法

重要的是,肥胖和哮喘对机体免疫反应、气道和肠道微生物群的实质性相加效应最近已被描述。

患有严重疾病的肥胖和非肥胖哮喘患者的粪便中Akkermansia muciniphila菌水平均有所降低,这可能与急性和慢性气道炎症的小鼠模型中所显示的因果关系有关。严重哮喘患者肺部的另一个属是链球菌。

特应性哮喘患者,通常表现为嗜酸性炎症表型,在梭杆菌属、卟啉单胞菌属和鞘氨醇单胞菌科的细菌中有丰富的菌群,同时单胞菌科和乳杆菌科的相对丰度降低

此外,哮喘患者痰液中的嗜酸性粒细胞与成人体内的Tropheryma whipplei有关。与中性粒细胞性哮喘惊人的可重复性研究结果相反,嗜酸性粒细胞性哮喘和2型哮喘中的微生物群较不清晰且异质,可能再次反映了ICSs治疗引起的不同的微小型或混合型反应。

目前尚不清楚成人哮喘患者气道中特定细菌的多样性和存在在多大程度上反映了炎症的类型或微生物对皮质类固醇治疗的反应。研究表明,ICSs和口服糖皮质激素联合治疗变形菌和假单胞菌数量增加拟杆菌、梭菌和普雷沃菌数量减少呈正相关。

另一方面,一项未经吸入皮质类固醇治疗的轻度哮喘研究表明,嗜血杆菌、奈瑟菌、梭菌和卟啉单胞菌具有独特的富集作用,同时在其气道中的单胞菌科和乳杆菌科存在缺失。这些研究表明,经常使用皮质类固醇治疗的哮喘患者的肺微生物群组成,可能是炎症环境药物作用之间复杂相互作用的结果。

小鼠在感染Moraxella catarrhalis菌(M. catarrhalis,Proteobacterium phyla)1天后,可导致嗜中性粒细胞浸润IL-6、IL-1b和肿瘤坏死因子a (TNF-α)的高浓度、CD4+T细胞来源的IFN-gIL-17的中度浓度。此外,IL-17或TNF-α而不是IL-6的中和作用,可加速卡他性支气管炎的清除,有效地预防感染引起的过敏性气道炎症的恶化。

来自变形菌门的流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae 能够将与Th2细胞和嗜酸性粒细胞相关的类固醇敏感过敏性气道疾病(AAD)转化为与Th1细胞、中性粒细胞和显性IL-17反应相关的类固醇抗性疾病。

越来越多的证据表明细菌在哮喘中起着一定的作用,但还需要进一步的研究,以更清楚所涉及的最重要的菌群,并了解哮喘背景下的细菌失调是否是疾病的原因或影响。更详细的机理研究是必要的,以充分了解肺和肠道微生物组成和复杂的关联代谢在生活中的不同点与特定类型的哮喘炎症。未来的工作应集中在继续详细描述介导细菌哮喘宿主之间沟通的细胞和分子机制。

05

超越细菌的视野:

真菌——被遗忘的微生物

目前尚不清楚真菌是在健康的成人肠道中定植,还是只是作为短暂的口腔或食物来源的真菌被检测出来,但即使是短暂的肠道定植者也有可能影响微生物群落生态和宿主免疫反应。

真菌失调是与儿童高危哮喘表型的发展相关

虽然所涉及的机制没有被探索,但最近对来自美国和厄瓜多尔的人类出生队列的两项研究已经确定真菌失调是与儿童高危哮喘表型的发展相关的婴儿肠道微生物特征的一个关键特征。

这些结果表明,真菌失调可能是一个容易检测到的哮喘风险的生物标志物。 此外,这两项研究都发现真菌失调与细菌失调有关

肠道内的微生物影响宿主对其他微生物的免疫反应,在生理和代谢上相互作用,并争夺空间和营养。 动物模型的早期研究旨在建立真菌失调与哮喘严重程度之间的因果关系,结果表明用抗生素预处理的小鼠经常见的人类肠道共生白色念珠菌(C.albicans)灌胃后受真菌过度生长的影响。

这些小鼠进一步证明,在气道刺激后,Th2细胞介导的气道炎症加剧,这一效应被认为至少部分是由白色念珠菌产生的免疫调节前列腺素介导的。

与此相一致的是,抗生素治疗后小鼠肠道中另一种念珠菌的过度生长与前列腺素PGE2介导的肺巨噬细胞向M2表型的极化有关,并在抗原致敏和刺激后加重了过敏性炎症

在该模型中,真菌过度生长与肺部的炎症免疫细胞浸润有关,但也需要特定的抗生素引起的细菌微生物的变化。只有引起乳酸菌属相对数量减少抗生素才与真菌过度生长和抗原激发后气道炎症加重有关。

值得注意的是,乳酸菌和其他产乳酸的细菌因其作为益生菌而受到关注,以预防哮喘和过敏,并具有抗真菌作用。

进一步的证据表明,真菌失调发生的历史和当前微生物环境影响了哮喘期间相关的免疫后果,这一点最近才出现。

不存在支原体的小鼠在接种了失调真菌后显示出Th2和Th17细胞的混合性肺浸润,而同样的方法在有支原体的常规小鼠中只导致哮喘期间Th2细胞炎症的增加。类似地,感染白色念珠菌的真菌初生小鼠表现出与真菌特异性Th17细胞和IL-17高反应中性粒细胞的系统性扩张相关的AAD恶化。这些研究共同强调了肠道微生物群的复杂性、动态性以及跨界微生物相互作用在确定哮喘预后中的重要性。

除抗生素治疗外,抗真菌治疗还可引起特异性无病原体(SPF)小鼠肠道细菌和真菌群落的变化,并在AAD的HDM模型中加剧2型变态反应性气道炎症和嗜酸性粒细胞增多。

连续补充在该模型中鉴定为在真菌治疗后肠道中过量表达三种真菌(安斯曲霉Aspergillus amstelodami,Wallemia mellicola [sebi]和Epicoccum nigrum)或在抗生素治疗后单独补充Wallemia mellicola会增加哮喘的严重程度。

在这些研究中,抗真菌治疗和向特定无病原体小鼠引入抗生素真菌群落导致肠道细菌群落的变化,包括乳杆菌科减少。然而,在未经抗生素预处理的改变的Schaedler菌群小鼠中,在细菌微生物群没有实质性变化的情况下,再补充失调真菌可使AAD的恶化作用重现

此外,最近证明,肠道常驻CX3CR1+单核吞噬细胞直接感应抗真菌诱导的真菌失调增加固有层中Th2细胞的数量,并导致AAD HDM模型中真菌失调相关的气道炎症增加,与细菌群落的抗真菌相关变化无关。

因此,除了通过重组免疫调节肠道细菌种群或产生系统代谢物对气道炎症有潜在的间接影响外,在肠道中的哮喘相关真菌失调可对宿主天然和适应性免疫细胞群体产生直接影响

肺中的局部真菌失调也与哮喘有关

在一个小样本的受试者中,有和没有严重哮喘的儿童在支气管肺泡液样本中表现出特定真菌的相对丰度的差异,但在支气管肺泡液体样本中,真菌的总体多样性并不存在差异。这些差异包括严重哮喘患者 Pneumocystis相对丰度的增加,这是肺中存在的一种菌,与人体和动物模型中宿主2型免疫反应的诱导有关。

Pneumocystis 在2-5个月龄时的亚临床定植被认为是婴儿期最常见的感染之一,并与粘蛋白基因表达增加有关Pneumocystis的早期肺定植可能是诱导肺中Th2细胞偏向免疫反应的危险因素,并使婴儿容易哮喘。

一项针对成人患者的18S焦磷酸测序研究同样发现,与非特应性对照相比,哮喘患者痰中特异性真菌相对丰度存在差异。在这些成年人中,哮喘患者表现出与特应性皮炎过敏条件有关的马拉色菌Malassezia 相对丰度增加

总的来说,这种情况逐步浮现:哮喘患者表现出与诱导2型炎症免疫途径相关的特定真菌的相对丰度增加,一些真菌要么不存在,要么只存在于健康肺中的低丰度中。

哮喘患者肺部真菌改变的结果并不令人惊讶,因为真菌成分,如甘露聚糖、蛋白酶、几丁质和β-葡聚糖通常存在于常见的人类过敏原和室内灰尘中。虽然致敏的潜在机制尚不清楚,但许多严重和/或不受控制的哮喘患者对真菌敏感和/或在抗真菌治疗后哮喘症状可能有所改善

通常与致敏和哮喘相关的肺部真菌包括曲霉属Aspergillus、链格孢属Alternaria枝孢属Cladosporium

有意思的是,一些来自动物模型的证据表明,致敏作用是继发于自然Th2细胞嗜酸性粒细胞免疫应答之后,才能有效清除引起感染的真菌。此外,支气管肺泡液样本中真菌载量增加与严重哮喘患者的皮质类固醇治疗有关,无论是否有真菌致敏。

因此,需要进一步的研究来确定病理性真菌定植和肺部真菌失调是否会导致更严重的哮喘发作,并在严重哮喘相关的皮质类固醇治疗后发生,和/或对哮喘相关的肺部微环境变化作出反应。

气道真菌群

最近,研究已经开始精确地描述与某些哮喘内质型和临床特征相关的气道真菌群。在一项检查气管内灌洗和支气管肺泡液体的微生物群的研究中,与健康对照组和2型低哮喘患者相比,Fusarium, Cladosporium, Alternaria在哮喘患者和2型高哮喘患者的支气管肺泡液体中富集。

表明其作为疾病生物标志物的潜力,支气管肺泡液液中交互链球菌和棒孢菌的相对丰度也与强制呼气容积1呈负相关(一种肺功能的临床测量方法)。

在过去的几十年里,对肠道微生物(包括真菌)的对宿主的组成和免疫作用的研究已经爆发。 虽然还有许多有待阐明的地方,但一组强有力的证据现在支持真菌失调-哮喘中的重要作用。

真菌-细菌和真菌-宿主相互作用在确定真菌失调对宿主健康的影响方面都起着重要作用。 许多这项工作已经在儿童出生队列和小鼠模型中完成,需要更多的研究肠道菌群与成人哮喘的相关性。

此外,早期真菌失调是否以及如何影响以后生活中当失调不再时的哮喘发病和/或严重程度,仍然需要进行机械试验。

06

病毒很容易在肺部定居

尽管病毒感染被认为是哮喘恶化的主要原因,但病毒与哮喘之间的关系还不完全清楚,是由于不断发展的有关呼吸道健康的知识。

已观察到上呼吸道和下呼吸道病毒的组成和丰度健康受试者和无症状有症状的慢性呼吸道疾病患者中有所不同,但需要进行详细的纵向研究,以更好地理解因果关系。

病毒与额外的环境和内在因素之间复杂的相互作用可能是哮喘患者呼吸道中某些病毒存在时间较长但短暂的原因,或是导致严重恶化的完全感染的发生。

在人类生命的第一年,几乎所有的喘息发作都与病毒感染有关。

已知引起哮喘喘息或恶化的最常见的病毒是RV和RSV,但博卡病毒、流感病毒和巨细胞病毒也有牵连。 据报道,早期人类鼻病毒引起的喘息对以后的哮喘风险有附加作用。

RV病毒

RV毛细支气管炎患儿气道中最丰富的细胞类型是中性粒细胞,尽管嗜酸性粒细胞的浸润也起着重要作用。此外,最近已经证明肥大细胞IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-α的浓度在RV病毒刺激后显著升高

T细胞参与通过识别病毒抗原和随后启动TC和抗体介导的免疫应答来控制RV病毒感染。最近的一项研究表明,RV病毒在体外进入并形成B淋巴细胞病毒复制中心,并诱导B细胞增殖

RSV病毒

另一种与哮喘风险增加有关的病毒是RSV病毒;然而,它与该疾病的关系不太清楚。 有研究表明RSV病毒引起的毛细支气管炎与哮喘之间存在联系,但其他研究尚未确定婴儿RSV病毒感染与学龄哮喘发展之间的相关性。

RSV病毒感染对哮喘的长期影响与以下事实有关:该病毒通常在肺发育过程中影响新生儿。新生儿调节性B细胞对RSV病毒感染有很高的耐受性,其频率可以预测急性细支气管炎的严重程度。 此外,RSV病毒迅速附着在人类嗜酸性粒细胞上,并可能被这些细胞灭活。 随着哮喘严重程度的增加,嗜酸性粒细胞捕获病毒的能力降低了75%。

流感病毒

流感病毒是与哮喘恶化有关的另一种病毒感染。 流感感染背景下的哮喘与更严重、更高的住院风险、需要重症监护和死亡率有关。据推测,IL-33是驱动流感病毒引起的哮喘恶化所必需的。 在哮喘小鼠模型中,IL-33通过抑制先天和适应性抗病毒反应来增强气道高反应性和气道炎症。 另一项研究表明,流感感染通过一种需要IL-13-IL-33轴的途径诱导气道高反应性。

影响儿童哮喘的不常见病毒——HBoV和巨细胞病毒

除了与哮喘相关研究最为深入的病毒和上面描述的病毒外,还有一些不太常见的病毒影响哮喘中的气道炎症。 人博卡病毒1型 (HBoV)和巨细胞病毒也与儿童哮喘发作有关。

另一项研究报告说,在一个小样本中,急性喘息儿童HBoV病毒年龄为 ≥4 岁的因急性细支气管炎住院的儿童,他们都发展为反复哮喘,其中一半在5-7岁时患有哮喘。

还有证据表明,在OVA致敏小鼠中皮下注射急性喘哮喘儿童HBoV-VP1u 或 B19V-VP1u可导致气道炎症升高。 最后,51.4%的复发性喘息患者检测到巨细胞病毒DNA,在12-36个月的哮喘预测指数阳性的患者中比在阴性的喘预测指数同一年龄组中更普遍。

呼吸道病毒感染与哮喘发展之间的联系最近已经用很多方法进行了研究。 然而,导致这种相关性的确切机制尚不清楚,需要在动物模型和人类研究中使用多组学方法进行进一步的详细研究。考虑患者全球病毒的分析也应在未来考虑。最后,科学家还应该问一个问题:肠道病毒是否可能影响肺部炎症?

07

古细菌在人类肠道中的出现

虽然研究不足,但古细菌在人类微生物研究中一直被发现,它们的群落组成因身体部位而异。

古细菌主要有Methanobrevibacter smithii,Methanosphaera stadtmanae,具有免疫原性。

最近,一项针对来自荷兰考拉出生队列的472名儿童的研究表明,肠道古菌在失调-哮喘范式中的作用。6至10岁儿童粪便样本中存在M. stadtmanae(一种常见的肠道古菌,与儿童哮喘风险显著相关,提示肠道古菌可能在过敏的发生发展中起到调节作用),这种情况与被诊断为哮喘的风险降低有关。这种效应与父母哮喘状态无关。

然而,在本研究的样本中,只有8.3%的样本检测为阳性,而某些古生物蛋白实际上被认为具有促炎性或致敏特性。 因此,需要更多的队列研究和机制研究肠道古菌在哮喘背景下的免疫调节作用。

与其他微生物群的情况一样,古生物群破坏的微生物和免疫环境可能决定了宿主的最终免疫后果。随着儿童和成人中的人类肺微生物群的不断特征化,肺古菌在生物失调模式中的作用有待确定。

08

结语

现在有大量的文献支持人类微生物群影响宿主免疫系统的成熟和功能。肺和肠道微生物对哮喘的发展、表型和严重程度都有影响,但这些相关性的详细细胞和分子机制尚未得到充分的表征。

一个有助于理解人类微生物群和免疫系统之间联系的机制的重要工具是用于过敏性气道炎症的人源化微生物群小鼠模型。

人类队列研究应包括明确界定的临床结果,并从关于症状治疗临床信息的详细和具体问题中收集纵向数据。 关于病人饮食和生活方式的完整信息也应仔细准备,以确保最好地概述病人的情况和对微生物群的潜在影响。

需要对更多患者进行纵向和前瞻性分析,以了解疾病的病程、其表型和内型、对疾病进展的易感性以及对治疗的反应之间的关系。

总之显而易见,哮喘患者的未来诊断和治疗应通过分析个体微生物群的组成和代谢活动来辅助。


参考文献

Barcik W, Boutin R C T, Sokolowska M, et al. The Role of Lung and Gut Microbiota in the Pathology of Asthma[J]. Immunity, 2020, 52(2): 241-255.

怀孕期间母体肠道微生物分子保护后代免受代谢性疾病的影响

近日,日本学者发表在Science上的一项研究
(DOI: 10.1126/science.aaw8429 )为妊娠期母体肠道微生物对后代健康影响新增一项证据,该研究表明表明,孕期母体肠道环境是影响后代代谢发育以预防代谢综合征的关键因素,因此,孕鼠肠道微生物群提供了一个环境线索,可以微调后代的能量稳态以预防代谢综合征的发育起源。

早期生命期是一个关键的时期:影响胎儿发育的事件可能带来一生的影响。人类胎儿发育过程中的一点点紊乱不仅影响主要的发育结果,甚至有可能影响几十年来无法表现的表型,如心脏代谢疾病的风险。

近几十年来,抗生素使用和摄入高热量、低纤维饮食的迅速扩大导致肠道微生物群的紊乱,使人类容易患上各种疾病,如代谢综合征。虽然微生物群对出生后的影响已经有很好的文献记载,但是关于胚胎阶段肠道微生物群的影响所知甚少。 尽管越来越多的证据支持健康和疾病的发展起源(DOHaD)这一概念,但其潜在机制仍不清楚。

在这项研究中,主要探讨了母体肠道微生物群胚胎发育和后期疾病易感性的影响。

以短链脂肪酸为代表的肠道微生物群衍生代谢产物(如乙酸、丙酸和丁酸),不仅是宿主细胞的燃料,而且还是肠道微生物群和肠外器官之间的信号分子

GPR41和GPR43属于游离脂肪酸受体(FFAR)家族,是SCFAs的受体。

之前已经证实了FFARs在能量代谢中的生物重要性,通过与膳食成分以及肠道微生物群衍生代谢产物的相互作用。

肠道微生物SCFAs通过交感神经系统、脂肪组织、胰腺和肠道中的GPR41和GPR43调节宿主能量稳态。

最近的一项研究进一步表明,怀孕小鼠的肠道微生物群影响后代的免疫和大脑功能。在DOHaD理论的背景下,这些发现增加了母体SCFAs调节出生后疾病易感性中起关键作用的可能性。

妊娠期间,母体肠道微生物群通过胚胎SCFA受体影响后代肥胖倾向

研究人员发现孕期母体微生物群对后代的肥胖具有抵抗力

怀孕小鼠在特定的无病原体(SPF)和无菌(GF)条件下繁殖,之后由寄养母亲在常规条件下抚养新生儿,以调整出生后的生长环境。来自GF母亲的后代极易患代谢综合征,其特征是肥胖和葡萄糖不耐症的加重,与成年期高脂饮食消耗的能量消耗减少有关。在妊娠期喂食低纤维饲料的小鼠后代中也观察到类似的表型。

SCFA治疗妊娠GF或低纤维饮食喂养的小鼠使成年后代对肥胖具有抵抗力。妊娠小鼠结肠腔内的SCFA通过母体肝脏和血流到达胚胎。值得注意的是,胚胎的交感神经、肠上皮和胰腺高度表达GPR41和/或GPR43,以感知来自母体肠道微生物群的SCFAs。

然而,他们观察到GPR41在无菌小鼠中的表达较低。小鼠GPR41表达的丧失导致交感神经投射到心脏的缺陷,这在无菌后代中也是明显的。

体外证实了SCFAs激活交感神经元分化的能力,丙酸具有最大的作用。在缺乏GPR43的小鼠中,作者发现SCFA和微生物群在胚胎肠内分泌和胰腺B细胞发育中的依赖性缺陷。

微生物对代谢疾病的保护

SCFA-GPR41 和 SCFA-GPR43轴 赋予后代对肥胖的抵抗力

胚胎GPR41和GPR43信号转导的缺失在产前由于交感神经功能障碍和高血糖而影响能量代谢。SCFA-GPR41和SCFA-GPR43轴促进神经细胞、表达GLP-1的肠内分泌细胞和胰脏细胞的发育,从而形成胚胎能量代谢。这个发育过程有助于维持出生后的能量平衡。

在怀孕期间,母体肠道微生物群通过 SCFA-GPR41 和 SCFA-GPR43轴 赋予后代对肥胖的抵抗力。妊娠期间,GPR41和GPR43在胚胎的交感神经、肠道和胰腺中感知来自母体肠道微生物群的SCFAs,影响代谢和神经系统的产前发育。

这些发现表明,孕期的母体肠道环境是防止代谢综合征的后代代谢程序的关键因素。

因此,怀孕小鼠的肠道菌群提供了一种环境线索,可微调子代的能量平衡,从而防止代谢综合征的发展。

补充丙酸来拯救?

事实上,另一项研究结果也表明,在怀孕期间喂养低纤维饮食的小鼠的后代增加了肥胖和胰岛素抵抗的风险。低纤维饮食的有害影响可以用丙酸补充来拯救。

当怀孕的小鼠服用抗生素时,高纤维和低纤维饮食喂养的母亲的后代的代谢参数没有差异,证实了母体微生物在介导保护方面的重要性

高纤维喂养动物的后代出生时更重,但在以后的生活中免受肥胖的影响。这与人类是一致的,因为低出生体重与未来的肥胖有关。补充丙酸孕鼠保护后代免受未来疾病的影响。 然而,丙酸补充是否对母亲有任何影响尚未评估。

考虑到减少人类代谢性疾病的目标,确定类似的机制是否控制人类的发展是至关重要的。 迫切需要更好地理解如何、为什么以及在什么情况下应该尝试调节妊娠中的肠道微生物群或SCFA。 

高纤维饮食符合现有的营养建议,包括在怀孕期间,但这些是否能有效地增加SCFA和保护后代免受未来代谢性疾病的影响尚不清楚。人类微生物组成存在很大的个体间变异,不同的微生物具有不同的SCFA生产能力。 因此,微生物群产生SCFA能力的差异可能会影响后代肥胖的风险

虽然补充丙酸可能是一个方便的选择,但怀孕期间的安全性和有效性仍有待确定。对人类的进一步研究是有必要的,以了解调节这一途径是否可以成为改善下一代代谢健康的途径。

参考文献

I. H. L. Blackmore, S. E. Ozanne, J. Mol. Cell. Cardiol. 83, 122 (2015).

II. I. Kimura et al., Science 367, eaaw8429 (2020).

III. J Ferguson.  Science 367  eaaw6481 (2020)

细菌的天敌抗生素,如何利用这把救命的双刃剑?

本文原创:谷禾健康

头痛,喉咙痛,咳嗽,流涕…不管什么症状,先吃上阿莫西林再说。感冒还没正式开始,抗生素却已经吃上了。

很多这样想当然的行为正透露着人们对抗生素的认知不足,那么该如何正确使用抗生素呢?

 正 确 使 用 抗 生 素

1、首先使用抗生素应该在医生指导下使用,在未明确是细菌感染的情况下,尽量不要自行随意服用抗生素。不应作预防用药。

2、抗菌药物疗程因感染不同而异,对于急性感染抗生素的疗程一般为5~7 天,宜用至体温正常、症状消退后72~96 小时之后方可停药,特殊情况,妥善处理。

3、如果医生嘱咐的一天吃三次,并不等于早、中、晚饭后各一次,而是每隔4-8 小时服用一次(不同种类药物间隔要求不同)。

4、长期使用抗生素容易引起体内菌群失调,并容易引起耐药性

5、老人、肝肾功能减退者等特殊人群用药需遵医嘱

6、头孢类药物服用后禁止饮酒。严重者半小时可危及生命。

7、如需做菌群相关的健康检测,应在服用抗生素停药至少3天 后进行。

家长给儿童使用时也应当注意:

8、不要自行随意给孩子用抗生素

9、不要要求医生给自己孩子用抗生素

10、不要拒绝医生给孩子开的抗生素

抗生素是把双刃剑,如果合理使用,可以很快治愈细菌感染的疾病;若是不合理使用,也会带来巨大的危险。

  什么是抗生素?

  抗生素是怎么发现的?

  抗生素有哪些类型?

  抗生素是如何作用于细菌?

  为什么会出现耐药性?

  耐药性的危害有哪些?

  抗生素、菌群与疾病

  三者之间会发生什么?

  … …

本文将为大家一一解答。

01

什么是抗生素

抗生素,是指由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物,能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。

以上这段话为了便于理解,我们还是要从微生物说起。相信微生物这个概念对于熟悉我们公众号的你,并不陌生。

我们经常强调,它们的无处不在,存在于环境,也存在于人们体内。这些细菌并不是闲着,每天会干很多事,诸如帮助消化,合成维生素,促进营养吸收等。

这么多细菌之间也会存在相互竞争的关系,于是某些细菌发展出了一些特殊技能——“排挤”,该技能是通过分泌一种化学物质让其他细菌无法生存,从而利于自己生存。

这种分泌出来的化学物质就是抗生素

02

抗生素的丰功伟绩

很多年前,细菌感染是让人害怕的,一个微不足道的伤口,甚至只是虫咬都可能要人的命。

在19世纪,肺炎、结核病、腹泻和白喉被认为是儿童和成人死亡的主要原因。无数专家学者日以继夜地奋斗,希望找到感染者的治疗方式。

在20世纪初发现抗生素之后这一切都变得不一样了。特别是在亚历山大·弗莱明发现青霉素,抗生素的治疗得以在世界各地逐渐普及,可以说抗生素拯救了数百万人的生命,并使困扰人类历史数百年的大多数传染病得到控制

毫无疑问,抗生素是过去100年中人类和动物医学中最重要的药物之一。那抗生素是何时出现?如何被发现并一步步走向今天这样大规模生产的呢? 

早期抗生素的发现

早在现代医学出现之前,抗生素已经使用了很长一段时间。自古埃及以来,人们就知道面包对治疗伤口和烧伤有效果,而面包上生长着丝状真菌。

往后几十年是抗生素发现的黄金时代,发现了多种抗生素,具体每种抗生素的发现时间及来源详见下表。

Durand G A,et al, 2019

细菌和真菌是最大的生产者。链霉菌属是目前人类医学中大约一半抗菌剂的来源。有了抗生素,致病菌能够及时清除,许多疾病得以治愈,人们生存几率大大提升。

以上是抗生素的发展史,我们可以看到抗生素的种类也非常多,那要怎么去认识它们?也许可以从抗生素的分类开始。

03

抗生素的分类及作用原理

抗生素的分类,根据标准不同,分法不同。

根据抗菌谱可分为窄谱 广谱 两大类,如下:

根据化学分子结构,可大致分为以下类别,列出的是该类别具有代表性的抗生素。

在了解了抗生素的历史和分类之后,我们再来了解下抗生素是如何凭一己之力力挽狂澜战胜病原菌,从而挽救那么多生命的?

总的来说,抗生素的作用原理有以下三种。

一:它们进攻的是细菌制造细胞壁所需要的部件。一旦细胞壁受损,细菌细胞就会死亡。比如青霉素就巧妙地利用了这个特点。

二:对于细胞而言,蛋白质至关重要。细菌细胞需要蛋白质来消化食物、构筑细胞壁、运动、繁殖、抵御入侵者等。抑制细菌合成蛋白质的抗生素直接作用于蛋白质合成的部件,使细菌严重受损,但它们对人体细胞的蛋白质合成没有多大影响。比如链霉素等。

三:破坏它们的增殖过程。一旦细菌的生长受到了限制,它们的威胁就会大大降低,宿主便来得及积累足够的免疫反应清除它们。

常见抗生素的具体作用详见本文末附录部分。

04

合理使用抗生素

· 平时你熟悉的 “消炎药” 就是抗生素

相当一部分人听闻抗生素胆战心惊,认为需要远离,但是这其中很多人认为普通的感冒药都只是消炎药,与抗生素没什么关系。感冒了吃点消炎药,但其实很多你熟悉的所谓的消炎药就是抗生素,比如阿莫西林。

严格意义上来讲,消炎药并不能算医学概念。

简易区分抗生素和消炎药

判断是否是抗生素最简单的方法就是看名字。

这一招看着不是很高大上,但足以对付常用药。

一般药名里含有「霉素」「菌素」「沙星」「头孢」等字样的,大多是抗生素(少数是化疗药)。

名字里有「西林」的也是抗生素,像我们非常熟悉的阿莫西林,另外还有氨苄西林、苄卡西林、羧苄西林等,都属于经典的青霉素类抗生素

名字里有「磺胺」的,一般就是磺胺类抗生素。

而消炎药,一般有两类:

一类是我们常说的激素(看名字里面的“”),如可的松、氢化可的松、地塞米松等;

另一类是消炎止痛药,如布洛芬、阿司匹林等。

当然还有一部分人并不在乎到底是抗生素还是消炎药,认为这些药就是管用见效快,甚至有一些患者主动向医生要求使用抗生素,希望好起来快点…

· 不恰当服用抗生素可能危及生命

头孢类抗菌药物服用之后是不能喝酒的。因为服药期间饮酒很有可能引起双硫仑样反应,出现心慌,脸红,血压下降等改变,严重者危及生命

为什么会出现这么严重的后果?简单来说就是,头孢类药物抑制了肝脏里的乙醛脱氢酶,如果这个酶的水平高意味着解酒功能强。但是这种酶功能被抑制了,使得酒精在人体内氧化为乙醛后不能再继续氧化分解,从而导致乙醛在体内蓄积,引起乙醛中毒反应。

·抗生素不是你想用就能用,想停就能停

这里仍需强调的是,抗生素不能随意使用,但是用了之后也不能随便停。因为当症状消退时可能还剩下一小部分菌没有完全消灭,这时候如果停药,那么这部分细菌生存下来之后会产生耐药性。当然如果过量,也会产生耐药性。

再比如说抗菌药物需每隔4-8小时服用(每种药物半衰期不同,所需间隔时间不同),因为如果两次服药时间间隔太近,会造成药物在血液中的浓度太高,从而导致神经或肝肾功能损伤;而间隔太远,血液中药物浓度不够,对细菌的杀灭作用就会减弱,同样会产生耐药性

可以看到,耐药性被频繁提及,那么到底抗生素耐药性为什么可怕?滥用抗生素的后果是什么?

05

抗生素耐药性

在2011年世卫组织提出:抵御抗生素耐药性。之后该组织在2015年再次向人们发出警告不要滥用抗生素。这无疑给世界敲响了警钟。

其实在过去20年中抗生素的负面性已经逐渐显现,由于抗生素滥用,问题变得逐渐复杂起来,耐药菌的出现越来越多。

· 抗生素药物的研发困难

在实际治疗中,人们对于是由何种细菌引起的感染认知较少,生产窄谱抗生素困难投入大收效低,然而,在并不需要精确判定是什么菌引起感染的时候,只要用上广谱抗生素,就能起到作用,广谱抗生素的普适性优势使得其应用频率越来越大,随之而来的问题是,耐药菌的产生变得更为容易

· 超级细菌的诞生

当抗生素在能力范围内将致病菌清除之后,那一小部分耐药菌留下来,不断生长繁殖,当耐药菌与药物不断接触之后,对药物的敏感性越来越低直至消失,逐渐进化成了无敌的超级细菌

超级细菌的抗性机制可以通过获得基因来介导,使他们能够在抗生素或基因突变的作用下存活下来,作为自然选择过程的一部分进化而来。

超级细菌目前在全球范围内广泛流行:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、艰难梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和耐万古霉素肠球菌属等都是超级细菌的典型例子。

耐药性机制

细菌可以天生对某些抗生素产生抗药性,但也可以通过染色体基因突变水平基因转移获得对抗生素的耐药性。

耐药性的固有机制

一种细菌对一种特定抗生素的固有抗性是由于其固有的结构或功能特性而产生的对该抗生素作用的抵抗能力。

Blair J M A,et al, 2015

该图显示了固有机制的概述。所示的例子是针对青霉素结合蛋白(PBP)的β-内酰胺抗生素。

抗生素A可以通过一种跨膜孔蛋白进入细胞,达到目的,抑制肽聚糖的合成。抗生素B也可以通过孔蛋白进入细胞,但与抗生素A不同,它是通过外排有效去除的。  抗生素C不能穿过外膜,因此不能进入靶PBP。也就是说这个抗生素C想进去没门。

除了固有的耐药性外,细菌还能获得或产生对抗生素的耐药性。可以通过以下三类主要机制来调节:

由于细菌渗透不良抗生素外排而使抗生素在细胞内的浓度降至最低的机制;

通过基因突变靶标的翻译后修饰来修饰抗生素靶标的;

通过水解或修饰使抗生素失活的。

· 耐药性危害

毫无疑问,抗生素耐药性对生命构成了威胁,由耐药病原体引起感染的患者死亡率更高,人类遭受的痛苦也更大。由于长期住院和生产力下降,与抗生素耐药性相关的经济负担是巨大的,并在卫生保健系统中造成惊人的损失。

仅根据流行病学监测数据,对各种抗生素的耐药性比预期的要早几年到几十年。可以看到发展非常迅速。

目前主要的威胁来自于碳青霉烯类抗生素革兰氏阴性病原体,由一系列基因编码,包括ndm-1,oxa-48,kpc,vim.

而比碳青霉烯类抗生素耐药问题更为复杂的是,对粘菌素耐药的质粒介导基因(mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5和icr-mo)出现了。

粘菌素是一种比较古老的药物,一般不到万不得已的时候不会用到,它是用于复杂感染患者身上来对付超级细菌的,可以说是抗生素的最后一道防线

现在对粘菌素耐药的质粒介导的基因出现可以说是最后的防线破了,那么患者的生存率就更小了。

· 动物中发现耐药菌

2016年,中国首次报道了mcr-1,它是从培养的大肠杆菌中分离出来的,并在从生肉、牲畜和人类培养的大肠杆菌中证实了它的存在。自那时以来,mcr-1已在全球范围内报道,并在许多细菌物种中检测到,包括肺炎克雷伯菌和肠杆菌属。

编码超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的基因的多个变种,使大多数青霉素类、头孢菌素类和单杆菌类药物产生耐药性,目前已在全球分布。欧洲抗生素耐药性主要监测网络的报告表明,这些基因在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中的流行率仍然很高。

以上越来越多的证据指向一个事实,在动物身上使用抗菌药物与人类的耐药性有关

· 动物与人之间的互相传播

上世纪40年代,人们发现给动物喂食抗生素后它们的体重飙升,为了尽快达到饲养目的,越来越多人将抗生素运用于动物饲养,那么这些抗生素首先会在动物之间进行传播,然后在不知不觉中就传播到人类中去。

Muloi及其同事的一项Meta分析表明,动物和人类之间的抗药性转移是双向的,但强度也不尽相同,这促使人们呼吁在全球范围内采用稳健的基因分型方法进行进一步的研究,世卫组织对当前证据的一项审查已经促使重新提出建议,大幅度减少动物体内的抗生素的使用,并停止使用它们促进生长。

· 抗生素耐药性也许就在身边

不要觉得自己离抗生素耐药性还相当遥远,其实稍不注意,抗生素耐药性就会发生。

案例一:5岁儿童,服用抗生素半年,他的肠道菌群检测报告显示:

可以看到,这位5岁的小朋友已经出现抗生素耐药性高风险(红色为高风险状态)。

也就是说半年已经可以让一个小朋友产生多种抗生素耐药性。

肠道菌群总体状况也提示菌群多样性减少,菌种数量减少

尤其是有益菌数量的下降。

关于抗生素,疾病与菌群关联的这部分,我们将在下一章节详细介绍。

06

抗生素、菌群与疾病的关联

抗生素的另一个有可能被忽视的影响是:

抗生素的使用,无论是口服还是静脉注射,都会影响肠道微生物群。

人类的肠道微生物群代表着一个复杂的相互网络,抗生素的作用并不局限于其有限的抗菌谱:例如,由于相互依赖,利用途径,某些菌株不能在没有其他菌株的情况下有效地建立菌落。

健康肠道微生物群的稳定组成通过在空间和营养物质上的竞争,提供了对入侵病原体的自然抵抗力,这可能在抗生素暴露后受到严重影响。

抗生素引起的肠道菌群失调及其在疾病中的作用

抗生素对肠道失调的影响和在疾病中的作用(即使短期使用抗生素)可能会将微生物群转变为长期失调状态,其特征是菌群多样性的变化,重要菌群的丧失,以及由此引起的代谢改变导致对肠道病原菌的定植抗性受损

我们来看 案例二:住院患者,年龄76岁,长期服用抗生素治疗改善,其肠道菌群检测报告如下:

这是该患者的健康总分:29分。属于不健康状态。(注:总分100分制,一般健康人或亚健康普遍能在60分以上)

我们来看他的抗生素风险评估部分:

报告显示他的氯霉素类耐药风险高。再看肠道菌群的总体状况如下:

提示菌群多样性缺乏,有益菌数量明显下降。说明其菌群紊乱。而疾病风险评估这部分则显示了多种疾病高风险状态。尤其是代谢系统方面的疾病。

如果说你认为上述例子是长期使用抗生素的状态,短期使用没事。

那可不一定。短期使用抗生素的影响要看在什么年龄段,怎么使用法。

· 即使短期使用,也可能有长期影响

肠道免疫和微生物群的相互作用会促进代谢、自身免疫、传染病和癌症的发病机制和加重其严重程度。

即使是抗生素短期使用,特别是在生命的头两年,也可能导致肠道微生物的长期变化,从而改变与宿主的相互作用。由抗生素引起的干扰比成年人体内更剧烈,两岁内儿童的微生物群还处于一个低适应性阶段。

肠道微生物群在生命的最初几年发展,影响免疫系统的成熟。儿童期和成年期的抗生素治疗可能导致某些个体长期破坏生态系统,减少细菌多样性,导致群落不稳定,并对宿主生理产生负面影响。

Thiemann S,et al, 2016

而相对健康稳定的肠道微生物群是具有复原力的,也就是说在正常使用抗生素之后,微生物群依然可以恢复形成原来的样子。

抗生素治疗对肠道微生物的整体分类组成表现出快速和令人惊讶的持久性

与幼儿相似,老年人(>65岁)代表了另一个群体,他们可能对抗生素引起的微生物群紊乱更敏感。

· 服用不同类别抗生素菌群变化

每一类抗生素都有不同的性质和排泄系统,导致菌群改变的模式不同。

大环内酯类抗生素现在是世界上最常见的抗生素之一,在儿童和成人中使用。许多患者由于慢性传染病而长期服用大环内酯类药物。

一项涉及142名芬兰儿童的研究显示,儿童食用大环内酯类药物会导致肠道微生物的改变,从而减少放线菌,增加拟杆菌和变形菌。有趣的是,在两岁以内开始服用大环内酯类药物的儿童与肥胖和哮喘患病率的增加之间存在正相关关系。

目前,克拉霉素已成为第一种用于根除幽门螺杆菌的抗生素。瑞典的一个研究小组报告说,根除幽门螺杆菌后放线菌和厚壁菌减少,拟杆菌和变形菌增加。即使根除没有成功,肠道微生物的改变也持续了很长一段时间。

另一组报告了口服万古霉素阿莫西林治疗的比较。万古霉素表现出明显的减少粪便微生物多样性,因为厚壁菌减少和变形菌的增加。阿莫西林也能减少厚壁菌,但与万古霉素相比,这种减少是最小的。

此外,一个法国小组报告了一大批来自营养不良项目的尼日尔儿童。他们比较了安慰剂组和阿莫西林组的体重增加情况。虽然阿莫西林降低了住院疾病转移的风险,但也影响了患者的体重增加。在后面肥胖小节还会详细介绍。

环丙沙星减少厚壁菌和放线菌(特别是双歧杆菌),增加拟杆菌。另一组比较环丙沙星和克林霉素,环丙沙星减少双歧杆菌和克林霉素减少双歧杆菌和乳酸杆菌。然而,克林霉素组的乳酸杆菌没有恢复。

利用小鼠模型,一项研究证实了暂时服用低剂量青霉素环丙沙星引起的微生物群变化的差异。在喂食正常食物的小鼠中,青霉素对肠道菌群的影响大于环丙沙星。此外,青霉素对微生物群的干扰在给药5天后用了5周时间来改善。相比之下,环丙沙星中正常微生物群的恢复速度更快。

肥胖

肥胖已经是全球20多年来最大的健康问题之一,而且它仍在增加。

根据2010年的数据报告显示,在美国,婴儿大量接触处方抗生素。这份报告表明,抗生素在儿童中的使用,特别是在早期生活中,已经变得更加广泛。

· 生命早期服用抗生素影响体重

20世纪50年代,兽医研究人员已经报告说,在食物或水中使用抗生素可以促进哺乳动物家畜的生长。这种生长与抗生素之间没有先前的相关性。四环素,糖肽、大环内酯类和青霉素已在鸡、猪、牛等家畜中使用了70多年,以增加动物的体重。

非常重要的是要提到,抗生素在早期生活中的使用对动物的生长有更大的影响不是在以后的生活中使用。令人惊讶的是,研究人员已经报告说,在20世纪50年代,抗生素的使用与人类体重的增长之间存在着类似的相关性

在20世纪60年代,抗生素的双重作用在小鼠模型中报告了体重增长,小剂量青霉素或土霉素可诱导体重增加,但大剂量相同抗生素可减轻体重在无菌动物模型中使用抗生素并不能促进动物生长,因此假设微生物群的存在对于抗生素治疗下体重的增加或减轻是必不可少的。

·7岁儿童超重或与其婴儿时期服用抗生素有关

特拉桑德等人报道,儿童的体重增加取决于他们早期服用抗生素的时期。在生命的前6 个月内使用抗生素与肥胖有很强的相关性,但如果抗生素在生命的前6个月后使用,这种相关性就会消失。这项研究表明,在生命的6个月前接触抗生素药物的儿童在7岁时超重的风险要高得多。

在美国和加拿大进行的一项开放标签研究显示,6-18岁的儿童与对照组相比,阿奇霉素显著增加了体重增加的风险。虽然人们认为抗生素在早期生活中的暴露与肥胖有很强的相关性,但我们不知道明确的宿主-微生物相互作用,或导致这种表型的必要微生物变化。

· 并不是所有使用抗生素的研究都使体重增加,或与剂量有关

一项关于在英国成人中根除幽门螺杆菌的研究包括以下根除方案:柠檬酸雷尼替丁铋400毫克和克拉霉素500毫克,每日两次,为期两周。这项研究显示,治疗后体重显著增加。阿莫西林对体重增加的影响有两项研究。

如上所述,法国的这项研究没有发现用阿莫西林治疗的尼日尔儿童体重增加的显著差异。在另一项成人心内膜炎的研究中,患者静脉注射万古霉素庆大霉素与阿莫西林庆大霉素治疗6周。观察到万古霉素组体重明显增加,而阿莫西林组体重没有增加

从所有这些研究中,我们可以假设,根据剂量的不同,广谱抗生素的使用与体重改变之间存在正相关关系。

当以治疗剂量使用抗生素时,对体重的影响有相互矛盾的结果。Muphy等人表明万古霉素可减轻高脂饮食的小鼠体重。其他研究表明抗生素治疗与体重减轻或代谢变化改善之间存在相关性。相反,Nobel等人指出,在小鼠生命早期给药治疗剂量的抗生素与体重显著增加有关。

以上,在人类和动物的研究中,有许多报告表明抗生素治疗与体重增加呈正相关。一些研究报告的相互矛盾的结果可能与使用抗生素的类型以及使用抗生素的时间有关。因此,医生应该更仔细地考虑什么时期的生命和他们应该开什么类型的抗生素。

炎症性肠病 IBD

有几个临床观察支持改变的肠道微生物群与炎症性肠病(IBD)的发展和病程密切相关:粪便移植改善了克罗恩病(CD)患者的临床表现。肠内细菌感染可导致IBD的恶化;一组CD患者对抗生素治疗有反应,特别是在术后情况下。

· IBD患者的菌群特征

一开始,“太多”的微生物群似乎是引发IBD的原因;但事实上,IBD的特征是胃肠道微生物群的组成发生了变化。与健康受试者相比,CD、溃疡性结肠炎(UC)和微囊炎患者的微生物菌群多样性较低

IBD患者肠道宏基因组包含的基因比健康的肠道少25%,蛋白组学研究显示,蛋白质和功能途径也同时减少。

可以想象,抗生素引起的失调促进了IBD的发展和延续。实际上,厚壁菌门中的具有保护作用细菌数量在减少,特别是Faecalibacterium prausnitzii Akkermansia muciniphila的减少(这两种菌还能产生短链脂肪酸,丁酸和丙酸,从而支持粘膜屏障的完整性),并伴有粘附性侵袭性大肠杆菌的增加。

根据抗生素暴露可能导致丰度降低和某些菌群丢失,最近发表的一项Meta分析表明,抗生素暴露似乎增加了诊断克罗恩病而不是溃疡性结肠炎的几率

· IBD中抗生素治疗有待进一步研究证实

此外,有一些证据表明,IBD中抗生素治疗的与更严重的疾病过程有关。虽然正常人类微生物组成的短期和长期变化可能影响IBD的易感性和病程,但抗生素引起的失调与IBD的发展之间的因果关系尚未得到证实。

在出现IBD和合并症的情况下,情况会变得更加复杂。肠易激综合征和伴发的原发性硬化性胆管炎(PSC)患者的肠道菌群与单纯的肠易激综合征患者不同。它们显示出Prevotella和Roseburia属减少,几乎完全不存在拟杆菌门,而大肠杆菌显著增加。与PSC中肠漏作为肝脏炎症的驱动因素的作用一致。某些研究中抗生素治疗改善了的生化或组织学活性。然而不知道的是肠道菌群组成的改变还是胆道感染的治疗引起的。

点此查看更多关于炎症性肠病中宿主与菌群的相互作用

胃肠道感染

如前所述,完整的共生菌群通过多种机制(包括竞争营养物质、空间和结合位点)以及间接免疫介导作用和直接抗菌作用入侵病原体,从而保护胃肠道免受感染。

抗生素相关的继发性肠道感染易感性是众所周知的,肠杆菌科包括沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌,对于革兰氏阳性菌,包括艰难梭菌和肠球,特别是厌氧菌,似乎是定植抗性的重要介质。

· 某些菌的保护作用

某些主要来自厚壁菌门和放线菌门的菌,已被鉴定为通过各种直接和间接机制拮抗特定感染

已有研究表明,Ruminococcus obeum菌对霍乱弧菌感染具有保护作用,多形拟杆菌和梭状芽孢杆菌相关的分段丝状细菌对革兰氏阳性菌具有保护作用。值得注意的是,在某些情况下发生肠源性感染时,这些保护性菌群自然扩大,改善了恢复,并提供了防止反复感染的优势

· 抗生素引起的菌群变化促进结肠炎发生

抗生素治疗减少了肠道菌群的多样性和保护性分类群的数量,增加了对新感染的易感性,也产生了抗生素耐药细菌。抗生素引起的肠道微生物群分类和功能多样性的减少为孢子形成、孢子萌发和艰难梭菌毒素的产生提供了最佳条件,从而促进了肠结肠炎的复发。

因此,克林霉素和广谱β-内酰胺会对微生物组造成长期干扰,它们是最容易感染梭状芽胞杆菌相关腹泻的药物,尤其是当梭状芽胞杆菌菌株对致病药物有耐药性时。

结直肠癌

许多研究已经调查了菌群失调与结直肠癌(CRC)的关系。抗生素治疗后某些类群的丰富或丢失可能通过与粘膜免疫细胞和上皮细胞的失调菌群相互作用而导致癌变。

再加上其他危险因素,如遗传易感性、单菌种的慢性定殖,如脆弱拟杆菌可以促进上皮细胞增殖、呼吸内皮应激、DNA损伤,并促进小鼠体内的致癌性微生物群。

然而,考虑到饮食对肠道菌群和CRC的巨大影响,这种假说很难在人类身上得到验证。 当根据饮食模式对个体进行CRC风险分层时,高风险个体显示出产生短链脂肪酸的细菌数量减少,例如抗炎性F. prausnitzii 和 Eubacterium / Roseburia spp.,产次胆汁酸的菌群增加

几个宏基因组研究表明,结直肠癌患者肠道菌群的细菌丰度中拟杆菌、厚壁菌、变形菌减少,而梭状杆菌门富集

· 频繁使用抗生素与CRC风险之间存在关联

这些物种的丰度减少可能是用抗生素后失调的结果。支持这一假设的是,最近的一项病例对照研究表明,频繁使用抗生素与CRC风险之间存在关联。一项包括300多万人在内的队列研究也可以证明,与使用一种或少于一种抗生素处方的人相比,过去3年内使用过6 种或更多抗生素处方的人患癌症的相对风险为1.37(95%CI 1.34-1.40),患CRC的风险为1.15(95%CI 1.04-1.26)。

即使在纠正了诸如生活方式、共患病和联合用药等潜在的混淆因素之后,在另一项研究中也报道了青霉素和CRC重复给药的关联。由于这类队列研究的性质,只能知道关联而不能解决因果关系。可以想象,免疫系统较弱的患者(因为这是恶性疾病的风险之一)更容易发生需要使用抗生素的感染。

这可以解释为什么在其他研究中也描述了恶性肿瘤的风险更高,例如非霍奇金淋巴瘤或乳腺癌,却没有说明抗生素引起的微生物群变化是这些恶性肿瘤的潜在原因。

代谢性肝病

肠道与肝脏之间的在解剖上和功能上密切联系表明,微生物群可以在多个层面上影响肝脏功能,并促进各种慢性肝病和代谢性疾病的发病。

· 菌群失调与肝脏炎症

很长一段时间以来,人们都知道,菌群失调会导致肥胖相关的非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发展。在20世纪80年代,人们发现非酒精性脂肪性肝炎(NASH)在肠道转流后细菌过度生长后发展起来的,但在用甲硝唑进行抗菌治疗后有所改善。有证据表明,与其他因素相结合,失调可能导致门静脉循环中细菌产物的异常积聚,并导致肝脏炎症

· 菌群可能通过不同机制驱动NAFLD

新的研究表明,肥胖的NAFLD患者粪便中的微生物群显示,厚壁菌门尤其在乳杆菌科和毛螺菌科中富集,同时也存在着瘤胃球菌科的缺失。

与没有NASH的肥胖NAFLD患者相比,有肝脏炎症表现的患者仅在变形菌门内表现出显著差异。这些结果表明,肠道微生物群可能通过不同的机制独立地驱动NAFLD的不同方面,如肝脏炎症或肝脏脂肪变性。NASH尤其涉及紊乱的肠道菌群代谢后果。

在NASH患者中观察到的血液中乙醇水平升高是否是肠道微生物群内源性生产的结果仍是一个有争议的问题。一项针对NAFLD与失调菌群组成的系统得出了有关联的结论,但没有因果关系的证据。

· 菌群与疾病的关系中发现使用抗生素的价值

动物模型显示,肠上皮的固有免疫(toll样和NOD样受体)是如何严格调控肠道微生物群,从而控制NAFLD和NASH的进展的。在这些模型中,Revotellaceae卟啉单胞菌科(均来自拟杆菌门)是与肝脏疾病进展相关的丰富物种中的两个,可使用广谱抗生素来消除。

靶向肠道微生物群减轻肝损伤可能是预防炎症性、代谢性和自身免疫性肝病并发症的最有希望的方法之一。

07

结 语

抗生素的发现是现代医学最重要的进展之一。我们看到抗生素在发挥作用的同时,其耐药性的发展将比治疗这些感染的新药物的出现更为迅速,因此需要更好地理解控制抗生素耐药性传播的分子、进化和生态机制。

当然我们也不必恐慌,DNA测序技术和基因组学研究的最新进展使我们能够跟踪抗生素耐药性的演变。有效的疫苗和更快、更敏感的诊断在内的其他策略也有助于减少耐药性的出现。其他也有很多科研成果给我们带来新的希望。

综合微生物群、抗生素和相关疾病之间的双边联系的间接证据,重要的是要认识到,抗生素的影响并不总是对宿主有害,也可能在疾病中提供治疗机会。抗菌疗法可通过长期改变肠道微生物群来调节各种疾病,包括代谢、自身免疫和传染病。


 附录

较为常见的抗生素种类作用

磺 胺 类 药 物

磺胺类药物是一种抑菌、抗代谢物药物,可抑制叶酸的合成。它们是对氨基苯甲酸(PABA)的类似物,是二氢翼状体合成酶的竞争性抑制剂。堵住叶酸的合成,诱导DNA、RNA和蛋白质合成的抑制作用

磺胺类药物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有广谱活性。它们主要用于治疗简单的尿路感染和诺卡氏菌相关感染。磺胺乙酰胺用于局部和眼科细菌感染。

磺胺类药物应用最广泛的是磺胺甲恶唑,由于其在抑制叶酸合成的后续步骤中的协同作用,通常与吡甲恶唑合用。它们是针对易感形式的链球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌抗生素,包括来自社区获得性甲氧西林耐药葡萄球菌的皮肤感染。

此外,磺胺类药物对口腔厌氧菌和一些革兰氏阴性棒(如大肠杆菌和流感嗜血杆菌)具有活性。

青 霉 素

青霉素类的所有成员都是6-氨基戊二烯酸的衍生物,含有β-内酰胺环结构,对抗菌活性至关重要。

青霉素以及其他β-内酰胺类抗生素具有间接杀菌活性。它们抑制肽聚糖在细菌细胞壁中的交联形成,附着在称为青霉素结合蛋白(pbps)的细菌酶上,从而激活细胞壁自溶

青霉素的分类取决于侧链上附加的化学替代物的基础,与青霉素G相比,侧链上附加的化学替代物主要通过向革兰氏阴性菌延伸而导致生物利用度和活性谱的差异。

根据活性谱识别出4个青霉素亚类:

窄谱或天然青霉素,非常窄谱(或耐青霉素酶的青霉素),广谱或氨基青霉素,广谱或抗假性青霉素。窄谱青霉素类包括青霉素V、青霉素G、普鲁卡因青霉素和苄星青霉素。

抗药性的出现一直是开发新型青霉素的主要动力之一。

青霉素的两个最显著的作用可能是治疗风湿热和梅毒。在1945年至1975年期间,仍然是早期梅毒和潜伏梅毒的推荐治疗方法的苄星青霉素G使梅毒的发病率和死亡率下降了近90%。

耐青霉素葡萄球菌的迅速出现促使人们研究药物替代品。在20世纪50年代末,围绕6-氨基青霉烷酸的半合成提出了一类新的抗青霉素酶青霉素:苯唑西林、甲氧西林、氯唑西林和双氯唑西林。

这些抗生素也被称为抗葡萄球菌青霉素,因为它们与青霉素G相比具有窄谱的活性。它们仅用于治疗对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)。重要的是要强调非常窄的活性谱和MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)菌株的迅速出现。

青霉素的大规模扩张是在1940年至1960年期间,Rolison博士在比查姆研究实验室的工作中完成的。目的是鉴定具有抗菌活性的化学结构,扩大活性谱,提高生物利用度和口服吸收。

氨苄西林和阿莫西林是第二代青霉素或广谱青霉素的第一批抗药药。氨苄西林被引入以获得对革兰氏阴性菌更好的覆盖,但很快人们认识到这些微生物的菌株具有可变的敏感性。它们呈现相同的化学结构,但口服阿莫西林后显示出较高的血清浓度。

第二代青霉素对许多细菌都有活性,包括链球菌和葡萄球菌、肠球菌、单核细胞增多性链球菌、梭状芽胞杆菌和炭疽杆菌等非青霉素产生菌。在革兰氏阴性菌中,这些青霉素对流感嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌有活性。

阿莫西林

阿莫西林(1972)被认为是治疗由化脓性链球菌引起的急性中耳炎和上呼吸道感染的首选药物。

阿莫西林在治疗简单的尿路感染时也表现出抗粪肠球菌的活性,但考虑到大肠杆菌和肠杆菌科菌株的高耐药率,阿莫西林并未广泛用于这些病原体。

考虑到与该感染相关的致癌风险,阿莫西林在治疗和根除幽门螺杆菌方面的作用极其重要。最后,阿莫西林被广泛用于治疗孕妇尿道炎和宫颈炎。

氨苄西林仍然是治疗婴幼儿肺炎球菌性肺炎的首选药物,同时也是李斯特菌病的首选药物。

下一代青霉素的代表是羧苄青霉素、替卡西林和哌拉西林。这些广谱抗生素对革兰氏阳性球菌,厌氧菌和革兰氏阴性菌具有活性。 而且,这些药物可抵抗某些生物体的染色体β-内酰胺酶。

哌拉西林-他唑巴坦的组合于1995年推出,由于对革兰氏阳性细菌(包括链球菌和肠球菌)的高活性,因此可能是使用最广泛的组合,但对耐甲氧西林的葡萄球菌无效。

然而,这种组合的主要优点是对革兰氏阴性杆菌特别是铜绿假单胞菌具有活性。

链 霉 素

在整个19世纪,结核病及其所有临床表现代表了年轻人最常见的死亡原因。链霉素是第一种分离的氨基糖苷类药物,也是第一种治疗结核病的抗生素。此外,链霉素为临床研究的发展开辟了道路。

链霉素是一种蛋白质合成抑制剂和杀菌抗生素。它与细菌核糖体30s亚基的小16Sr RNA结合,导致密码子误读和抑制蛋白质合成。

主要用途是治疗分枝杆菌感染,并作为第四种药物与异烟肼,利福平和吡嗪酰胺治疗结核病。

链霉素已被证明在体外和体内对革兰氏阴性微生物具有活性,如布鲁氏菌、肉芽肿性克雷伯菌和肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、蛋白质杆菌属、产气杆菌、特氏杆菌、杜氏嗜血菌、流感嗜血杆菌和鼠疫杆菌等,以及链球菌和粪肠球菌等阳性细菌。

头 孢 菌 素

按时间顺序,头孢菌素是继青霉素之后发现和开发的β-内酰胺类抗生素中的第二类。头孢菌素的化学结构含有β-内酰胺环,和一个含有硫和氮原子的六元环融合。

在美国最常见的处方药和临床依赖抗生素的药物中,这些药物制剂占医院开支的很大一部分。

头孢菌素作为内酰胺类抗生素,主要具有杀菌作用,其主要作用方式是干扰细菌细胞壁的合成

个别头孢菌素的抗菌活性是可变的,受多种因素的影响,包括抗酶降解的能力和穿透细菌细胞壁的能力。

一般来说,头孢菌素在治疗耐青霉素的肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎支原体、艰难梭菌或肺炎衣原体方面历来不是首选抗生素。

与前一代相比,头孢菌素的渐进世代在革兰氏阴性抗菌特性方面表现出渐进性的改善,通常对革兰氏阳性生物体的活性降低。

第一代头孢菌素

在所有头孢菌素中,第一代头孢菌素,如肠外药物头孢霉素和头孢唑林以及口服制剂头孢氨苄对革兰阳性菌、甲氧西林敏感葡萄球菌和非肠道链球菌最为有效。

第二代头孢菌素

第二代半合成衍生物头孢克洛于1979年在美国上市。作为一个整体,第二代头孢菌素对革兰氏阳性菌的疗效较低,而对革兰氏阴性菌(包括流感嗜血杆菌、产气大肠杆菌和某些奈瑟菌)的临床应用效果更高。

值得注意的是,第二代头孢菌素中唯一能跨越血脑屏障的是用于治疗脑膜炎的头孢呋辛

第三代和第四代药剂的活性通常被认为是广谱的,尽管某些成员对革兰氏阳性生物的活性降低,但与第一代和第二代相比,对革兰氏阴性生物的活性进一步提高。第三代头孢菌素可能在治疗医院获得性感染,尤其是社区感染方面具有临床应用价值,尽管越来越多的超广谱β-内酰胺酶降低了这类抗生素的临床应用。

第三代头孢菌素

也能穿透中枢神经系统,使其对肺炎球菌、脑膜炎球菌、流感嗜血杆菌、易感大肠杆菌、克雷伯菌和耐青霉素的淋病奈瑟菌引起的脑膜炎有效。更具体地说,第三代头孢菌素经常是淋病的临床治疗选择。

第四代头孢菌素

包括头孢哌罗、头孢吡肟和头孢克立定,是对肠杆菌属、柠檬酸杆菌属和粘质沙雷氏菌具有增强活性的广谱头孢菌素。同时它与氨基糖苷类药物或氟喹诺酮类药物联合治疗,为严重的铜绿假单胞菌感染也提供了更多的治疗选择。

新一代

进一步开发用于临床的新一代头孢菌素。头孢吡普(2002)和头孢洛林(2005)被认为是第五代头孢菌素,但这一术语仍有争议。头孢吡普和头孢洛林可能不易产生耐药性,从而为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌提供治疗选择。


主要参考文献

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炎症性肠病中宿主与微生物群的相互作用

炎症性肠病(IBD)是一种慢性且易复发的肠道炎症性疾病。全球500多万人受其困扰。

这种疾病是由多种遗传和环境因素共同作用引起的,这些因素改变了肠道的稳态,从而引发了基因易感个体的免疫介导炎症反应。

炎症性肠病包括克罗恩病溃疡性结肠炎

两者异同:

虽然克罗恩病和溃疡性结肠炎的发病机制都涉及肠道炎症,但这两种疾病在几个方面有所不同,包括与特定易感位点的关系、与疾病相关的免疫反应和病理类型。

这两种形式的IBD发病机制的一个关键方面是它们与生活在肠道中的共生微生物的存在有关

寄主共生体参与了许多宿主的生理过程,包括消化和代谢功能、上皮屏障的调节、宿主免疫系统的发育和调节以及对病原体定植的保护。

IBD的一个关键特征是肠道微生物群失调,然而,失调在疾病中的确切作用仍然鲜为人知。

大量共生微生物靠近上皮表面是对粘膜免疫系统的一个独特挑战,因为它必须保持对入侵病原体的免疫反应的能力,同时避免对肠道微生物群产生有害的炎症反应。

这篇文章主要围绕以下几个问题展开讨论:

被称为“粘膜防火墙”的保护机制包含哪几种策略来维持稳态?

IBD相关的基因突变如何破坏粘膜防火墙?

IBD相关的遗传缺陷如何导致病变积累和渗透到肠道组织,从而进一步促进失调和炎症?

如何将微生物群作为IBD的潜在治疗方法?

粘膜防火墙

肠道中大量的共生微生物被单层上皮细胞从宿主组织中分离出来。为了维持其与肠道菌群的稳态关系,宿主已经进化出几种策略来减少微生物与上皮表面的接触,并限制可能引发不必要的炎症反应的渗透共生体的存在。

促进共生体与上皮分离的保护机制

宿主通过几种机制限制潜在有害的微生物接近粘膜表面,包括粘液分泌、抗菌蛋白和免疫球蛋白释放到肠腔。

我们先结合图1来看看大小肠的特点。

大肠中,有两个明显不同的粘液层:

小肠呢,没有像大肠那样清晰的内部粘液层,但它含有大量的Paneth细胞,这是一种特殊的肠道细胞,富含抗菌分子。为响应细菌刺激,Paneth细胞将富含的抗菌分子(包括α-防御素)释放到肠腔中,以限制共生菌的积累。

此外,小肠中的肠上皮细胞(IEC)分泌抗微生物凝集素,例如再生的胰岛衍生蛋白3γ(REG3γ),其在粘液层中积累并进一步促进微生物从宿主中的分离。

【名词小讲堂】

肠上皮细胞(IEC):

· 肠道上皮细胞是体内与外界之间的一个重要的保护屏障。

· 它由不同功能性的肠道干细胞群体共同维持,是具有极性的柱状上皮细胞,参与肠道的消化,吸收,分泌,免疫屏障和应激反应等。

· 粘膜上皮内含有大量的免疫细胞和免疫分子,是机体内最大的免疫组织。

再来看固有层(也就是图1 蓝色部分)

虽然固有层基本不存在急性炎症细胞,但某些嗜中粒细胞可以稳定迁移至肠腔侧,通过多种机制杀死上皮表面附近的细菌,包括诱导氧化猝发。

【名词小讲堂】

氧化猝发(Oxidative burst ):可直接杀死细菌的吞噬细胞迅速产生活性氧。

 图1 粘膜防火墙

图注:杯状细胞分泌糖蛋白,包括粘蛋白2(MUC2),形成粘液屏障,防止肠腔中的微生物与上皮接触。在小肠中,松散形成的粘液层包裹上皮细胞,而在大肠中,内部粘液层基本上没有细菌,粘液共生体仅限于外部粘液层。

位于小肠隐窝的Paneth细胞构成性地表达杀微生物α-防御素。微折叠(M)细胞是一种特殊的上皮细胞,覆盖淋巴组织,如Peyer‘s斑片,便于抗原取样。树突状细胞(DCS)样本抗原在Peyer‘s斑片中由m细胞传递,或可能直接在腔内通过投射穿透上皮层。

分泌性IgA(SIgA)是由位于 Peyer‘s 斑片中的浆细胞产生的,通过转胞分泌穿过上皮进入肠腔。大多数 SIgA 是在 Toll 样受体(TLR)通过微生物抗原参与T细胞和 b 细胞后产生的,并与广泛的肠道微生物低亲和力结合,防止它们在上皮中易位。滤泡辅助(TFH)细胞依赖性反应通过支持高亲和力IgA的产生进一步促进稳态,后者与选择细菌结合。

髓系细胞衍生细胞因子,包括IL-1β、IL-6和IL-23,促进t辅助17(Th17)细胞分化和第3组固有淋巴样细胞(ILC3)的激活。由ILC3S和Th17细胞产生的IL-22通过诱导抗菌肽(AMPS)的表达,包括再生胰岛衍生蛋白3γ(Reg3γ),进一步加强共生体的分离。

il-22还能促进岩藻糖基转移酶2(fut2)介导的上皮性糖聚糖的岩藻糖基化,以支持微生物共生,防止潜在有害细菌的入侵。如果细菌能够克服这些障碍,IL-17刺激的中性粒细胞可以消除根尖上皮表面附近的病理组织或那些已经到达固有层的病理组织。

TH1细胞源性干扰素γ(IFNγ)进一步增强了巨噬细胞和DCs对微生物的杀灭作用。细菌特异性IgG的产生通过结合病理生物促进调理作用来控制全身感染。此外,渗透微生物被肝和脾巨噬细胞中的Kupffer细胞吞噬,以控制系统传播。

接着看下细胞因子IL-22的作用。

细胞因子IL-22还通过作用于上皮细胞介导屏障功能和抗微生物宿主防御,在建立宿主-微生物相互作用中发挥作用。例如,第3组固有淋巴细胞(ILC3s)分泌IL-22是抑制共生细菌所必需的,因为它诱导了抗菌肽的表达,从而阻止了Alcaligenes spp 的全身性传播。

IL-22的天然来源对于控制肠道内分段丝状菌(SFB)的增殖和限制T辅助17(TH17)细胞介导的结肠炎也很重要。

【名词小讲堂】

分段丝状菌(SFB),一种与梭菌有关的细菌,主要居住在小鼠的末端回肠,并促进辅助17细胞的发育。

IL-22还促进上皮聚糖岩藻糖基化,以支持适应岩藻糖作为营养源的共生细菌的生长。IL-22信号传导和岩藻糖基化的中断导致更易感染肠道和结肠炎,部分原因是条件致病菌的过度生长。

免疫系统常见抗体—IgA(有益菌的好伙伴)

IgA也能促进肠道细菌从上皮表面的分离,IgA是由肠道相关淋巴组织中的浆细胞产生。

大量的聚合物IgA在上皮细胞中跨通道进入内腔,其中IgA通过包被细菌和结合微生物抗原及其毒素来维持屏障功能,并塑造微生物的组成。

IgA反应在体内平衡过程中通过T细胞独立和T细胞依赖过程发生。IgA抗体具有典型的多反应性,与微生物脂多糖、DNA和鞭毛抗原结合亲和力低。通过Toll样受体(TLR)参与的微生物感测可以直接刺激IgA的产生,从而提供针对肠道炎症的保护。

【名词小讲堂】

Toll样受体(TLR):

·  TLR是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子,也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。

·  TLR是单个的跨膜非催化性蛋白质,可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。

·  当微生物突破机体的物理屏障,如皮肤、粘膜等时,TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。

此外,T细胞对于MYD88对微生物信号的内在感应对体内IgA稳态反应对预防营养不良和肠病非常重要。

【名词小讲堂】

髓样分化因子(MYD88):是Toll样受体(TLR)信号通路中的一个关键接头分子,在传递上游信息和疾病发生发展中具有重要的作用。 

肠道微生物群中的某些菌在结肠炎期间被IgA包被,当转移到无菌动物时,可增强对结肠炎的易感性,这表明在失调期间优先结合IgA可识别与IBD相关的菌群。

而大多数共生体强烈诱导T细胞独立的IgA结合,“非典型”细菌,如SFB,M. schaedleri,Prevotella spp.Helicobacter sp. flexispira,可以逃避T细胞独立抗体应答,使其非常接近上皮表面,在上皮表面引发抗原依赖性,高亲和性,T细胞依赖性IgA反应。

这些研究表明,IgA可以通过促进有益共生菌的定殖来强化“健康”的微生物群落,但是,一旦在失调的状态下,可能会诱发IgA对潜在致病菌的免疫反应。

防止在粘膜中积聚的保护机制

前面小节提到的:促进共生体与上皮分离的保护机制并不是万无一失的。

考虑到存在于上皮表面附近的大量微生物,并不是所有的微生物都能守规矩,其中一小部分就可以在稳态条件下突破上皮屏障。为了应对这种情况,宿主免疫系统就发展出具有限制粘膜破坏性炎症将渗透性微生物传播至全身组织的策略。

它可以让大量存在于上皮下面的特殊固有层巨噬细胞去杀死细菌共生体,通过多种机制吞噬和杀死渗透微生物,包括产生抗菌分子活性氧

在稳态条件下,这些驻留巨噬细胞在微生物感应方面有缺陷,因此不会引起炎症反应,这是一种通过IL-10刺激介导的调节活动。

肠道微生物也可以被固有层中的树突状细胞(DCs)吞噬并运输到肠系膜淋巴结,在那里,含有树突状细胞的细菌诱导保护性IgA和调节性T(Treg)细胞;这些树突状细胞不能到达全身的二级淋巴结结构,从而限制了它们的全身传播。

【名词小讲堂】

树状突细胞(DCs):

· 也称DC细胞,最早是由加拿大学者Steinman于1973年发现的

· 是功能最强的抗原提呈细胞,因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。

全身部位的控制

尽管前面强调存在坚固的粘膜防火墙,但依然会有非常小部分的肠道微生物可通过静脉门系统或血管系统扩散(图1)。  不过这些微生物到了那之后,肝脏会派出kupffer细胞或脾脏派出的巨噬细胞来把这些偷跑出来的菌吞噬和杀死。

共生菌还可以通过T细胞依赖和T细胞独立机制诱导IgG稳态反应。IgG抗体可以通过识别高度保守的蛋白质(例如murein脂蛋白)来结合多种细菌,包括变形杆菌和相关病原体,以限制细菌从肠道的全身传播。

此外,IgG2b和IgG3等型与IgA结合的共生物种具有相似的反应性,可以在母乳中转移给新生儿;这些母体IgG等型与IgA结合新生儿微生物群,以限制异常的共生特异性T细胞介导的炎症。

在缺乏IgA或MYD88和TIR结构域的动物中,系统性IgG对微生物群的反应增强,这些结构域包含用于TLR介导的细菌感应的干扰素-β(TRIF)信号适配器。

这种增强的IgG反应很可能代表由于适应性降低和渗透性共生细菌被杀死而导致的全身组织中共生菌增加的补偿性适应。

病原体的逃避

肠道病原体已经进化出多种策略来破坏和逃避粘膜防火墙,限制细菌共生体进入粘膜组织。几种病原体,包括肠沙门氏菌、Shigellaflexneri、Yersinia enterocolitica和霍乱弧菌,都会产生粘蛋白降解酶。

此外,肠道病原体已经进化出抵抗机制对抗IECs产生的抗菌蛋白。例如,肠杆菌可表达参与调节抗菌肽抗性的脂多糖修饰的基因,以及参与抗菌肽固存、外排和降解的基因。

同样,Listeria monocytogenes 使肽聚糖中的N-乙酰氨基葡糖残基脱乙酰化,从而逃脱了溶菌酶的溶菌活性,溶菌酶是Paneth细胞产生的一种酶。

与细菌共生体不同,肠道产生毒力蛋白,以逃避吞噬细胞中的溶酶体降解。进入肠细胞后,S. enterica 会破坏液泡膜并逃逸到宿主胞浆中,从而逃避自噬介导的降解,复制并在IECs之间传播。

在中性粒细胞中,S.flexneri 可以通过超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的表达来抑制活性氧介导的杀伤。因此,肠道病原体已经进化出多种机制来逃避粘膜防火墙。也许与IBD更相关的是,在缺乏粘膜防火墙的一个或多个组件的易感宿主中,致病菌就有可能引发疾病。

IBD粘膜防火墙破裂

在上一小节,主要解释了坚固的粘膜防火墙,它是如何来保护宿主,在这一小节我们来看,在IBD患者中这个粘膜防火墙是如何被摧毁的。

减少微生物与上皮细胞表面接触的稳态过程的破坏可能会增加IBD发病的易感性,因为观察到多个IBD易感基因编码蛋白质,它们可以限制细菌共生体进入粘膜或促进细菌杀灭

图2  炎症性肠病粘膜防火墙的破裂

炎症性肠病易感基因的突变会损害宿主用来防止有害微生物进入固有肠板的粘膜策略。

在小肠中,核苷酸结合寡聚结构域2(NOD2)和自噬相关基因(ATG16L1, IRGM, XBP1 and LRRK2)的变异导致Paneth细胞衍生抗菌肽(AMPS)的分泌减少。

肿瘤坏死因子15和IL23R基因多态性可影响第3组固有淋巴样细胞(ILC3s)和T辅助17(Th17)细胞,通过产生IL-22和IL-17从粘膜分离细菌共生体。

克罗恩病相关的吞噬细胞(如巨噬细胞和树突状细胞(DCs)中的NOD2功能丧失突变损害细菌识别。

肠上皮细胞自噬相关基因(ATG16L1, IRGM and NOD2)的突变可能导致细菌清除缺陷。

在大肠中,吞噬体烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸氧化酶复合物(CYBB, CYBA, NCF1, NCF2, NCF4, RAC1, RAC2)组分或调节因子的遗传变异损害了活性氧的氧化爆发和产生,导致吞噬细胞中细菌的杀伤缺陷。

功能丧失突变在IL10R改变肠道免疫稳态,导致失调的T细胞反应。

FUT2,岩藻糖基转移酶2;M,微凝胶;MUC2,粘蛋白2;SIgA,分泌性IgA;TGFβ,转化生长因子β;Treg细胞,调节性T细胞。

从上皮表面分离共生菌

在小鼠中,MUC2(图2左上角)的缺乏会导致粘液层异常,从而促进微生物群与肠上皮表面的紧密接近并导致自发性结肠炎。

在溃疡性结肠炎患者中观察到的共同特征是隐窝深处细菌与上皮紧密接触

岩藻糖基转移酶2(FUT2)中的功能缺失变异,编码一种促进粘膜屏障功能的蛋白质,与克罗恩病易感性增加有关。

NOD2

核苷酸结合寡聚结构域2(NOD2)的遗传变异是第一个与克罗恩病相关的基因变异,也是已知的疾病发展的最强遗传危险因素。但光靠NOD2是不会感染的,它需要辅助条件。

NOD2是一种细胞内受体,能感受肽聚糖衍生的壁酰二肽并诱导对细菌的免疫反应。NOD2在Paneth细胞中表达,可能调节其抗菌功能。然而,Paneth细胞消融或基质金属蛋白酶7(MMP7)缺乏,可将不活跃的前α-防御素转化为杀菌形式,不会导致小鼠自发性炎症。

这表明IBD的发病机制需要额外的遗传缺陷或存在特定的致病菌,而这些致病菌在绝大多数在特定无病原体(SPF)条件下饲养的小鼠微生物群中均未发现。

克罗恩病与基因变异

克罗恩病相关蛋白自噬相关蛋白ATG16L1中的突变也可能通过损害Paneth细胞内分泌颗粒的胞吐作用而导致回肠疾病,这种活动限制了细菌共生菌的渗透。

未折叠蛋白反应(UPR)转录因子X-box结合蛋白1(XBP1)的基因变异与克罗恩病风险增加有关。XBP1特异性上皮缺失导致Paneth细胞内质网应激和结构缺陷。

值得注意的是,IECs中UPR和自噬通路的损伤与自发性克罗恩病(如跨壁回肠炎)有关。

两个克罗恩病易感基因,TNFSF15和IL23R,调节ILC3s和TH17细胞,它们在通过产生IL-17和IL-22抑制共生微生物方面起着至关重要的作用。

然而,还需要进一步的研究来了解这些基因的变异是如何与克罗恩病联系在一起的。

防止粘膜共生积累

利用固有层中的特殊大噬菌体杀灭细菌共生体,在限制黏膜损伤性炎症和防止渗透性微生物传播方面具有关键作用。

在肠道中,NOD2由吞噬细胞、上皮细胞、基质细胞和Paneth细胞表达。

值得注意的是,NOD2缺乏与CYBB(也被称为NOX2)的缺乏——吞噬体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶复合物的一个组成部分,其通过氧化猝发杀死细菌-在小鼠中触发M. schaedleri的增殖和自发性克罗恩病样TH1细胞驱动性结肠炎。

由于克罗恩病相关的NOD2变异体是功能丧失突变,因此吞噬细胞或肠和/或基质细胞内产生的细菌感应减弱可能促进病理生物的管腔累积和粘膜渗透,导致T细胞介导的肠道炎症。

然而,NOD2相关的克罗恩病是否是由人类体内特定病理生物的积累引起的,还需要进一步的研究。

NOD2在自噬中也有作用,自噬是一种介导溶酶体降解细胞内细菌清除的途径。

NOD2将克罗恩病相关蛋白ATG16L1募集到细菌进入部位的质膜上,但克罗恩病相关的NOD2变异体有缺陷的ATG16L1募集和受损的细菌诱导的上皮内自噬。

除ATG16L1外,免疫相关GTPase家族M(IRGM)和富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)也调节自噬途径,这些基因的变化与克罗恩病风险有关。

由于自噬的缺陷损害了细胞内细菌的清除能力,可以想象,自噬相关基因的突变可能导致病理生物在肠道中的渗透和炎症。

在极早发性IBD患者中,细菌感染与IBD易感性之间的联系是一个明显的例子,它与吞噬细胞NADPH氧化酶复合物的组分和调节基因的遗传变异有关。

同样,高达40%的慢性肉芽肿性疾病,由NADPH氧化酶组分的功能突变导致的原发性免疫缺陷病,发展为克罗恩病样结肠炎。

总的来说,这些观察表明,杀死细菌共生体的缺陷促进了克罗恩病的发展。

共生的有益影响

共生细菌通过增强粘膜防火墙来促进保护性免疫,这些防火墙限制了共生体的渗透,同时控制了对微生物的异常T细胞反应。破坏这些相互作用的宿主-共生相互作用可能会促进对IBD患者的失调菌群的不适当免疫反应。

诱导保护性免疫反应

肠道微生物群在调节宿主免疫以建立和维持肠道稳态方面起着至关重要的作用。

图3 共生体的有益作用。

分段丝状细菌(SFB)与肠上皮的粘附会触发血清淀粉样蛋白A(SAA)的释放,后者作用于固有层的树突状细胞(DCs)上,以刺激包括IL-1β和IL-23在内的细胞因子的分泌,并诱导视黄酸受体相关的孤儿受体-γt (RORγt)+ T辅助物17(TH17)细胞分化和第3组先天性淋巴样细胞(ILC3)激活。

由ILC3S分泌的IL-22增强了上皮的SAA产生,以增强Th17细胞介导的粘膜防御,包括抗菌肽(AMP)分泌和中性粒细胞募集。

共生体还通过Toll样受体(TLRs)诱导的B细胞内和T细胞内微生物传感诱导的IgA反应促进肠道稳态。分泌的IgA(SIGA)通过与肠道微生物结合和防止上皮易位而促进屏障功能。

同样,IgG的产生可以通过TLR对B细胞的参与直接发生,而粘液阿克曼菌Akkermansia muciniphila的肠道定植可以通过抗原特异性T滤泡辅助(TFH)细胞反应诱导稳态IgG的产生。此外,IgG有助于穿透上皮屏障的病原体的全身控制(未显示)。

限制不适当的炎症

Treg细胞起源于两种不同的个体遗传谱系:

胸腺来源的Treg(tTreg)细胞

外周来源的Treg(pTreg)细胞

大多数pTreg细胞在共生菌的存在下在胸腺外的结肠中发育,因为在无菌小鼠中,结肠中pTreg细胞的频率明显降低。

Treg细胞通过防止诱导不适当地的T细胞对微生物抗原的反应而在维持组织稳态方面起着至关重要的作用(图4a)

动物:

例如小鼠,缺乏对其调节或功能有重要作用的Treg细胞或因子(包括IL-10、转化生长因子β(TGFβ)和αVβ8整合素)的小鼠会发生自发性结肠炎。

人类:

与动物实验数据一致,IL-10受体突变的幼童会发展成结肠克罗恩病。

此外,FOXP3是Treg细胞发育所需的转录因子,其突变的小鼠和人类都有自身免疫性疾病,包括结肠炎。

图4 调节性T细胞支持肠道稳态

a | 外周来源的调节性T(pTreg)细胞和胸腺来源的Treg(tTreg)细胞抑制肠道异常炎症。Treg细胞产生IL-10和转化生长因子β(TGFβ),以抑制效应T辅助1(TH1)细胞和TH17细胞。另外,髓样细胞如巨噬细胞是IL-10驱动的肠内稳态的重要靶标。

肠道Treg细胞还通过抑制通过细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)介导的或T细胞受体(TCR)介导的抗原呈递细胞(例如树突状细胞(DCs))来抑制效应T细胞反应。自反应性tTreg细胞也可通过与微生物抗原的TCR交叉反应来促进抗原特异性免疫抑制。

b |共生体通过抗原依赖性和非抗原依赖性过程在pTreg细胞的外周培养中起着至关重要的作用。

细菌的巨噬细胞感应导致IL1β刺激的第3组先天淋巴样细胞(ILC3s)分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF),进而增强视黄酸(RA)和IL10的DCs表达,以支持pTreg细胞分化和在结肠中扩散。

此外,除了RA和IL­10外,共生体还可以通过上皮细胞和DC促进TGFβ的表达。脆弱拟杆菌可通过与Treg细胞和DC表达的Toll样受体2(TLR2)结合的多糖A(PSA)增强Treg细胞的活性。

选择细菌种类可以直接诱导pTreg细胞分化;这些pTreg细胞对梭状芽胞杆菌和螺杆菌表达的抗原具有TCR特异性。这表明共生抗原在支持Treg细胞分化中起作用。

短链脂肪酸(SCFAs)是包括梭状芽孢杆菌在内的共生菌产生的发酵副产物,可通过表观遗传修饰或通过增强RA产生的DCs直接促进pTreg细胞群的扩张。

Treg细胞在抑制共生菌免疫反应中的作用也得到了证实,通过Treg细胞的共同转移,CD45RBhiCD4+T细胞转移到淋巴细胞减少小鼠中而引起的微生物依赖性结肠炎被清除。

pTreg细胞缺乏动物粘膜屏障的免疫病理学表明,tTreg细胞足以系统地维持对自身抗原的耐受性,而pTreg细胞在抑制肠道炎症方面具有非冗余的作用。

结肠pTreg细胞深受局部抗原的影响,TCR repertoire 不同于外周淋巴结和脾脏的类似Treg细胞,能够识别梭状芽孢杆菌和拟杆菌属表达的抗原,这进一步支持细菌对肠Treg细胞诱导的重要性(图4b)

IBD中共生关系的破坏

大量的证据表明,微生物群在引发IBD方面起着至关重要的作用。此外,与IBD相关的遗传缺陷与环境因素一起,可以诱导病理离子的积累和渗透到肠道,从而进一步促进肠道菌群失调和炎症反应。

引起IBD的微生物群

尽管没有一种病原体或致病菌被一致认为是IBD的病因,但多方面的证据支持微生物群在驱动肠道炎症中的重要作用。例如,粪便流改道可以减少或消除了回肠克罗恩氏病的炎症。

此外,在回肠切除术后,克罗恩病的复发取决于暴露于肠腔内容物。抗生素治疗可使活动期溃疡性结肠炎和克罗恩病患者病情缓解,并可预防某些克罗恩病患者复发。然而,考虑到这些药物对多种菌群的影响,抗生素研究的解释是困难的。

动物模型进一步支持肠道微生物群在IBD发病机制中的作用。例如,将结肠炎小鼠的粪便微生物群口服到健康动物体内就足以引发疾病。最重要的是,基因易感的小鼠在常规的微生物群的情况患上了结肠炎,但不是在无菌条件下。例如,SPF小鼠,而不是无菌小鼠,TCR基因缺失突变会导致结肠炎。

此外,在无菌的TCR缺陷小鼠中没有观察到结肠炎,这些小鼠被固定在一个确定的共栖群落中,这表明引发疾病需要特定的微生物

IBD患者的菌群失调

对IBD患者体内微生物群的组成进行了广泛的研究。16SrRNA测序分析粪便和粘膜样本显示存在菌群失调,其特征是菌群多样性下降厚壁菌门的某些属的改变和肠杆菌科物种的丰度增加

这些改变在克罗恩病患者中比溃疡性结肠炎患者更为明显。一些研究还显示了拟杆菌属的变化,特别是在克罗恩病患者中。

研究发现,IBD患者与近亲(包括双胞胎)之间的微生物群也存在差异,这表明菌群失调与疾病有关,而不是与遗传因素有关

然而,需要纵向研究来确定是否失调先于炎症的发生。与未治疗的克罗恩病患者在诊断时收集的粪便样本相比,粘膜样本中微生物群的失调更为明显。与溃疡性结肠炎相比,对粘膜样本的研究还显示克罗恩病中潜在有益菌的净损失更大,某些菌群包括克罗恩病中的肠杆菌科和溃疡性结肠炎中的瘤胃球菌属与疾病活动性的相关,以及克罗恩病中某些菌群与肿瘤坏死因子治疗反应的相关。

粪便样本的宏基因组测序显示,克罗恩病患者和非IBD患者之间存在明显的区分,而溃疡性结肠炎患者的差异更显著,总体上有菌群多样性丧失的趋势

这些研究还发现IBD患者粪便中代谢物多样性的丧失与菌群多样性的丧失相当。尽管到目前为止,元基因组学的研究仅限于粪便样本的分析,但由于宿主来源的DNA在粘膜活检样本中含量很高,便于更深入理解IBD中微生物群的功能破坏。

其他微生物——真菌

虽然IBD中的大多数微生物组学研究都集中在细菌对疾病发病的贡献上,但也有一些研究强调了其他微生物在IBD中的重要性。例如,与健康人相比,克罗恩病患者结肠活检样本中真菌菌群多样性增加。同样,克罗恩病患者回肠粘膜标本和粪便标本中的真菌多样性增加,白念珠菌、棒状曲霉菌和新生隐球菌增加。

其他证据证实了IBD中真菌失调的存在,包括与健康受试者相比,酿酒酵母菌比例降低,白色念珠菌增加。值得注意的是,一些研究将真菌菌群多样性的增加与疾病的严重程度联系起来,并认为克罗恩病的环境有利于真菌而损害了细菌,或者抗生素治疗为真菌扩张创造了特定的生态位。

肠道真菌与宿主免疫受体dectin 1相互作用,该信号通过CARD9诱导炎症分子的产生和TH17细胞的反应。CARD9变异与发生IBD的风险增加有关。同样,Card9基因敲除小鼠改变了肠道真菌群落,增加了化学诱导结肠炎的易感性。此外,dectin 1基因的多态性与医学上难治的溃疡性结肠炎有关。

其他微生物——病毒

肠道中也含有大量的病毒,这些病毒可能在IBD的发病机制中起作用。例如,感染小鼠诺如病毒会导致潘氏细胞异常,出现克罗恩病易感基因ATG16L1的突变。

此外,FUT2的遗传变异与诺如病毒感染和克罗恩氏病的易感性有关。 可能与IBD相关的其他病毒是噬菌体。

IBD患者肠道病毒组的宏基因组测序显示,与对照组相比,Caudovirales 噬菌体有表达,这似乎不是继发于细菌菌群的变化;然而,这种扩增是队列特异性的,未在验证队列中得到证实。因此,需要更多的研究来了解真菌和病毒在人类IBD中的作用。

IBD 的前因后果

虽然在IBD早期微生物群的改变可以独立于治疗而发生,但没有直接证据表明生态失调在IBD发病机制中的因果作用。

在小鼠中,化学诱导的结肠炎和肠道感染会引发微生物群组成的强烈变化,其中一些变化与在IBD患者中观察到的变化相当,包括变形菌的增殖。

炎症导致肠腔氧合增加,硝酸盐和宿主电子受体的有效性增加,可驱动肠杆菌科的厌氧呼吸和增殖。

因此,在IBD患者的肠粘膜和肠腔中观察到的许多微生物群变化可能是继发于炎症

在一个自发性克罗恩病的遗传模型中,纵向分析揭示了在结肠炎发病前单一或有限数量的致病菌的种群扩张,这种菌群足以在具有复杂微生物群的小鼠中引发疾病。

根据这些观察,失调可能分为早期和晚期两个阶段进行。

在早期,IBD相关的遗传和环境因素可能导致致病菌的积累,这可能先于临床疾病的发展。

尽管参与早期失调的致病菌的身份和数量尚不清楚,但在IBD动物模型中有限的证据表明,该细菌的遗传和代谢特征可能是重要的。

例如,schaedleri和Helicobacter hepaticus,这两种致病菌可以在遗传易感性小鼠中引发自发性结肠炎,产生毒力因子并生活在上皮附近,尽管这些活性在诱发结肠炎中的作用尚不清楚。当黏膜防火墙受到IBD易感基因突变的影响时,这种细菌特征可能降低局部穿透的阈值(图5)

图5 炎症性肠病中的生态失调

与炎症性肠病相关的遗传缺陷,再加上饮食和抗生素使用等环境因素,可能导致引起疾病的病原体积累和渗透到肠道固有层(早期失调)中,这可能先于临床显性疾病的发展。

炎症可导致细菌类群的更大变化,包括变形菌(晚期失调)的扩张,其途径是增强肠腔氧合,增加炎症肠道环境中的硝酸盐(NO3-)、宿主来源的氧受体和铁的可用性。

这种后期的失调还表现为微生物多样性全面下降,有益的共生体丧失,这可能导致粘膜粘附增加,共生微生物移位,从而引发慢性炎症。

DC,树突状细胞;TH细胞,T辅助细胞;Treg细胞,调节性T细胞;SCFAs,短链脂肪酸。

在晚期失调期间,肠道炎症推动了菌群的进一步变化,包括变形菌的增殖(图5)。鉴于肠道微生物群的不同菌群对宿主免疫系统和肠道屏障有有益的影响,某些菌群的缺失可能导致肠道炎症的加剧或消退。特定细菌的大量繁殖,如粘附性和侵袭性大肠杆菌,积聚在IBD患者的炎症粘膜中,可进一步促进炎症反应(图5)。

粘附性和侵入性大肠杆菌使用常见的1型菌毛粘附素FimH粘附到肠上皮,该粘附素可识别在克罗恩病患者回肠中异常表达的癌胚抗原相关细胞粘附分子6(CEACAM6)。 需要对来自IBD易感性增高的人群和/或IBD患者的黏膜样本进行精心设计的纵向研究,以了解其在疾病复发中的作用。

IBD患者对微生物抗原的适应性免疫应答

IBD患者常检测到T细胞和抗体对微量双抗原的反应增强,进一步证明了微生物群在疾病发病机制中的作用。与健康人相比,IBD患者产生大量抗共生细菌的IgG抗体,并且血清中抗真菌和/或细菌肽和聚糖的活性较高。尽管抗微生物抗体可以作为疾病和诊断的标志物,但这种抗体在IBD中的作用尚不清楚。鉴于健康的小鼠和人类产生了抗细菌共生体的抗体,IBD相关抗体高滴度的存在可能反映了IBD患者的适应性免疫反应增强或肠道内微生物抗原暴露增加。

除了体液反应外,在IBD患者中还观察到T细胞对微生物群的反应失调。早期研究表明,IBD患者炎症粘膜中的T细胞或单核细胞在肠道微生物抗原刺激后,其反应性较正常粘膜中的细胞有所增强。

然而,在IBD患者和健康人的血液和粘膜中都可以检测到CD4+T细胞对细菌共生体的反应。对微生物群有反应的人T细胞主要具有记忆表型,具有不同的TCR Vβ基因库,这与对多种微生物抗原的反应一致。

与人类数据一致的是,在结肠炎动物模型中也可以检测到对共生细菌和细菌抗原有反应的T细胞。CD4+T细胞对共有抗原的反应转移到淋巴细胞减少的动物体内足以引发结肠炎。

一些实验观察结果表明,致病性CD4+TH细胞可以在稳态条件下识别致病生物,而Treg细胞介导的免疫抑制对结肠炎的发展至关重要。然而,Treg细胞作用于效应T细胞抑制细菌引起的肠道炎症的机制尚不清楚。Treg细胞可以以抗原无关的方式抑制效应T细胞和/或通过其TCR作用于抗原提呈细胞以抑制抗原特异性效应T细胞。

针对微生物群进行治疗

目前大多数IBD的治疗方法,包括类固醇和生物药物,如抗肿瘤坏死因子或抗整合素治疗,都能抑制宿主免疫系统,但不直接针对引起或导致炎症的微生物。

鉴于炎症性肠病的治疗在不到50%的患者中可获得完全缓解,针对肠道微生物的治疗方法的发展可能为治疗炎症性肠病提供一种独特的方法。

图6 微生物治疗在炎症性肠病中的作用

鉴于肠道微生物群在炎症性肠病发病机制中的关键作用,针对肠道微生物的治疗方法的发展可能为治疗该疾病提供一种独特的方法。

粪便菌群移植(FMT)

直接有益效果:通过转移细菌衍生的代谢产物和噬菌体或通过恢复有益微生物而产生直接的有益效果。

间接有益效果:通过细菌成分间接产生有益的效果。例如,Toll样受体(TLR)由微生物相关分子模式(MAMPs)触发宿主固有免疫刺激。

抗生素

抗生素可能通过直接杀死致病菌或间接促进有益微生物的种群扩张而产生广泛的作用。

益生菌

使用益生菌制剂,如大肠杆菌Nissle 1917,可导致微球蛋白的分泌,微球蛋白是具有抗菌活性的小多肽,可直接抑制与肠杆菌科密切相关的细菌。

益生元

补充益生元可以促进有益共生菌的种群扩张,从而战胜有害细菌。

其他

合成工程微生物的给药可以通过调节免疫系统(例如通过分泌IL-10)对宿主产生有益作用。

饮食通过促进有益微生物的生长或减少致病微生物的消耗来塑造肠道微生物群的组成。

来自膳食多糖的短链脂肪酸(SCFA)也可以支持肠道调节性T(Treg)细胞群的分化和扩展。

随着对某些微生物的失调和免疫调节功能的进一步了解,研究人员为改善肠道微生物群以预防或改善IBD提出了一些创新的策略。

粪便微生物群移植(FMT)

IBD和反复难辨梭状芽孢杆菌感染的生物学特性:

门级多样性的丧失和肠杆菌科兼性厌氧菌(包括变形菌)的过度生长。因此研究人员想到了纠正微生物群落失衡可能会成为治疗IBD的有效方法。

临床效果

通过恢复肠道微生物群落多样性,粪便微生物群移植(FMT)在解决复发性艰难梭菌感染方面的高成功率增强了微生物群调节疗法的潜力。尽管已经接受FMT治疗的IBD患者数量有限并且对治疗的反应有所不同,但大约30%的溃疡性结肠炎患者已经实现了临床缓解。抗生素预处理和多次粪便输注似乎可以改善FMT在溃疡性结肠炎患者中的有效性。

也有研究人员对此持不同看法。

Rossen等人的一项双盲,随机,安慰剂对照研究未观察到FMT对溃疡性结肠炎患者有任何有益作用,其结果发表在Gastroenterology期刊。

此外,FMT在克罗恩病患者中的有效性仍不清楚,可能是因为目前的研究报告潜在疗效在队列规模上是有限的,并且缺乏安慰剂治疗组。需要进一步的研究,了解更多机制,来制定更有效的治疗方案。

抗生素

随机对照试验的Meta分析显示了抗生素在治疗克罗恩病和溃疡性结肠炎中的益处。

然而,使用抗生素来改变微生物群受到限制,因为在消灭致病菌的同时对有益菌也有影响,这可能带来不良后果。

由于相互矛盾的发现,在IBD治疗中抗生素的使用仍然有限,但使用广谱抗生素混合疗法的研究表明,它们可能重症急性结肠炎和慢性溃疡性结肠炎有效。

在未来,一旦确认了引起IBD的微生物代谢途径,就有可能用新一代抗生素专门针对它们。

益生菌

活微生物可能在几个方面是有利的。

一旦达到稳定的定殖,有益的微生物因子可以持续地传递给宿主,活菌可能会触发有益的免疫反应。通过服用益生菌,包括乳酸菌或双歧杆菌,有针对性地调节微生物群,已经成功地治疗了一些肠道疾病。

此外,在维持溃疡性结肠炎患者病情缓解方面,益生菌大肠杆菌Nissle 1917口服治疗与美沙拉嗪标准治疗具有相似的疗效。益生菌大肠杆菌Nissle 1917能分泌具有抗菌活性的微胞素,抑制可能加剧肠道炎症的竞争性肠杆菌科细菌。

但是,益生菌通常对微生物组的整体组成影响有限,因为这些细菌无法持久地定居健康的成年人。 在某些适应症中,同时补充益生元可以提高外源微生物的移入效率,包括增强对艰难梭菌的定植性。

合成生物学的进展为IBD的治疗和管理提供了创新的方法(如下图6)

给小鼠口服经工程改造以表达和分泌IL-10的乳酸乳球菌,足以保护它免受DSS和IL-10缺乏引起的结肠炎的侵害。

在一小群克罗恩氏病患者中,使用限制胸腺嘧啶的遏制策略安全地生产了重组的产生IL-10的乳酸乳球菌菌株,但仅引起了很小的疾病活动性改善。

由于乳酸杆菌的惰性,这种益生菌也被修饰以表达胰岛素生长因子1、血红素氧合酶1或丝氨酸蛋白酶抑制剂;当给小鼠口服时,这些合成的益生菌可以缓解实验性结肠炎的发展。然而,这些策略在临床试验中并不成功,可能是由于工程乳酸菌菌株不能持续地将IBD患者定殖。

靶向微生物代谢

精确定位有害微生物在失调期间增殖的代谢途径,对于改善小鼠结肠炎是有效的。例如,变形杆菌利用增加的氮源,包括在炎症肠中产生的一氧化氮,大量繁殖。

值得注意的是,靶向钼辅因子依赖的酶,需要使用一氧化氮进行厌氧呼吸,通过减弱肠杆菌科的增殖,包括变形菌,来保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎。因此,开发针对有害菌代谢途径的药物可能为治疗IBD提供一种新的策略。

饮食

饮食在塑造微生物群的组成中起着重要作用,并可通过调节饮食来控制IBD症状。

全肠内营养(EEN)是IBD中为数不多的已被广泛研究的膳食干预措施之一,它是一种营养完整的无固体食物的元素和聚合物配方食品。在克罗恩病的儿科患者中,甚至与皮质类固醇一样有效,但没有与皮质类固醇治疗相关的副作用。

EEN能独立于其他环境因素迅速改变微生物群的组成,有效降低克罗恩病患儿的肠道炎症。EEN诱导克罗恩病缓解的机制尚不清楚,但它可能促进有益微生物的生长或减少致病生物。

在实验性DSS诱导的结肠炎中,一项对各种精制饮食的调查确定了洋车前子纤维的有益作用。而膳食蛋白(包括酪蛋白)的增加,粪便微生物密度的增加以及肠通透性的改变加剧了结肠炎的严重性。

寄主对结肠炎的易感性很大程度上依赖于形成微生物群的特定纤维或蛋白质成分的组合,可见饮食成分在IBD中非常重要。

结 语

在过去的十年里,人们关于微生物群-宿主相互作用以及遗传和免疫系统在IBD中的作用的了解有了大幅提高。然而,对于IBD发病机制的几个方面的认识仍很局限。

一个主要的问题是缺乏对引起易感个体炎症的IBD致病菌的识别。多种致病菌可能引起疾病,这些致病菌可能因患者特定的IBD易感位点而异。因此,利用具有相同或相似遗传缺陷的个体进行研究可能对鉴定这种微生物很重要。

识别引起IBD的微生物对于理解疾病的发病机制,监测患者这些病原体的改变以及合理开发新疗法具有重要意义。

动物模型为研究微生物群和免疫系统在疾病发展中的作用提供了重要的线索。然而,除了少数之外,这些模型并不是基于与人类疾病相关的遗传缺陷,也没有完全概括IBD的病理学。小鼠模型通常使用简化的微生物群,这种简化的微生物群不能反映完整肠道中发生的复杂的微生物-宿主相互作用。

未来,如果能开发出更适合人类IBD的新模型,掌握更多机制,或许能从微生物群的角度(比如说饮食干预)带来更多的治疗甚至是预防措施。

参 考 文 献

Caruso R, Lo B C, Núñez G. Host–microbiota interactions in inflammatory bowel disease[J]. Nature Reviews Immunology, 2020: 1-16.

欧洲拟南芥群落根系微生物群的组装与适应性分化

谷禾健康 原创

拟南芥(Arabidopsis thaliana),又名阿拉伯芥、鼠耳芥、阿拉伯草,是一种原生于欧亚大陆的小型开花植物,为一种模式生物,被广泛地应用于植物遗传学、细胞生物学、分子生物学,以及群体进化学等方面的研究中。据不完全统计,截止到2019年,已经有超过6万篇标题中含有拟南芥的学术论文发表,覆盖了几百个生物学领域,拟南芥中各种生物学过程的研究,都是最细致最深入的。当我们要研究某一课题时,最先想到的问题是“拟南芥中是怎样的”。现在,拟南芥已经成为了植物科学研究的金标准。然而目前,我们对于驱动植物在大陆规模层面的根部微生物变异和适应的因子所知甚少。

近日,一篇发表于《Nature Ecology & Evolution》来自德国科隆马克斯普朗克植物育种研究所关于拟南芥最新研究成果:Root microbiota assembly and adaptive differentiation among European Arabidopsis populations(欧洲拟南芥群落根系微生物群的组装与适应性分化),探索了这一问题。该研究表明土壤和气候条件对根系微生物群落中的细菌和真菌的分化有不同的控制作用,气候是土壤中真菌位点变异和地理分布的关键驱动因素,而土壤细菌的地理分布主要受土壤因素的控制。气候的差异比土壤和本地微生物群的差异更重要。

摘 要

研究人员在3年中监测了欧洲17个地点的拟南芥和禾本科植物中与根系相关的微生物群落。观察到土壤微生物群落具有强大的地理结构,但没有观察到根部微生物群落的地理结构。一些具有系统多样性并地理分布广泛的细菌始终定植在植物根部。细菌的根系微生物群在不同地点之间和不同年份间的群落组成相似性要强于真菌。在瑞典和意大利的两个拟南芥种群之间的交互移植中,排除地理位置效应对土壤微生物群落的影响,测试了它们对根系微生物群变化和植物适应性的贡献。植物根部的群落分化主要是通过真菌的位置和细菌的土壤来源来解释,而宿主基因型的影响较小。观察到两个拟南芥种群之间存在很强的地方适应能力,土壤特性和微生物的差异对于观察到的适应性分化的影响不大。结果表明,在较大的空间尺度上,气候比土壤条件对真菌根系相关微生物群落的变异和植物适应性更重要,而土壤特性是根系细菌群落分化的主要驱动因素。

背景

人们对引起根系微生物群和植物适应性方向在大陆尺度中变化的因素了解甚少。植物的免疫系统、根际沉积物和微生物相互作用是根系相关微生物群有别于周围土壤微生物群的已知决定因素。土壤生物群组成的大规模空间变化与土壤和气候条件的差异有关。特别是当地土壤特性,如pH值主要预测土壤细菌的地理分布,而气候条件更好的预测土壤中真菌的分布。然而,在土壤和气候条件的变化对植物根系微生物群落组成和适应性分化的影响程度方面缺乏系统的实地研究。交互移植已在许多植物物种中表现出局部适应,包括模式植物拟南芥。然而,不同的非生物和生物因素对当地适应的进化和维持的相对重要性知之甚少。在瑞典和意大利,研究了土壤条件和气候对两种海百合种群根系微生物群聚集和适应性分化的影响。

实验设计

1.样本采集

在欧洲选择了17个具有不同土壤特性的地点,在2月-5月间统一发育阶段连续3年采集自然生长的拟南芥,在不影响植物根系的情况下,用手铲将植物与其周围的块状土壤一起收获,转移到7厘米×7厘米的温室花盆中 。并在距离拟南芥生长50cm的范围内采集了三种邻近的禾本科植物,共采集285株植物。而后人工将单株植物与土体分离,分离出4个微生物生态位【土壤(Soil);根际(RS);根际平面(RP);根(Root)】。whole-root是RP和Root的组合。

2.交互移植实验

2016年春季,在两个试验点收集了土壤,并将其储存在6摄氏度下。种子接种于琼脂培养皿中,在6摄氏度黑暗中冷沉积一周后移入生长室(22°C 16h,150μEm−2s−1 PAR,16°C黑暗8h),萌芽9天后,将20株本地苗和22株外地苗移植到每个土壤类型的6个区块的随机位置上,每个点×土壤组合共移植120株本地苗和132株外地苗。移栽过程中,插盘在温室内分别在~18℃和~12°C下白天放置16h,夜间放置8h。在6天内,插盘被运到意大利(IT4)和瑞典(SW4)。移栽苗与源群体中自然萌发的植株处于同一发育阶段。

3.将上述实验分离出的样本提取DNA后对细菌16SrRNA(799F-1192R)V5-V7、细菌16SrRNA(341F-806R)V3-V4、真菌ITS1(ITS1F-ITS2)、真菌ITS2(fITS7-ITS4)和卵菌ITS1(ITS1-O-5.8 s-Rev-O)区域扩增后使用MiSeq测序仪和定制测序引物在内部进行成对末端Illumina测序。得到序列后进行微生物群落组成及差异分析。

主要结果

1. 17个欧洲拟南芥种群中的微生物群落结构。表明根环境促使欧洲各地的细菌群落组成趋同。

a). 欧洲地图,显示了17种拟南芥种群的名称和位置

b). 基于Bray-Curtis相似度的树状图显示了3年中在每个站点中每个采样部位的微生物群落组成,从左至右分别为细菌、真菌、卵菌。采样部位由侧边彩色方块表示(深红色:土壤;灰色:根际(RS);浅绿色:根际平面(RP);深绿色:根)。彩色条形图表示群落组成(纲或目分类水平)。黑色条形图表示微生物的α多样性。从土壤到根内圈,细菌、真菌和卵菌的α多样性逐渐下降,其中细菌的下降幅度大于丝状真核生物。Bray-Curtis距离聚类显示RS与Soil间的细菌群落组成有较高相似性,RP与Root间的细菌群落组成有较高相似性。

c). 4个瑞典土壤样品(SW soils)与其他周围13个土壤样品(versus others),以及根(Root versus)和土壤样品(soil)之间的差异丰度分析(纲或目分类水平)。三角表示差异有统计学意义(Wilcoxon秩和检验,FDR < 0.05)。与周围土壤样品相比,植物根部微生物群落的相对丰度显著增加。

d). 基于从17个地点、4个采样部位和连续三年(2015年、2016年和2017年)采集的样本之间的Bray-Curtis距离的PCoA图。列出了整个拟南芥数据集的微生物群落:细菌(n = 881)、真菌(n = 893)和卵菌(n = 875),并根据不同采样部位进行了颜色编码。空心圆圈表示瑞典样本,实心圆圈表示所有其他样本。揭示了瑞典土壤和其他欧洲土壤之间土壤细菌群落的显著差异。这些差异在相应的根系样本中大大减小,表明植物内圈细菌群落组成趋同。

2.大陆尺度中,少数地理上广泛分布的细菌丰富地定殖在拟南芥的根部,推动了细菌群落组成的趋同。

a).细菌、真菌和卵菌在不同地点(3年的平均值)普遍流行的OTU与植物根部的OTU相对丰度(3年的平均值log2后的值)之间的相关性。蓝色代表地理上受限的OTUs,流行率<20%;橙色代表地理上常见的OTUs,流行率20-80%;红色代表地理上分布广泛的OTUs,>80%。不同的形状提示在第1、2或3年间检测到的与Root相关的OTU。NS表示无统计学意义。观察到在细菌群落中两者间呈正相关。相反,在真菌和卵菌群落中两者没有相关性。

b).a图数据的盒形图展示。描述了不同采样部位之间的显著差异(Kruskal–Wallis with Dunn’s的事后检验, P < 0.01)。地理上分布广泛的细菌OTUs在RP和Root样本中比相应的土壤样本中丰富得多。

c). 根据16S rRNA V5-V7基因片段(细菌)和ITS1区域(真菌和卵菌)构建的地理上分布广泛的Root相关的OTUs的细菌、真菌和卵菌的系统发育树。星号表示,与土壤样本相比,显著富集的与Root相关的OTU。对列出的OTUs中的进行序列变异的检查,发现细菌OTUs中有大量的序列异质性。其中OTU14和OTU5的序列异质性最高。相比之下,真菌和卵菌的OTUs几乎没有序列变异。这意味着一个保守的分类单元的小子集已经进化出在大陆尺度上支配根系细菌菌群的机制,而不考虑周围土壤细菌菌群的主要差异。

d).在拟南芥根部检测到的分布广泛的细菌和真菌的OTUs的比例。展示了相对丰度大于0.1%的OTUs。这些OTUs在root样本中的总体相对丰度显示在每个饼图下面。

3. 少量地理上分布广泛的细菌可以有效地在远亲植物的根系微生物群落中定殖,并随着进化时间的推移与植物根系微生物群落建立稳定的联系。拟南芥和禾本植物之间的群落组成差异较小。

a).基于Bray-Curtis距离的禾本植物和拟南芥的细菌、真菌、卵菌群落的种分类水平的PCoA图。观察到拟南芥和共生牧草在微生物群落组成上的差异较小。

b).细菌、真菌和卵菌的拟南芥根系普遍流行的OTUs和禾本植物根系普遍流行的OTUs之间的斯皮尔曼相关性。在大陆尺度上总体是一致的。

c).共生牧草根系中广泛存在的拟南芥根系OTUs在细菌群落中占总相对丰度45%,但在真菌群落中只占总相对丰度16%。而生长在不同土壤类型中的莲花根系微生物群落中也检测到这些OTUs,所占比例RA表示。

4.大陆尺度中影响拟南芥根系微生物群落的因素。不同地点间环境条件的变化比时间变化对根系相关微生物群落的影响更大

a). 在17个地点、四个采样部位和连续三年(2015年、2016年和2017年)采集的样本之间基于Bray-Curtis距离的PCoA图。从数据集中排除相对丰度 <  0.1%的OTUs。不同地点是影响拟南芥根系微生物群落组成变化的主要因素(Adonis: d.f. = 16; 细菌: R2 = 0.17; P < 0.001; 真菌: R2 = 0.19; P < 0.001; 卵菌: R2 = 0.17; P < 0.001),,但是与土壤样本中观察到的结果相比,这一效应明显降低。(Adonis: d.f. = 16; 细菌: R2 = 0.53; P < 0.001; 真菌: R2 = 0.51; P < 0.001; 卵菌: R2 = 0.27; P < 0.001)

b).采样地点、采样年份和采样地点x采样年份对细菌、真菌、卵菌群落组成的影响。其中,真菌和卵菌群落的年际变化尤为明显。

c). 在每个位置测量的环境变量或共线变量组对细菌、真菌和卵菌群落组成的影响。pH组包括pH、铁、纬度、经度、平均气温和平均相对湿度。硼组包括硼、有效钙和储备钙三个因子。P组包括有效P因子和储备P因子,NO3组包括有效NO3因子、有效Mg因子和储备Mg因子。K组包括有效K因子和储备K因子,显著统计意义用深色突出表现。两种土壤在有效钙、储备钾、有效镁、pH、铁和速效钾方面的差异是最大的。(c1图为描述了18个环境变量之间共线性的热图。定义了两个唯一变量(锰(Manganese)、铜(Copper))和五组共线变量(K组、P组、Boron组、NO3组、pH组)。土壤、RS和RP细菌群落组成的主要驱动因素是pH和/或与pH密切相关的环境变量,如铁、平均气温和平均相对湿度。细菌群落与环境变量的相关性比真菌更强。

5. 土壤、气候和基因型的差异驱动了拟南芥种群间根系微生物群落的分化;与细菌相比,气候条件等特定位置因素对根相关真菌群落分化的影响更大。土壤条件的差异对拟南芥种群间的适应性分化贡献较小

a).交互移植示意图。来自IT1和SW4地点的土壤和植株基因型在这两个地点(8个不同处理组合)相互移植。

b). 根据Bray-Curtis距离用PCoA法测定了细菌、真菌和卵菌的土壤和全部根系微生物群落结构。与细菌相比,土壤来源的真菌和卵菌的解释变异百分比(PCoA1)较弱。土壤中微生物真核组合的位点间变异主要是由地理位置决定的。在whole-root组中,位置的影响与土壤对真菌的影响一样强,比土壤对卵菌的影响更强

c). 在IT1和SW4的土壤中相互种植,并在IT1和SW4的地点生长的两者基因型的整体适合度。红色表示IT1,蓝色表示SW4。圆形表示IT1土壤,三角形表示SW4土壤。填充符号表示在IT1生长,未填充符号表示在SW4生长。在IT1位点,本地基因型的相对适合度高于外地土壤。两种土壤在有效钙、储备钾、有效镁、pH、铁和速效钾方面的差异是最大的。在SW4地点,没有一株意大利植物幸存下来繁殖。较强的本地优势是较高的存活率和繁殖力共同作用的结果。

结论

土壤和气候条件对根系微生物群落中的细菌和真菌的分化有不同的控制作用,气候是土壤中真菌位点变异和地理分布的关键驱动因素,而土壤细菌的地理分布主要受土壤因素的控制。气候的差异比土壤和本地微生物群的差异更重要,因为这两个研究种群之间存在适应性差异。研究人员认为未来的研究应该确定在大空间尺度上影响根系微生物群组装和适应性分化的环境因子是否与在较小地理尺度上作用的环境因子不同。

拟杆菌预防肺炎克雷伯菌定殖和传播

谷禾健康 原创

微生物群是免疫防御的原动力,但是防止感染的特定共生微生物的特性尚不清楚。相对的,病原体如何与其他微生物群落竞争以建立其宿主生态位也鲜为人知。

鉴定对病原体有保护作用的微生物群成员可以提供一种治疗对当前抗菌治疗有耐药性的感染的替代方法。

在这些抗药性微生物中,肠杆菌科是最大的临床问题。而肠杆菌科中的肺炎克雷伯菌对人类健康构成最紧迫的威胁,因为许多菌株对多种抗生素耐药,毒性很强,在成人和婴儿中都会引起疾病,并且很容易在宿主之间传播。

因此,预防肺炎克雷伯菌的定殖和传播显得至关重要。

近日, 国际顶级微生物学期刊《Nature microbiology》发表了由英国伦敦帝国理工学院传染病系分子细菌学与感染中心和外科与癌症系综合系统医学与消化疾病科合作研究最新成果:“Commensal Bacteroidetes protect against Klebsiella pneumoniae colonization and transmission through IL-36 signalling(共生拟杆菌通过IL-36信号预防肺炎克雷伯菌定植和传播)”。

该研究从机制上提供了一种视角,何时,何地,拟杆菌如何对抗肺炎克雷伯氏菌的定植和传染,深入了解如何利用这些保护性微生物来提供人群级别的预防肺炎克雷伯氏菌感染的保护。

 论文主要内容 

肺炎克雷伯氏菌在人群宿主中有两个主要的定植渠道:上呼吸道和肠道。肺炎克雷伯菌建立定植必须与这两个位置的微生物群和免疫系统建立的防御系统抗衡。

该研究发现,成熟的微生物群推动了不同免疫防御程序的发展,从而在上呼吸道和肠道限制肺炎克雷伯氏菌在这些生态位内的定植。

肠道免疫保护取决于拟杆菌、白细胞介素IL-36信号和巨噬细胞的发育。拟杆菌的这种作用需要其保守的共生定植因子的多糖利用位点。相反,在上呼吸道,变形菌门通过IL-17A增强免疫力,但是肺炎克雷伯氏菌通过包囊IL-17A来克服这些防御进而有效定植。

最终发现肺炎克雷伯氏菌的宿主间传播主要发生在其肠道贮存器中,而产生共生定植因子的拟杆菌足以通过IL-36阻止宿主之间的传播

首先我们先来看看,肺炎克雷伯菌这种菌在人群中的分布情况究竟是怎样的?

我们从谷禾健康2019年近期检测人群肠道菌群样本抽取1.3万例样本,人群共计13358人,涵盖0~103岁人群。

其中肺炎克雷伯氏菌丰度占比超过1%的人群有3765例,占比28.2%。

预 告

本文后面【交流探讨】章节会结合该论文的观点,对我们谷禾健康目前已测的人群数据进行整理分析。

论文主要结果

成人微生物群的发育可防止耐药肺炎克雷伯菌在肠道而不是上呼吸道定植。

由于肺炎克雷伯菌在婴儿和成人中引起疾病,研究人员希望研究在整个生命过程中微生物群介导的对肺炎克雷伯菌定植的防御能力的发展。为此,耗尽了新生和成年小鼠中的微生物群。

为了研究肺炎克雷伯菌在上呼吸道的定殖作用,研究人员使用了一个小的接种量,并且没有麻醉小鼠进行鼻内接种。这种方法意味着细菌保留在鼻腔和鼻咽,并不会到达肺。

在新生小鼠中,肺炎克雷伯菌可能在上呼吸道和肠道都定居,这不受微生物群耗竭的影响(图1a–c)。同样,在成年上呼吸道中,对照动物和消耗微生物的动物中肺炎克雷伯菌的定殖水平相似(图1d–f)。相比之下,在成年肠道中,肺炎克雷伯菌只有在微生物群枯竭后才能建立可检测的定植(图1g–j)。

持续的广谱抗生素治疗(图1g-j)或临床上相关的短期抗生素治疗方案,消除了微生物群介导的防御。将成年菌群而非新生儿菌群转移至新生小鼠,以保护其免受肺炎克雷伯菌的肠道定殖(图1k–m)。

图1:成年微生物菌群可抵抗抗生素抗性肺炎克雷伯菌在肠中的定植,但不能防止上呼吸道定植。

上呼吸道定植数据显示为红色,肠道定植数据显示为蓝色。所有统计比较均使用Mann-Whitney(双尾)进行;水平线表示中值;ND,未检出(肺炎克雷伯菌的检出限在粪便中= 10 3  cfu g -1)。

成人肠道菌群具有广泛的保护性,可通过临床分离株产生肺炎克雷伯菌,产生OXA-48碳青霉烯酶(图1g),流行性肺炎克雷伯菌 ST258(图1l)和近缘拟肺炎克雷伯菌亚种(图1j)。

在任一生态位定居期间均未观察到体重减轻,支持我们正在对无症状定殖进行建模的概念。这些数据表明,成年菌群的发育产生了足以阻断肺炎克雷伯菌在肠道内而不是上呼吸道定居的屏障

这就提出了三个问题:

(1)成人肠道菌群中的哪些菌阻止肺炎克雷伯菌的定殖,其机制是什么

(2)哪些因素可使肺炎克雷伯菌成功与上呼吸道菌群竞争,从而定居于这一生态位

(3)在不同的粘膜贮库中,微生物群和肺炎克雷伯菌之间的竞争如何影响这种传染性病原体在宿主之间的传播

下文将围绕这3个问题展开实验与探讨。

拟杆菌的形成阻止了肺炎克雷伯菌的肠道定殖。

为了回答第一个问题,成人肠道菌群中的哪些菌阻止肺炎克雷伯菌的定殖,其机制是什么?

研究人员对新生小鼠和成年小鼠肠道菌群进行了测序,以确定这些允许和抑制微生物群落的各自组成。新生小鼠肠道菌群主要是来自厚壁菌门,尤其是乳杆菌科的成员(图2a,b)。相比之下,成年小鼠肠道菌群主要由拟杆菌门(拟杆菌门)和厚壁菌(梭状芽胞杆菌和乳杆菌)的共生菌组成,而放线菌门和变形菌门只占共生菌的一小部分(图2a,b)。

研究人员发现只有拟杆菌能促进肺炎克雷伯菌从肠道的清除,无论是在肺炎克雷伯菌定植之前还是之后(Fig. 2c–k)。拟杆菌在抗生素治疗(图2d-f,i,j)和无菌小鼠(图2g)中都具有保护作用,这与使用不同成分的共生体一致。

证实施用代表性的共生菌群的小鼠的肠道菌群由该菌群占主导地位,并且每个菌群的定植水平相似。

图 非抗生素处理、抗生素处理和共生联合体接种小鼠粪便中的细菌负荷和组成

此外,还发现拟杆菌属特别保护新生小鼠免受肺炎克雷伯菌的肠道定植(图2k),这支持了这种共生体的发展可以保护成年小鼠免受肺炎克雷伯菌的侵害。

图2:肠内的拟杆菌属可以预防肺炎克雷伯菌的定殖。

所有的统计比较都是用Kruskal-Wallis检验和Dunn对多重比较的修正进行的。水平线表示中值。

产生共生定殖因子(CCF)的拟杆菌属通过IL-36和巨噬细胞加强肠道免疫屏障,以防止肺炎克雷伯菌肠道定殖。

接下来,研究人员想确定拟杆菌的保护作用是否需要宿主免疫。因此,在肺炎克雷伯氏菌定植之前,将微生物群转移到施用了免疫抑制性地塞米松或媒介物对照的微生物群缺失小鼠中。地塞米松消除了微生物群对肺炎克雷伯菌定殖的抑制作用(参见图3a,b),表明该保护作用需要免疫信号。

此外,研究人员发现地塞米松对未经抗生素治疗的小鼠的治疗,使这些正常耐药的小鼠容易被肺炎克雷伯氏菌定殖。同样,拟杆菌属赋予的保护作用需要免疫信号传导。

为了确保地塞米松对免疫系统起作用而不是破坏微生物群,研究人员将微生物群从地塞米松或媒介物对照治疗的小鼠转移至微生物群枯竭的小鼠,然后研究了对肺炎克雷伯菌定植的抑制作用。这两个微生物群均提供了针对肺炎克雷伯菌定殖的同等保护作用。由此证明地塞米松不能消除微生物菌群的保护性优势,而是抑制微生物菌群对免疫系统的刺激作用。

然后,研究人员试图确定将拟杆菌属的作用转化为对肺炎克雷伯菌定植的抗性的免疫因子。在肠道中,从新生小鼠到成年的转变以许多细胞因子的稳态表达增加为标志,这些因子对维持宿主与微生物的动态平衡很重要。

为了确定拟杆菌的保护作用是否受这些细胞因子的驱动,他们取消了细胞因子的信号传导,该信号的稳定表达从新生小鼠到成年小鼠均以微生物群依赖性方式增加。

图3 拟杆菌通过IL-36信号和巨噬细胞保护肺炎克雷伯菌在肠道的定植。

水平线表示中值,误差线为s.d.

用针对IL-36受体(IL-36R)信号的抗体治疗,但不针对IL-17A或干扰素(IFN)-γ的抗体治疗后,拟杆菌属对肺炎克雷伯菌的肠道菌落保护被取消(图3a-e)。支持IL-36的作用,重组IL-36γ处理可促进肠道肺炎克雷伯菌的清除(图3f–h),而微生物群落衰竭的动物中肠道IL-36γ的产生可通过拟杆菌特异恢复(图3i)

利用脂质体氯膦酸盐处理耗尽这些细胞来研究它们对肺炎克雷伯菌的保护作用。巨噬细胞耗竭后,拟杆菌不能预防肺炎克雷伯菌或调节IL-36γ(图3j–m)。相反,嗜中性粒细胞耗尽后,拟杆菌仍具有保护作用。

图 变形菌在定植过程中恢复了上气道的稳态IL-17A生成和肺炎克雷伯菌诱导的上气道TNF生成

此外,在用氯膦酸盐处理的小鼠中,IL-36R信号的破坏不会增加肺炎克雷伯菌的定殖,这表明IL-36和巨噬细胞沿一条共同途径起作用(图3n)。

为了了解IL-36如何通过巨噬细胞控制肠道中的肺炎克雷伯菌水平,研究人员调查了IL-36是否促进了这些细胞的杀菌活性。然后发现IL-36γ刺激促进巨噬细胞杀死肺炎克雷伯菌的多种菌株。

接下来,研究人员想了解抗肺炎克雷伯菌定殖所需的拟杆菌属中的因素。调节肠道免疫力的常见方法是与宿主粘膜紧密接触以发挥其作用。拟杆菌内高度保守的是荚膜多糖产生位点CCFs,这促进了拟杆菌与肠黏膜的关联。

图4 拟杆菌需要它们的ccf来防止肺炎克雷伯菌在肠内的定植。

研究人员测试了假单胞菌抑制肺炎克雷伯菌定植所需的CCF的假设。与此一致,具有完整的CCF系统的拟杆菌属或单个拟杆菌属物种可以预防肺炎克雷伯菌的细菌定植和主要肠道IL-36γ的产生,但是在没有CCF的情况下会消失,并且可以通过CCF的互补来重新建立(图4a–g)。

与设想的在粘膜定植中的作用相一致,发现CCF促进了拟杆菌与粘膜的缔合(图4h),但是在存在或不存在CCF的情况下,粪便中的拟杆菌水平是相等的(图4i)。

以上,数据支持这样一个模型,其中产生细菌CCF的拟杆菌属成员与粘膜屏障结合,在肠内形成免疫屏障,从而防止肺炎克雷伯菌通过IL-36和巨噬细胞定居。

成人微生物群通过IL-17A引发上呼吸道防御,但包囊可使肺炎克雷伯菌克服该障碍而建立定植。

接着回答第二个问题:哪些因素可使肺炎克雷伯菌成功与上呼吸道菌群竞争,从而定居于这一生态位?

为此,研究人员检查了肺炎克雷伯菌包封的作用。传统上,包囊被视为一种毒性决定因素。然而,荚膜多糖的产生是常见的病原体和非病原体。特别是在上呼吸道中。

在具有微生物群的成年小鼠中,我们发现包封的肺炎克雷伯菌定植上呼吸道水平高于等基因的未包封的肺炎克雷伯氏菌突变体,并且,通过未封装的突变体的互补,恢复了抵抗微生物群介导的防御的能力(图5a,b)。

包囊化的这种优势在微生物群落缺乏的动物中消失了,在这些动物中,包囊化和未包囊化的肺炎克雷伯菌定殖到相似的水平(图5a,b)。

图5 变形菌通过IL-17A启动上呼吸道防御,但包封可以使肺炎克雷伯菌克服这些防御。

下一步,研究人员确定包封是否允许肺炎克雷伯菌抵抗上呼吸道内的直接微生物竞争,或通过免疫系统间接影响微生物群。为了解决这一问题,他们将微生物群转移回经地塞米松或载体控制治疗的微生物群衰竭的动物,然后再经鼻腔给药肺炎克雷伯菌。

微生物群转移减少未包封肺炎克雷伯菌在载体对照中的上呼吸道定植,但地塞米松治疗的动物却没有,这支持了微生物群通过免疫信号增强上呼吸道防御的观点。与此相符的是,在微生物群落衰竭的动物中,肺炎克雷伯氏菌在上呼吸道定植期间诱导的先天细胞因子产生(肿瘤坏死因子-α)减少,并通过免疫信号通过微生物群转移而恢复。

图 微生物群启动上呼吸道免疫,但封装使肺炎克雷伯菌克服这些防御

研究人员确认,微生物群转移后上呼吸道共生细菌的水平在媒介物和地塞米松治疗的小鼠之间是相同的,且微生物群的转移没有导致共生接种到肺中。

与肠道类似,上呼吸道的微生物防御启动是成年动物所特有的,因为封装和未封装的肺炎克雷伯菌都将新生的上呼吸道定居到相似的水平,并在缺乏微生物群和对照的动物中引起了同等的先天细胞因子反应。

从新生到成年的转变伴随着依赖于微生物群的上呼吸道多种细胞因子稳态表达的增加,因此,研究人员取消了这些细胞因子的信号传导,以了解成年微生物群是否需要它们才能在上呼吸道发挥其免疫调节作用。

IL-17A的破坏,而不是IFN-γ或IL-36R信号的破坏,抑制了微生物群介导的未包囊但未包囊的肺炎克雷伯菌从上呼吸道的清除(图5c–f)。

此外,用重组IL-17A处理足以促进未包封的肺炎克雷伯菌的清除(图5g,h)。小鼠上呼吸道菌群包括的菌来自放线菌门,拟杆菌,厚壁菌门和变形菌。

在这些共生体中,发现变形菌通过IL-17A信号(图5i-l)特异性地增强了抗生素治疗和无菌小鼠上呼吸道对未包被肺炎克雷伯菌的清除。变形菌还恢复了上呼吸道的稳态IL-17A生成和肺炎克雷伯菌定植诱导的细胞因子生成。

研究人员证实,给代表性共生体注射的小鼠上呼吸道微生物群主要由该共生体控制,并且每个共生体的定殖情况相似。

这些数据支持一种模型,通过该模型,变形菌可以在成年上呼吸道引发IL-17A依赖性免疫防御程序。但是,包囊可以使肺炎克雷伯菌经受住这些防御,从而成功地建立定植。

肠道拟杆菌可防止肺炎克雷伯菌通过IL-36传播,这需要拟杆菌CCF。

然后回答第三个问题:在不同的粘膜贮库中,微生物群和肺炎克雷伯菌之间的竞争如何影响这种传染性病原体在宿主之间的传播?

为了了解防止肺炎克雷伯菌在肠道定植的成人微生物群的发育如何影响传播,研究人员采取以下措施:

首先,将已建立肠道肺炎克雷伯菌定殖的成年小鼠与抗生素治疗或非抗生素治疗的小鼠接触,共同饲养。抗生素治疗的成年接触小鼠都获得了肺炎克雷伯菌,但对未经抗生素治疗的成年接触小鼠的传播有限。

研究人员再次确认从成年接触小鼠分离出的肺炎克雷伯菌的抗生素耐药谱与接种到索引小鼠中的肺炎克雷伯菌的抗生素耐药谱相匹配,确认从接触小鼠分离出的肺炎克雷伯菌来自索引动物。

图 接触小鼠肺炎克雷伯菌的耐药谱与对照小鼠肺炎克雷伯菌的耐药谱一致

其次,在共寄居之前,将保护性拟杆菌属共接种到肺炎克雷伯菌定殖的新生指数小鼠和幼稚的新生接触小鼠中。这足以阻止宿主之间的肺炎克雷伯菌传播。为了检查传播是否需要与动物直接接触,将成年接触者关在先前装有肠道定殖的索引小鼠的笼子中。尽管在饲养前已从笼子中取出所有的索引小鼠和粪便材料,但所有接触的小鼠都被肺炎克雷伯菌定殖,这表明传播不需要动物之间或同食性的直接接触。

第三,在共寄居之前,将保护性的拟杆菌共生体口服到肺炎克雷伯菌定植的成年指数小鼠和未经抗生素处理的成年接触小鼠体内。发现拟杆菌特异性足以阻断肺炎克雷伯菌在宿主间的传播。在IL-36信号的破坏或没有CCF的情况下,拟杆菌的抑制作用丧失了。

综上所述,这些数据表明拟杆菌对肺炎克雷伯菌定植的保护作用限制了其在人群中的传播。研究人员质疑拟杆菌对肺炎克雷伯菌传播的抑制作用是否是由于拟杆菌减少了从指数动物身上脱落的肺炎克雷伯菌,或是在接触动物身上建立了针对肺炎克雷伯菌的保护屏障。

为了回答这个问题,拟杆菌只给肺炎克雷伯菌定植的索引小鼠或单纯接触者。发现,这两种方法都减少了肺炎克雷伯菌的传播,但将拟杆菌引入接触者比将拟杆菌引入索引小鼠的效果更为有效,证明拟杆菌控制传播的关键点是加强免疫屏障以防止肺炎克雷伯菌在新宿主中的建立。总之,数据显示,产生CCF的拟杆菌抑制了肺炎克雷伯菌在人群中的传播。

该文章最后提到,个体内的微生物群失调不仅会促进肺炎克雷伯菌在宿主体内的定植,而且会促进其向其他宿主的传播。因此,拟杆菌群可以通过防止肺炎克雷伯菌在宿主之间的传播提供人群级别的保护,这是控制传染病的最终手段。

交流探讨

在本文开头部分,我们已经看到从谷禾健康2019年样本中抽取样本的实际分布情况:

其中肺炎克雷伯氏菌丰度占比超过1%的人群有3765例,占比28.2%

为了解感染携带肺炎克雷伯氏菌的人群和不携带人群的菌群构成,尤其是论文中拟杆菌对于肺炎克雷伯氏菌感染的防控作用在真实人类群体中的情况,我们将根据肺炎克雷伯氏菌的占比丰度分为两类人群。

其中肺炎克雷伯氏菌占比丰度5~50%的人群作为肠道感染携带者(1629例),占比<1%的人群(9593例)作为对照。

提取拟杆菌门和厚壁菌门的比例进行比较,结果如下:

肺炎克雷伯氏菌肠道感染人群菌群构成

可以看到两组人群的拟杆菌门的丰度水平确实存在差异,未感染人群的拟杆菌门比例相对更高,统计检验是极显著。

论文的研究发现在人类群体中应该存在一定的作用,但是感染人群其拟杆菌并不是极低。

进一步使用MaAslin2进行检验肺炎克雷伯氏菌与其他菌属,结果如下:

发现和预期的不太一样,拟杆菌与肺炎克雷伯菌的丰度水平之间显示是正相关,唾液乳杆菌和栖粪杆菌与其是显著负相关,另外其他病原菌与其负相关。

结语

总之,论文的研究发现在人类群体中应该存在一定的作用,但是大样本人群肠道菌群检测结果分析表明单纯的拟杆菌存在并不能完全抵御肺炎克雷伯氏菌的定植和传播。

参 考 文 献

Sequeira, R.P., McDonald, J.A.K., Marchesi, J.R. et al. Commensal Bacteroidetes protect against Klebsiella pneumoniae colonization and transmission through IL-36 signalling. Nat Microbiol (2020) 

饮食习惯与疾病风险

我们都知道饮食对人体健康的重要性,不太合理的饮食与很多疾病相关,也包括癌症。

在过去的十年里,人们都在寻找预防癌症的饮食指南,使得饮食模式和癌症领域的迅速扩展。

多个系统回顾和Meta 分析了特定癌症类型与数据驱动饮食模式之间的流行病学关联,这些饮食模式是由实证分析决定的,研究者根据预先确定的一组饮食成分确定的饮食指标。

不同饮食模式的建议在降低风险方面的有效性,可能取决于癌症的类型或其他风险因素,如家族史、性别、年龄和其他生活方式因素或共病,以及新陈代谢特征或肠道菌群特征。

饮食是多种癌症的一个公认的危险因素。

对个别营养素或植物化学物质的研究可以揭示某些饮食因素与癌症风险之间的联系。

然而,个别的饮食成分相互关联和相互作用进而影响身体健康和疾病发生。

对饮食作为一个整体的检查,就像在饮食模式研究中所做的那样,可以产生更强的效果估计和结果,可以更容易地转化为饮食指南。

在早期的饮食模式研究中,在流行病学研究中很少观察到与癌症有实质性的联系。特别是,在1995年美国人的饮食指南的早期研究中,旨在反映美国人的饮食指南的健康饮食指数与癌症风险无关。

然而,随着美国人的饮食指南的进化和随后在健康饮食指数中包含更具体的指导,逐渐观察到例如癌症死亡率的更强的流行病学关联。制定了多种其他饮食模式和指标,以反映其他国家或组织的饮食指南,或专门关注慢性疾病预防指南。

以下内容主要总结了在过去5年中发表的有关饮食模式和癌症风险的流行病学文献。

膳食结构分析

在看后面的内容之前,我们需要在本章节先了解一下关于膳食模式的分析法,以及各类名词的定义,以便于更好地理解后面的内容。

膳食模式或指标的表征取决于对食物、饮料或营养摄入的了解,或这些因素的某些组合(例如,健康饮食指数和膳食炎症指数(DⅡ),从自我报告或谈话者使用的调查表或膳食召回或记录获得。

一般来说,饮食模式分析分为两大类,一类是根据经验确定的,另一类是根据研究者定义的标准。

后验饮食模式由研究人群中的数据驱动,并使用统计技术确定,而先验饮食模式是根据一组预定义的标准来构建的,以在特定人群的数据收集之前或独立于数据收集之前测量对特定饮食方式的依从性。

先验饮食模式或指数包括各种成分,可使用简单的二元方法对其进行评分,以满足(1)或不满足(0)指南(如地中海饮食评分(MDS))或更复杂的算法,其中考虑了基于文献的加权效应大小(如DII)。

表1 关于各种先验饮食模式和指标及其相应组成部分

一般认为,先验饮食模式比后验饮食模式更容易在不同研究和人群之间进行比较,因为成分是预先确定的,而不是从研究人群分布中得出的。然而,先验方法在膳食成分的数量、FFQ中包含的与成分相关的食品和饮料的数量以及用于描述依从性的阈值(临界点)的研究之间可能有很大的不同。例如,MDS中使用的临界点基于特定人群的中位数摄入量,因此,尽管MDS被认为是一个先验指标,因为组成部分是预先确定的,但得分取决于所研究的人群;然而,其他具有固定切点的得分可能允许在人群之间进行更稳健的比较。

名 词 预 习

后验饮食模式

各种病例对照和队列研究报告称,后验饮食模式与各种癌症风险的增加或降低有关,一些研究报告称,没有一致的风险关联。具体看看各种饮食模式对应什么疾病的风险。

后验饮食模式与癌症风险

由上图可以发现,西方饮食模式与结直肠癌风险增加相关。而乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌的证据往往因研究设计的不同而有所不同。病例对照研究报告显示正相关,但队列研究报告没有一致的相关性。

另外,谨慎或健康的饮食模式与患乳腺癌、结直肠癌与肺癌风险降低相关,而胰腺和前列腺疾病的相关性要么在研究设计上不一致,要么仅限于病例对照研究。

饮酒模式与乳腺癌、结直肠癌、胰脏癌和食道癌的风险增加有关。

雷达图可以直观地显示西方和审慎饮食模式研究中所包含的每个食物组的主要成分和相应的因子负荷。

主成分分析雷达图

西方饮食模式(PCA1;红色);

谨慎饮食模式(PCA2;蓝色);

接近1.000的线表示正因子负荷(较高的摄入量);

接近-1.000的线表示负因子负荷(较低的摄入量)。

西方饮食模式特点:大量摄入薯条、零食、蘸酱、植物油、红肉、加工肉和土豆,而橄榄油的摄入量较低。

谨慎饮食模式特点:大量摄入豆类、蔬菜汤、土豆、熟蔬菜和生蔬菜。

许多病例-对照研究和队列研究以及这些研究的系统审查和 Meta 分析研究了各种后验饮食模式与癌症风险之间的相关性。一项关于后验饮食模式(分组为“健康”或“不健康”)和癌症风险的93项研究的全面系统审查和 Meta 分析报告如下:

对乳腺癌的Meta分析回顾了14组和18项病例对照研究,得出结论认为西式饮食使乳腺癌风险增加(RR 1.14,95% CI 1.02-1.28,尽管这种关联仅限于病例对照研究,而不是队列研究),而“谨慎”模式的风险使其风险降低(RR 0.82,95% CI 0.75-0.89).

另一项基于经验的22项饮食模式的Meta分析显示,饮食“健康”的人患卵巢癌的风险降低(OR 0.86,95%CI 0.74-0.99;p=0.04),“西方”饮食模式者患卵巢癌的风险增加(OR 1.19,95%Ci 1.01-1.41;p=0.04)。

总体而言,系统评估和Meta分析报告显示,与“健康”或“谨慎”的饮食模式相比,结直肠癌的风险持续降低,而“西方”或“不健康”模式的风险增加,而其他类型癌症的关联则具有暗示性,但在病例对照和队列研究中都不那么一致。

先验饮食模式

许多研究人员根据饮食指南(国家指南和慢性病预防指南)和文化饮食方式制定了饮食模式和指数。这些先验饮食与各种癌症风险之间的联系在各种研究中都有报道,系统回顾和 Meta 分析提供了广泛的见解。

重要的是,一些饮食成分,特别是乳制品和酒精,它们对癌症风险有潜在的相反影响,不是包含在先验饮食模式中,就是被认为是不同的。

先验饮食模式与癌症风险

结直肠癌的证据最充分,健康饮食指数(HEI-2005或HEI-2010)、地中海饮食评分(MDS)、预防高血压的饮食方法(DASH)和半素食饮食与降低风险相关。HEI-2005、地中海替代饮食和MDS也与乳腺癌风险降低相关,HEI-2005和MDS在系统回顾中与前列腺癌和胰腺癌风险降低相关。

健康的北欧食物指数(HNFI)与结直肠癌或乳腺癌之间没有一致的证据。对于前列腺癌,很少有证据表明其与低碳水化合物和高蛋白以及素食有关。

基于准则的模式

在癌症流行病学文献中,基于特定国家指南的先验饮食模式包括健康饮食指数(HEI)、健康北欧食品指数HNFI)、世界卫生组织健康饮食指标和中国食品宝塔,而基于慢性病预防指南的主要模式包括地中海替代饮食(aHEI)和预防高血压饮食(DASH).

 · 健康饮食指数和替代健康饮食指数

该指数是为衡量对美国人的饮食指南的遵守情况而制定的,多年来不断发展,以与每5年更新一次的美国人的饮食指南相对应。

多个系统的回顾和 Meta 分析报告了不同版本的HEI与癌症风险之间的关联,风险和注意之间相对一致的反向关联。aHEI是根据慢性病预防的证据来定义饮食质量的,目的是作为健康饮食指数的替代品;显著的区别包括酒精和坚果和/或豆类的不同类别,白肉和红肉和/或加工肉的区别,以及长期使用多种维生素。

 · 其他全球或国家特有的饮食指数

基于其他国家特定饮食指南的饮食指数还没有像健康饮食指数那样被广泛的研究,但是有一些证据表明它与癌症风险有关联。HANFI (也称为波罗的海饮食)反映了北欧人推荐的饮食指南。

一个版本包括六个组成部分(鱼、卷心菜、黑麦面包、燕麦片、苹果或梨和根类蔬菜),另一个版本结合饮食和体力活动(新的北欧饮食)包括9个同等重量的成分(碳水化合物、蛋白质、脂肪、酒精、纤维、盐、维生素、矿物质和体力活动)。见表1.

在丹麦队列中,HNFI与女性结直肠癌风险降低相关(RR 0.65,95%CI 0.46–0.94),而与男性无关(RR 0.87,95%CI 0.61–1.25)。但在瑞典的一项研究中与乳腺癌风险无关,在病例对照研究中,新的北欧饮食与前列腺癌风险无关。

世卫组织健康饮食指标是一个基于国际慢性病预防指南的七分制评分。在欧洲对癌症和营养的前瞻性调查(EPIC-nl)研究中,它与英国人乳腺癌风险无关,它与总体癌症风险或与吸烟或酒精相关的癌症风险无关。

中餐宝塔由10个组成部分组成(见表1),在两个上海队列中与结直肠癌风险降低相关(与第一个四分位数相比,第四个四分位数的RR为0.84,95%CI为0.73–0.96),其中未发现与改良aHEI-2010(RR为0.91,95%CI为0.79–1.05)和修正后的DASH评分(RR 0.90,95%可信区间0.78-1.03),表明针对具体国家的指南对一个国家人口内的健康结果有更强的影响。

 · 控制高血压的饮食方法

得舒饮食(DASH)是一种推荐的饮食模式,可以降血压。它与 HEI 和 aHEI 略微不同,因为它不包括用于脂肪摄入或酒精消耗的组分(见表1)。

多项研究已经显示了其与癌症风险的关联。

在2018年,据报道,在健康专业人员随访研究中,得舒饮食与男性患结直肠癌的风险呈负相关(RR 0.81,95%CI 0.66-0.98,最高五分位数与最低五分位数比较),而在护士健康研究中的女性中则不是这样(RR 0.98,95%CI 0.82-1.17)。

一项前列腺癌侵袭性种族差异的个案研究中,DASH分数与侵袭性前列腺癌的几率之间存在适度的反向关联(OR 0.76,95% CI 0.55–1.06,比较高依从性和低依从性)。

基于文化行为的模式

根据文化饮食行为和传统对癌症风险进行调查的主要先验饮食模式是各种地中海饮食分数(如地中海饮食评分和地中海替代饮食)、素食或纯素饮食分数以及旧石器时代饮食模式评分。

 · 地中海饮食评分

地中海饮食强调摄入蔬菜、水果、谷物和谷类食品、坚果、种子和豆类,适度摄入鱼类、橄榄油和酒精,少量摄入红色或加工肉类和乳制品。

这是在一项随机对照试验(PREDIMED试验)中试验过的少数几种饮食模式之一。在该试验中,与对照组(被随机分为低脂饮食)相比,干预组(被随机分为地中海饮食组和特级初榨橄榄油组)乳腺癌风险的降低是非常明显的 (RR 0.31, 95% CI 0.13–0.77)。

由于其在2003年首次描述了地中海饮食评分,因此已经创建了多个评分系统的迭代。

地中海替代饮食评分系统则将水果和坚果分开,去除乳制品,只包括全谷物 (而不是所有谷类) 以及红色和加工肉类 (而不是所有肉类) (见表1)。

对地中海饮食和健康结果的27项Meta分析的概括性回顾发现,在70篇关于不同健康结果的原始研究文章中使用了34种不同的评分系统。使用的主要分数是地中海饮食评分和地中海替代饮食,但其他分数的变化主要与酒精和脂肪酸摄入量的差异评分有关。

2019年的一项研究比较了同一西班牙研究人群中五种不同地中海饮食模式得分的值,发现不同得分之间只有中等程度的一致性。这一发现很可能是由于得分制定方法的变异性,包括组成得分的摄入单位(例如,一些使用克/天,而其他使用能量密度)、所含食物或营养素的类型(例如,乳制品包括在一些但不是全部得分中)以及得分取决于研究人群的摄入量水平(例如,使用中位数的摄入量值作为切入点,而不是预定的摄入量水平)。

Meta 分析得出结论,尽管饮食习惯与地中海饮食相近的参与者与乳腺癌风险的关联性较低,但其患结肠直肠癌的风险较低

在五项研究中,没有关于地中海饮食模式与前列腺癌的风险关联的报道,尽管我们之前报道过在食用与地中海饮食密切相关的饮食的男性中,高侵袭性前列腺癌的几率降低。

在MDS、改良MDS或意大利地中海饮食指数定义的高依从性研究中,大肠癌风险降低的证据似乎最为一致,而美国人群中应用的aMED评分系统的相关性通常为空。如Donovan等人所述,MDS与结直肠癌风险之间的关联性会随年龄性别而变化,并且观察到远侧肿瘤而非近端肿瘤的风险关联性更高

 · 素食或纯素食饮食

WCRF/AICR推荐以植物为基础的饮食,重点是全谷类、蔬菜、水果和豆类,并限制红肉的摄入,以预防癌症,主要是基于蔬菜、水果、全谷类和豆类的食用量增加,癌症风险增加,从而降低癌症风险的证据,特别是结直肠癌,增加了红肉和加工肉的摄入量。

在一项系统审查中,与非素食者相比,素食主义者(RR0.92,95%CI 0.87-0.98)和素食者(RR 0.85,95% CI 0.75-0.95) 患癌症的风险降低,而与乳腺癌发病率无关(RR 0.94,95%CI 0.84-1.06)。

在另一项仅对前瞻性队列研究进行的Meta分析中,与非素食饮食相比,素食饮食与降低乳腺癌、前列腺癌或结直肠癌的风险之间没有显著的关联。

然而据报道,半素食和 PESCO-素食饮食与结直肠癌的风险呈负相关(RR 0.67,85%CI0.53-0.83)。

使用传统的食物频率问卷定义素食者或纯素饮食会带来一些独特的挑战(例如,根据有限的食物清单中对动物产品没有正面反应的情况,将被访者归类为素食者或素食者,可能导致分类错误,而食物频率问卷通常不评估遵循素食或纯素饮食的持续时间或原因),观察性研究受到残留或未测量的混杂变量的困扰,因为选择素食或纯素饮食的人与杂食者相比,其他生活方式因素往往不同。

 · 旧石器时代饮食模式评分

旧石器时代饮食富含蔬菜、水果、坚果、瘦肉和鸡蛋,盐含量极低,不含乳制品、谷物和精制脂肪和糖。

在加州教师的研究中,旧石器时代的饮食模式评分与乳腺癌的风险无关。

在爱荷华州妇女健康研究中,与结直肠癌的风险无关。尽管包括体重指数、吸烟和体力活动以及饮食的“进化一致”生活方式评分与结直肠癌风险降低相关。

乳制品与结直肠癌风险降低相关;因此,将乳制品排除在饮食评分中作为有益因素可能解释旧石器时代饮食与结直肠癌风险之间缺乏关联。

基于生物标记的模式

根据各种饮食因素对特定生物过程或途径的影响,已经开发了一些先验饮食指标来评估饮食质量。在流行病学文献中,与癌症生物学机制有关的几个指标-特别是炎症、胰岛素抵抗、氧化应激和雌激素代谢-与癌症风险有关。

基于生物过程的饮食模式与癌症风险的关系

基于生物过程的膳食模式包括通过炎症指数(DII)测量的具有促炎性潜能的饮食,如抗氧化平衡能力(OBS)、高胰岛素血症潜能和亲雌激素潜能评估的抗氧化能力。根据几项 Meta 分析,较高的 DII 分数始终与结直肠、乳腺、前列腺和肺癌的风险增加相关,而胰腺癌的报告结果不一致取决于研究设计。

OBS与乳腺癌和结直肠癌的风险降低相关,而与前列腺癌的相关性不一致。在两项研究中,高胰岛素饮食与结直肠癌和消化道癌风险增加相关。在三分之一的研究中,促雌激素饮食模式与乳腺癌风险增加有关。

饮食炎症潜能

炎症是一种公认的癌症特征,影响恶性肿瘤的发展和发展。DII是根据摄入多达45种不同的膳食成分(其中大部分是大营养素和微量营养素)来评估整个饮食的总体炎症潜能的。见表2

在前瞻性研究(RR 1.25,95%可信区间1.16–1.35)和病例对照研究(或1.75,95%可信区间1.43–2.16)中,高DII评分(代表促炎症饮食)与癌症发病率增加有关。最常见的报道是,与结直肠癌的风险相关性最高,为男性高于女性,近端结肠高于远端结肠癌。在四分之三的研究中,膳食炎症指数与前列腺癌风险呈正相关。

氧化平衡分数

氧化应激可导致DNA损伤,如果不修复,可能有助于增加癌症的风险。氧化平衡评分(OBS)已被定义为多种方式,包括3至28个组成部分,并且通常包括具有抗氧化或抗氧化作用的饮食和非饮食生活方式因素。

目前OBS与前列腺癌风险增加相关的证据有限。然而,在2019发表的一篇综合性的研究报告显示,OBS患者的“抗氧化”得分高的个体显著降低了结直肠癌(两项研究)和乳腺癌(一项研究)的风险。因此,关于OBS和个体癌症的数据是有限的,并且相关的数据通常反映了其他与生活方式相关的危险因素,如吸烟、肥胖和使用非甾体抗炎药。

低碳水化合物饮食

胰岛素和胰岛素样生长因子调节碳水化合物和能量代谢,与癌症风险有关。新出现的证据将生酮饮食(碳水化合物含量低,脂肪含量高)与癌症预防联系起来。生酮饮食将每日碳水化合物的摄取量限制在20-50克/天,这导致胰岛素分泌减少,并通过脂肪酸转化为酮体来转化为脂肪氧化燃料。

生酮饮食已在癌症患者中进行了研究,但关于其与人类癌症预防的关系的数据有限。到目前为止,有一个随机试验,报道了生酮饮食对子宫内膜癌或卵巢癌妇女的身体机能和食欲的有利影响。

基于动物模型的研究显示其相关性:2019年对致酮饮食作为癌症治疗方法的综述显示,在大多数临床前小鼠研究中,它减缓了肿瘤生长、延长生存期、延迟肿瘤的发生和逆转癌症诱导的缓存过程。

新兴发展

饮食模式和癌症研究领域的新发展包括使用创新的统计技术来降低多个预测变量以及实验室工具(如代谢组学)的维数,这可以揭示生物机制,提供比自我报告数据更客观的饮食测量。

创新的统计技术

两种统计技术在癌症预防中尚未得到很好的研究,但有望有希望识别高相关性的新饮食模式,包括降秩回归 (RRR) 和分类及回归树 (CART) 分析。

RRR通常使用一个中间标记,首先根据其解释标记变化的能力来定义饮食模式,然后检查与癌症风险的关系。

a. 下图说明了在绝经后妇女的前瞻性队列研究中,用于建立与雌激素代谢物相关的饮食模式的降秩回归过程。

简单地说,32个食物组被用来确定哪些食物组(预测变量)解释了两个反应变量(雌激素代谢物)中的最大变化。11种食物组(非全麦/精制谷物、西红柿、十字花科蔬菜、奶酪、富含omega-3脂肪酸的鱼/贝类和法兰克/午餐肉的重量为正;坚果/种子、其他蔬菜、低omega-3脂肪酸的鱼/贝类,酸奶和咖啡的重量为负)保留在“促雌激素”的饮食模式中,然后检查与乳腺癌风险的关系。在前列腺癌、肺癌、结直肠癌和卵巢癌的研究中,更高的得分反映了更倾向于雌激素的饮食与乳腺癌风险的增加有关,但在姐妹研究中没有。

b. 下图示为食道癌之分类与回归树分析。

分类和回归树分析使用逐步回归来确定解释癌症终点变化的成分,方法是创建多个分类树(当终点是分类的)或回归树(当终点是连续变量)来将人群分成具有相似特征的子组逐步的特点。

方形框表示终端子集。每个方框或圆圈的顶部数字表示控件的数量,下面的数字表示案例的数量。每个方框右下角的数字是该组案例的概率。以食管腺癌为例,胃食管反流病(GERD)是最大的预测因子,其次是红肉摄入量。对于红肉摄入量低的个体来说,深绿色蔬菜、生蔬菜和香烟是重要的危险因素。对于高红肉摄入量的个体来说,低非柑橘类水果摄入量是一个重要的危险因素。

代谢组学和饮食模式

代谢组学领域的扩展使得使用客观的生物标记物同时检查多个与饮食相关的实验,这可以减轻人们对自报FFQ数据测量误差的一些担忧

与健康饮食指数-2010相关的前20名代谢物中有许多与维生素E、B和C等维生素的代谢物有关。在一项随访研究中,PCA用于识别一组与“健康饮食指数-2010/复合维生素评分”相关的23种代谢产物;但是,与乳腺癌风险无关(OR90例vs10百分位0.96,95%CI0.67-1.37)。

未来在代谢组学和饮食模式领域的研究有可能有助于确定某些饮食对健康益处的生物学机制,并提供比自我报告的饮食摄入数据更客观的饮食暴露测量方法。

生物学机制

饮食模式旨在评估整体的饮食质量,因此,它们的使用被视为营养研究的整体方法。然而,关于饮食模式中应包括或排除哪些成分的决定通常是由各种成分的个体效应的证据驱动的。因此,营养科学的还原主义方法通常是构建饮食模式的必要前提。不同饮食模式与癌症风险之间关联的生物学机制可能是由于不同饮食成分的生物效应(协同作用或添加剂)。一些相关的生物学机制已经被提出,包括肠道微生物群及其代谢物,表观遗传学,炎症和免疫功能,以及代谢或激素的破坏

饮食与癌症关系的潜在机制

据报道,一些相关的生物学机制被特定的饮食模式所调控,包括能够显示肿瘤抑制或致癌特性的微生物群和代谢物谱;表观遗传事件,包括CpG位点的DNA甲基化模式或编码肿瘤促进基因和非编码RNAs113位点的染色质状态失调;炎症或免疫功能失调;代谢和激素反应,包括高胰岛素血症和胰岛素抵抗,性激素代谢异常,脂肪酸信号和氧化应激和氧化损伤,导致基因组DNA的修饰和导致的突变。

表观遗传机制

CpG位点DNA甲基化模式的表观遗传改变编码肿瘤促进基因和非编码RNA位点染色质状态的失调是控制肿瘤进展的主要因素。

由于表观遗传变化可以通过营养(例如,丁酸盐介导的组蛋白脱乙酰酶抑制)来重塑,因此饮食策略在逆转癌细胞中的不良表观遗传标记方面具有巨大的潜力。

目前的研究主要局限于富含多酚的饮食,这种饮食在影响DNA甲基化,组蛋白修饰和非编码RNA在癌细胞中的表达以减轻肿瘤进展和预防转移方面取得了一些成功。

炎症与免疫功能

流行病学研究表明,所有癌症中至少有20%是由炎症或免疫功能失调直接引起的,因此抗炎饮食模式可能是很有吸引力的癌症预防策略。

各种炎症饮食模式评分的发明,如膳食炎症指数(DII),促进了将炎症作为饮食与癌症风险之间的生物学联系的研究。以高膳食炎症指数评分为代表的炎症饮食与多种癌症的风险增加有关,而旧石器时代和地中海饮食模式的得分与炎症的生物标志物成呈负相关。

代谢或激素紊乱

代谢综合征-一种以腹部肥胖、胰岛素抵抗、高血糖、血脂异常和高血压为特征的疾病,常伴有促炎症状,与癌症密切相关,因为已报告增加癌症风险和癌症相关发病率。这种关系的潜在机制包括高胰岛素血症和胰岛素抵抗,性激素代谢和脂肪因子信号异常,慢性炎症和慢性多血糖症。地中海饮食和素食饮食与代谢综合征的预防和延迟发病有关,而西方饮食模式与代谢综合征的发病率增加有关

肠道菌群及其代谢物

越来越多的证据表明肠道微生物可以影响癌症的易感性和病因。饮食可以影响这一过程,因为它有能力促进具有抑瘤或致癌特性的细菌的生长,这取决于营养物质的含量。此外,一些饮食成分被共生或共生的肠道细菌代谢为具有生物活性的食物成分,可以预防癌症。

支持饮食、肠道微生物群及其代谢物与癌症风险之间联系的最有说服力的证据来自于高纤维摄入量饮食模式的研究。

膳食纤维在结肠中经过细菌发酵产生丁酸、短链脂肪酸(SCFA)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂,抑制结直肠癌细胞的体外生长

另外,谨慎饮食评分与结直肠癌组织中具核梭杆菌Fusobacterium nucleatum 的存在呈负相关,支持肠道微生物群介导富含纤维饮食与结直肠癌之间联系的假设。

在一项研究中显示,对地中海饮食的依从性提高与明显增加粪便SCFAs的水平有关。

相比之下,晚期结直肠癌患者的膳食纤维摄入量低于健康对照组,SCFA生成量也低于健康对照组,这些变化与条件致病菌增加和粪便样本中SCFA生成菌的水平降低有关。

在预防和治疗癌症的道路上,肠道菌群的角色已渐渐从微不足道转向不可或缺的重要力量。

结 语

流行病学文献中关于饮食模式和癌症的研究越来越多,新的饮食模式正在迅速发展。

目前一些饮食模式,例如生酮饮食或操纵宏营养成分,在动物模型中比在人类预防癌症方面得到更广泛的研究,现在需要更多的人类观察研究来为饮食指南提供依据。

大规模流行病学研究提及关于癌症的几个危险因素,其中包括日常能做到改变的饮食模式、生活方式等。如果能根据这些易感因素(例如家族史、性别、年龄、其他生活方式因素或同居关系、代谢组学特征或基于微生物的特征)为人群定制个性化的饮食建议,对于推动这一领域向前发展将是非常重要的。

幸运的是,我们也在做同样的事~

最后,希望阅读此文的你,注意饮食习惯,有个健康的身体~

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参 考 文 献

Steck, S.E., Murphy, E.A. Dietary patterns and cancer risk. Nat Rev Cancer (2019) doi:10.1038/s41568-019-0227-4

如何有针对性的进食或者补充膳食纤维

谷禾健康 原创

提到健康饮食,很多人第一反应是“多吃点粗粮,蔬菜,水果”,原因不外乎“补充膳食纤维”,“助消化”等等。

那么,“膳食纤维”是什么?

关于膳食纤维的定义,在前面的“饮食、肠道菌群与健康”一文中有详细阐述过(点此复习)。

简单来说,膳食纤维是一种可以归类为长链的多糖,由于人体胃肠道无法直接消化吸收,但是可以被部分肠道菌群进行代谢利用。

为什么都觉得要补充膳食纤维?

我们都知道膳食纤维对健康起到很多重要作用:比如说增加饱腹感,促进排便,控制血糖,降血脂,维护肠道健康等。

近日,来自意大利巴勒莫大学的研究人员发表在《European Journal of Nutrition》期刊上的一项研究显示,在地中海人群中,摄入较高的膳食纤维总量与全因死亡率降低有关,尤其是可溶性膳食纤维与全因死亡率显著负相关(p=0.007)。每1000kcal能量增加3g蔬菜来源的膳食纤维摄入,全因死亡率降低16%。(研究人员是利用纳瓦拉大学项目(SUN)数据进行研究,数据从1999年开始记录,每2年对参与者的饮食、生活方式、风险因素、医疗条件等进行一次随访。)

作者在文末提倡增加摄入富含膳食纤维食物如蔬菜、水果、全谷物等的食用量,来降低慢性病的发生和死亡风险。

以上可见膳食纤维的重要性。

膳食纤维除纤维素等非常复杂的多糖外,其主要作用可以促进有益菌的生长,并代谢产生短链脂肪酸。

肠道菌群与宿主长期以来通过进化,共生菌适应了宿主的饮食特点,进而具备代谢利用宿主饮食中的碳源的能力,其代谢产生的短链脂肪酸又可以帮助宿主。

短链脂肪酸作为能量底物影响各种生理过程,对身体健康或疾病带来影响。

短链脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)

短链脂肪酸主要包括 乙酸,丙酸,丁酸(比例超过90%)。

短链脂肪酸占人类总能量消耗的2-10%,是大肠上皮细胞的主要能量来源,影响粘液的产生。

短链脂肪酸在生理上影响结肠粘膜的血流、液体和电解质的吸收、自主神经系统和肠道激素的分泌等。

Rivière A, et alFrontiers in microbiology, 2016

既然膳食纤维能通过肠道菌群的代谢产生短链脂肪酸,而短链脂肪酸对人体健康又有如此重要的作用。看到这里,你是不是想立刻补充一点膳食纤维?先别急,我们再来看一组数据。

以上是一名检测者,Lily(化名)的菌群检测报告的部分内容。

我们可以看到在她的菌属构成中占比最高的是克雷伯氏菌属,其次是大肠杆菌所在的埃希氏菌属,而正常人体共生菌中最主要的粪杆菌属 Faecalibacterium 仅占比1.066%。

Lily在没有做过检测的时候认为,自己平常有留意到人体需要补充膳食纤维,所以应该尽可能多吃。但是我们的报告却告诉她,这样做并不一定可以带来最有效的干预。为什么呢?

因为肠道菌群在同时有多种碳源可利用的情况下,会优先利用单糖等较易代谢的营养,饮食中摄入游离糖或蔗糖一类简单糖较多不利于益生菌,反而很多病原菌和机会致病菌代谢繁殖优势更大。

在考虑膳食纤维改善肠道菌群时需要考虑现有肠道菌群的构成以及问题菌具体是什么。比如低聚果糖是一类主要的膳食纤维,可以有效的促进双歧杆菌等益生菌的生长,但是肺炎克雷伯氏菌作为另一类常见的肠道机会致病菌也能代谢利用低聚果糖作为碳源,因此在肺炎克雷伯氏菌超标过量的情况下建议食用菊粉作为主要的膳食纤维,因为菊粉无法被克雷伯氏菌利用。

以上,我们不难发现,在了解需要补充膳食纤维的基础上,如果你能更深入了解一些关于膳食纤维如何通过菌群产生短链脂肪酸,这些短链脂肪酸到底是如何产生作用等等知识,你就会更加科学合理地补充你需要的营养。

我们每天所需的热量中10%来自短链脂肪酸,这不仅和我们摄入的膳食纤维的量有关,还与种类有关。

不同来源的膳食纤维产SCFA的比例

不同的膳食纤维经人体肠道菌群代谢后会产生不同量的短链脂肪酸,其中乙酸:丙酸:丁酸的比例和所需时间也有所不同。详见下表:

注:上表数据均来自 Alexander C,et al., Advances in Nutrition, 2019,所有品牌不代表谷禾推荐。

在了解了膳食纤维经代谢产短链脂肪酸的量之后,你是不是也想知道一般人体内短链脂肪酸的浓度及比例如何?

我们找了相关数据,下表是已报道过的成人粪便中单个SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸)的浓度。

Ohira H,et al.Journal of atherosclerosis and thrombosis, 2017

下表是一些病人的SCFA浓度及比例的相关数据。

Ohira H,et al.Journal of atherosclerosis and thrombosis, 2017

以上我们对短链脂肪酸的量及乙酸、丙酸、丁酸的比例有了大致的了解。我们的检测报告也有评估短链脂肪酸水平(下面的数字是经过大数据计算之后得出的分数)。

短链脂肪酸评估表

可以看到这位检测者(还是Lily的检测报告)的丙酸是缺乏的,那么就需要相应的选择促进丙酸代谢的菌。如:芒果、高粱、小米、黑麦、荞麦、姜黄等食物就可以促进丙酸代谢菌的生长。

如果我们自己想知道哪些菌与产生短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)有关,那就需要再来深入了解一下产生短链脂肪酸的途径。

短链脂肪酸如何产生?

短链脂肪酸的产生离不开肠道菌群,而肠道菌群的主要能量代谢来源是碳源。

碳水化合物发酵和细菌交叉喂养合成SCFA途径

Rowland I et al. European journal of nutrition, 2018

一般而言,碳源中的单糖最易利用,能代谢的菌也最多。而膳食纤维通常是多个单糖构成的,只有特定细菌能代谢,并通过糖解作用进入丙酮酸途径。

接下来,我们通过下表来看看哪些菌群通过什么途径会产生短链脂肪酸(乙酸、丙酸)。

Ohira H, et alJournal of atherosclerosis and thrombosis, 2017

研究表明,健康个体的粪便样本中丁酸的含量高于患肠病的个体(Basson等,2000)。同样,尽管丙酸水平没有显着差异,但疾病队列的肠道中乙酸水平升高(Weir等人,2013)。

这些结果表明,在三种细菌来源的SCFA中,丁酸盐可能在确定个体的肠道健康状况中起比较重要作用。下面仔细了解一下丁酸是什么,为何如此重要。

丁 酸

肠道中丁酸对肠道健康具有积极影响

丁酸是结肠上皮细胞的首选能源,在其中它有助于维持肠道屏障,发挥免疫调节和抗炎作用。

研究指出,丁酸的使用可以影响细胞周期蛋白D3的产生,这可能导致细胞在细胞周期的G1期停止生长,并向终末分化转变。实验证明丁酸是组蛋白脱乙酰基酶抑制剂,进一步强调了其通过表观遗传调控在减少细胞增殖中的作用

丁酸的产生会降低pH值,可防止肠道中诸如肠球菌和大肠杆菌等病原性微生物的生长。

接着再来看,丁酸是怎么来的?

丁酸的产生途径

四种丁酸产生途径的示意图

Anand S, et alFrontiers in microbiology, 2016

上图显示细菌利用四种底物,即丙酮酸、戊二酸、4-氨基丁酸和赖氨酸,通过4种不同途径产生丁酸。

简单来说,这四条途径中的每一条都使用丁酰辅酶A脱氢酶电转铁蛋白黄素复合物(Bcd Etfαβ)催化巴豆酰辅酶A转化为丁酰辅酶A。最终,丁酸的生产由丁酰辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(But)或丁酸激酶(Buk)催化。

至此,我们了解了丁酸的产生途径是菌群利用底物通过不同途径产生的,那么菌群又是如何发挥作用的呢?

肠道菌群和丁酸产生途径

研究数据显示,健康人的肠道中,丁酸产生菌如粪杆菌属Faecalibacterium、粪球菌属Coprococcus 和罗氏菌属Roseburia 的出现率较;而在患有大肠癌、IBD、溃疡性结肠炎、糖尿病等的个体的肠道中,这些属的丰度较低。

为了评价产丁酸菌在人体肠道中的作用,研究人员分析了443名健康人和567名患病者的16srRNA扩增子的公开数据集。

多元分析结果如下:

我们可以看到健康个体和患病个体内会有不同的菌占优势。

一个有趣的现象:所有患有CRC(95个样本)和IBD(101个样本)的患者中,Fusobacterium 菌属(唯一的一个产丁酸的菌)出现率高2倍。这是为什么呢?

研究人员对所有已测序的细菌基因组(如前所述)进行了四种不同丁酸生产途径的基因组挖掘。在将健康和患病数据集中显示不同丰度的属映射到每个基因组中丁酸产生途径时,观察到不同的分布。

Anand S, et alFrontiers in microbiology, 2016

在对可能的致病菌和共生体中各种丁酸生产途径进行深入的比较之后的结果表明,在许多栖息于肠道的Lachnospiracea 菌株缺乏丁酸途径,只有产丁酸的共生体才会释放一部分丙酮酸来产生丁酸

而与共生细菌相反,在大多数致病菌属中,丁酸生物合成途径未被鉴定。这些肠道相关的梭杆菌菌株(上图A)都缺乏丙酮酸途径来产生丁酸。在疾病条件下,高丰度的产丁酸菌可能与丙酮酸缺乏有关

另一类利用氨基酸作为初始底物(谷氨酸,4Ab,赖氨酸,天冬氨酸甲酯)在肠道病原体(如:Fusobacteria  Megasphaera)中普遍存在,并导致产生氨气,对肠道健康有害。

丁酸的免疫调节作用

研究丁酸对抗炎反应的免疫调节作用。它刺激调节性T细胞(Treg)增加IL-10的产生,IL-10是一种抗炎细胞因子(下图A)。

丁酸还刺激血浆细胞分泌血清IgA,从而限制肠道内病原菌的增殖。具有产丁酸途径的病原菌导致伴随氨的产生,从而增加肠道炎症(下图B)。

因此,本研究表明,病原体保留了导致有害氨释放的丁酸途径,这可能会对肠道完整性造成损害,从而导致病原体入侵的可能性更高

Anand S, et alFrontiers in microbiology, 2016

以上,我们知道了丁酸对肠道健康很重要,但并不是所有产丁酸菌都是有益菌。因为在细菌中存在多种代谢产生丁酸的途径,其底物和代谢产物有所不同,对应的菌也有差异。

主要的有益健康的产丁酸菌主要通过代谢碳水化合物并通过丙酮酸途径产生丁酸。已知丙酮酸是通过所有细菌中的葡萄糖代谢糖酵解途径生物合成的。

(产丁酸的有益菌,例如:Faecalibacterium,Roseburia 和 lachnospiracea incertae sedis

如何提高丁酸水平?

丁酸对人体这么重要,你可能会想知道怎样获取。目前的策略通常是补充益生菌和益生元

那么益生菌、益生元和丁酸之间有什么关系,又是如何对人体健康带来积极影响的呢?

在解决这个问题之前,我们先来了解下概念。

很多人往往会把益生菌和益生元搞混淆,或者认为它们就是同一种东西,其实是不一样的:益生菌是活菌,通常在乳制品如酸奶等食物中会添加,而益生元可以理解为是给益生菌吃的食物。

益生菌

根据国际益生菌和益生元科学协会(ISAPP)的定义,益生菌被定义为“活微生物,如果给予足够的量,可以给宿主带来健康益处”。

目前使用的益生菌有20余种,主要有3类:双歧杆菌属、耐氧的乳杆菌属和兼性厌氧球菌。

乳杆菌和双歧杆菌不产生丁酸,但通过交叉喂养摄入其他共生微生物(如粪杆菌属),可增加肠道中的丁酸水平

双歧杆菌精选菌株也是常用的益生菌,可以添加到食品补充剂和食品(尤其是乳制品)中。口服双歧杆菌对不同消化问题和疾病有益,包括加快肠道运输时间;改善乳糖不耐症;预防与抗生素有关的腹泻和坏死性小肠结肠炎(对于通常携带双歧杆菌数量减少的早产儿);减轻IBS和IBD症状

不同的菌对膳食纤维的利用不同,所能转化的短链脂肪酸也不同。双歧杆菌能代谢产生乙酸,而其产生的乙酸在存在产丁酸菌的时候可以被利用生成丁酸。

另一种益生菌——鼠李糖杆菌被发现可以有效改善儿童食物过敏

来自澳大利亚的一项实验,30名过敏儿童每天服用小剂量的花生蛋白以及剂量逐日增加的益生菌(鼠李糖乳杆菌,Lactobacillus rhamnosus GG),最终益生菌的量相当于每天摄入44磅酸奶的益生菌摄入量。在经过18个月之后,这其中有大约4/5的孩子吃花生之后没有出现过敏反应。

益生菌还能改善肠道屏障作用(刺激粘蛋白产生),产生神经化学物质(如5-羟色胺,催产素等),产生酶类(如胆盐水解酶、乳糖酶等),产生饱腹感的激素等,对健康的影响力不容小觑。

除了直接补充益生菌的方式之外,另外一种方式可以为益生菌提供更好的生存环境,那就是补充益生元。

益生元

益生元是一些不被宿主消化吸收的有机物质,却能够选择性地促进体内有益菌的代谢和增殖,调节肠道菌群组成和活性,从而对宿主健康产生有益影响。常见的益生元包括菊粉、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、乳果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖等。

通常市面上的婴儿奶粉都会添加益生元,那么益生元是如何对宝宝健康起作用的呢?

这要从宝宝的出生说起。刚出生时肠道会被不同菌群迅速定殖,其中最丰富的要数双歧杆菌。

在生命早期,婴儿的微生物组通常是在人乳中的分子指导下产生的。这主要是通过母乳低聚糖(简称HMO)来实现的,HMO可以为婴儿体内生长中的微生物群提供养分。只有双歧杆菌和拟杆菌显示出代谢的HMO。特别是两歧双歧杆菌和婴儿双歧杆菌是HMO的有效利用者,而它们被短双歧杆菌和长双歧杆菌适度消化。动物双歧杆菌和青春双歧杆菌不能降解HMO。

低聚半乳糖刺激双歧杆菌的生长,尤其是青春双歧杆菌的数量受到影响,并且当低聚果糖作为唯一碳源时,双歧杆菌容易生长

与母乳喂养相似的比例:

当使用比例为 9 : 1 的 低聚半乳糖 : 低聚果糖 混合物时,不同双歧杆菌物种的比例与母乳喂养婴儿的比例相似。这种 低聚半乳糖:低聚果糖 混合物也被证明是双歧杆菌和乳酸杆菌的最佳生长底物。

当 聚葡萄糖:低聚半乳糖 以 1 : 1 的比例结合使用时,双歧杆菌种类的增加,特别是婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和链球菌双歧杆菌,与母乳喂养的微生物群相似,其中婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌占优势。

以上讲到关于益生元促进宝宝菌群中有益菌增殖,从而给宝宝的健康带来的积极影响,那么只有婴儿需要益生元吗?

当然不是,成年人同样需要益生元的补充。成年人的有益菌的数量会逐渐减少,尤其中老年。补充益生元可以帮助有益菌的增殖,充足的益生菌可以竞争性抑制有害菌的生长,从而使菌群结构维持在相对健康的状态,改善肠道环境,改善健康。

然而,不同的益生元具有不同的物质结构,对有益菌的促进作用存在一定的差异

过去,益生元刺激的目标属是双歧杆菌,如今,人们正在寻找新的益生元来刺激人结肠中其他有益细菌物种,例如丁酸生产者。引起双歧化作用和产丁酸作用的益生元特别令人关注。

菊糖型果聚糖,阿拉伯木聚糖和阿拉伯木聚糖低聚糖是这样的益生元,既刺激双歧杆菌又生产丁酸

食用菊糖型果聚糖的有益作用包括增加排便频率,增加结肠中膳食矿物质(钙和镁)的吸收,降低蛋白水解活性以及增加饱腹感激素的分泌。

通过饮食补充

有人说,虽然知道需要补充益生元,但是一定要服用益生元制剂吗?可以通过饮食来改善吗?

当然也是可以的。

我们的检测报告中也有相应的食物和益生元的推荐。

推荐食物的分值说明:

分数的总数是20

每一种食物推荐范围是:-20~20

在前面的文章 饮食、肠道菌群与健康 中也讲到过食物中的膳食纤维(包括菊粉、抗性淀粉、低聚果糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖等)对菌群的影响。

一些益生元比如说:菊粉,在许多蔬果中(洋葱、天冬、菊芋、大蒜、小麦、香蕉等)都有不同含量的存在。如果需要补充,可以选择所需膳食成分相应含量高的食物。

抗性淀粉

除了前面提到的乳杆菌和双歧杆菌通过交叉喂养摄入其他共生微生物,可增加丁酸水平之外,另外膳食纤维成分比如抗性淀粉也有助于丁酸增加。

抗性淀粉又称抗酶解淀粉,难消化淀粉,在小肠中不能被酶解,但在人的肠胃道结肠中可以与挥发性脂肪酸起发酵反应。抗性淀粉存在于某些天然食品中,如马铃薯、香蕉、大米等都含有抗性淀粉,特别是高直链淀粉的玉米淀粉含抗性淀粉高达60%。

抗性淀粉含量高的饮食可将主要短链脂肪酸的比例转移至丁酸生产的增加。相比之下,减少饮食中碳水化合物(特别是淀粉)的含量会显着减少产生丁酸的Roseburia 种类的数量,同时减少丁酸的形成。

结 语

每个人的菌群结构,营养状况等各方面都不尽相同,只有在选择对自己真正有益的食物或者益生菌补充剂的基础上,精准干预,才能更有针对性,有效地改善健康状况。

谷禾健康 是谷禾面向健康领域的品牌,通过无创采集微量粪便样品,常温快递运输至谷禾检测中心,经全自动化样品处理和提取后大规模高通量测序获取菌群基因数据并进行分析解读,凭借全球领先的样本积累和业界独有的人工智能算法实现了基于肠道菌群的疾病预测和系统健康风险评估, 以及肠道菌群,病原物感染,重金属污染以及营养物质和激素代谢水平等在内的综合健康风险提示,并提供精准个性化的健康管理方案。公司成立于2012年,总部位于杭州,拥有优秀的研发团队和独立实验室,经过多年的积累,已完成近6万例临床肠道菌群样本检测,并构建了超过20万各类人群样本数据库。

谷禾健康的服务旨在通过持续不断的研发和改进,大量自动化提升效率,降低检测成本,为广大消费者提供更好更有价值的产品。

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富含梭菌的微生物群促进腹泻型肠易激综合征胆汁酸排泄

腹泻症状是大多数患者通过稀便(从可流动到水样),尽管也存在异常频繁的排便(每天2次排便)。腹泻代表肠功能的改变,由于多种原因,肠道对水的净吸收减少,导致粪便含水量高。肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一组持续或间歇发作,以腹痛、腹胀、排便习惯和(或)大便性状改变为临床表现,而缺乏胃肠道结构和生化异常的肠道功能紊乱性疾病。个体IBS患者中发现产生症状的特定机制是困难的,因为缺乏具有足够敏感性和特异性的测试来鉴定这些原因,并且证明鉴定该机制可以导致迅速而有效率的治疗。

近日,一篇发表发表于《The Journal of Clinical Investigation》来自中国香港特区香港浸会大学中医学院的研究成果:A Clostridia-rich microbiota enhances bile acid excretion in diarrhea-predominant irritable bowel syndrome(富含梭菌的微生物群促进腹泻型肠易激综合征胆汁酸排泄),其结果阐明了富含梭状芽胞杆菌的微生物群可以通过靶向反馈调控粪便胆汁酸的合成来诱导粪便胆汁酸的过度排泄。研究结果还提示了一种新的治疗策略,即以粪便胆汁酸转化细菌为靶点治疗腹泻型肠易激综合征患者的胆汁酸腹泻。研究人员认为,准确描述肠道微生物区系及其代谢物,结合肠道微生物区系的结构和功能特征,将提高现有肠易激综合征基于症状的治疗的精确度。

摘要

粪便胆汁酸(BAs)过多被认为是腹泻型肠易激综合征(IBS-D)的发病机制之一。然而,导致BA排泄过多的因素仍未完全研究。这篇研究证实了富含梭状芽孢杆菌的微生物群导致IBS-D患者BA排泄过多。通过BA相关代谢分析和宏基因组学分析,发现24.5%的IBS-D患者存在总BAs排泄过多和粪便中BA转化菌改变。通过一系列的动物和细胞实验,阐明了富含梭状芽胞杆菌的微生物群可以通过靶向反馈调控BA的合成来诱导BA的过度排泄。研究结果还提示了一种新的治疗策略,即以BA转化细菌为靶点治疗IBS-D患者的BAD。

背景

以排便习惯不规则为特征的肠易激综合征(IBS)影响着全球10%的人口,其中以腹泻为主的IBS(IBS-D)在西方国家和亚洲的患病率较高。临床研究表明,在IBS患者中,粪便总胆汁酸的增加与腹痛和结肠传输加速运动显著相关。动物研究表明,BAs直接诱导结肠运动加速和内脏超敏反应。相反,使用隔离剂减少BA的分泌可以部分缓解IBS-D患者的症状。这些观察结果证明了BA在IBS发展过程中的重要性。然而,过量的BA分泌是如何产生的还不完全清楚。通常情况下,BA主要由限速酶胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)合成,然后与肝脏中的氨基酸结合。大部分结合的BA被释放到肠道,从远端回肠被重新吸收,并通过门静脉回流到肝脏,这一过程被称为肠肝循环。少量逃过肠道吸收的BAs最终每日随粪便排出,可通过肝新生合成补充。肝脏和回肠中的BA合成速率受法尼醇X受体介导(FXR介导)反馈机制的可逆控制。肠道菌群在胃肠道中负责初级BAs向次级BAs的转化,并与宿主相互作用以控制BA的合成。

实验设计

1.受试者和样本采集

290名符合罗马IV诊断标准的IBS-D成人患者和91名健康受试者(HC)提供空腹血液和早晨第一次粪便。被要求在抽样前至少一个月停止使用抗生素、益生菌、益生元和其他与肠道菌群相关的补充剂。人体样本(血清和粪便)用干冰运送到实验室,并在-80°C冷冻。其中粪便总胆汁酸排泄量(≥为10.61molmol/g)的71名IBS-D患者归为BA+IBS-D组,剩余219名粪便胆汁酸排泄量正常(<10.61mol/g)的IBS-D患者归为BA-IBS-D组。

2.粪便移植实验

ABX由万古霉素(50

mg/kg)、新霉素(100 mg/kg)、甲硝唑(100

mg/kg)、两性霉素B(1 mg/kg)和氨苄西林(1

mg/mL)组成。成年雄性C57BL/6J小鼠在粪便移植前连续10天给予ABX,诱导为伪无菌小鼠模型(共71只)。HC和IBS-D供体(n=11-12个/组)的粪便样本分别制备为微生物菌群PBS悬液(50 mg/mL)。用2 0 0μL菌群悬浮液每日灌胃,连续5天。在基线(ABX干预前)、FMT前(ABX干预后)和FMT后收集粪便样本,以监测细菌密度。最后,麻醉后收集盲肠内容物检测BA转化菌的丰度和活性。收集其他标本(肝脏、回肠和回肠内容物)以分析BAs和/或BA相关基因和蛋白。

3.菌群定植实验

选用18只成年雄性C57BL/6J小鼠(n=6只/组)。通过16S核糖体序列分析,鉴定出一株典型的BA转化梭菌(C.scindens;ATCC,35704)。该菌株用脑心浸液肉汤(BHI,BD Biosciences)在厌氧条件下培养。在确认其体外BA转化活性后,每天给1组小鼠灌胃1×108cfu/mL的C.scindens菌PBS悬液,连续7天。另一组小鼠给予0.1

mg/mL的万古霉素,并以PBS为对照。

4.

BA对小鼠的干预实验

40只成年雄性C57BL/6J小鼠分为5组(n=8/组)。4个实验组分别以50 mg/kg体重的TCA、TCDCA、TUDCA或它们的混合物(T-bas)灌胃8周。第5组为生理盐水对照组。治疗结束后,取肝、回肠组织标本,用实时定量PCR方法分析FXR、FGF19、SHP和BA合成酶(CYP7A1、CYP8B1)基因。

5.肝细胞和肠上皮细胞制备

L-02(肝细胞系)和NCI-H716(上皮细胞系)分别用含10%Gibco胎牛血清的DMEM培养基和RPMI 1640培养基培养在塑料培养皿中。分别用万古霉素(10μM~40 0μM)和C. scindens (活体和热灭活)处理L-02细胞24h,检测它们对肝脏CYP7A1表达的影响。根据BAS激活FXR的EC50值范围,分别用50μ的M-TCA、TCDCA、TUDCA和T-bAS处理L-02和NCI-H716细胞24h,分析BA-牛磺酸偶联物对FXR、FGF19、SHP、CYP7A1和CYP8B1表达的影响。分别用GUDCA、GCDCA、GCA、CA、UDCA和7-KDCA处理NCI-H716细胞24h,观察其对肠上皮细胞FXR和FGF19表达的影响。

6.粪便宏基因组数据处理和统计学分析

去掉低质量的碱基和人类基因组,剩下83.59%的高质量序列。微生物多样性的测定和分类群的鉴定使用已发表的人类肠道微生物组基因目录数据库对比后分析。通过BLASTP对KEGG基因数据库(V79)进行功能同源基因(KO)预测。根据各自基因的相对丰度计算了门、属、种和KO的相对丰度。Shapiro-Wilk检验,判断人类粪便总胆汁酸的分布。基于Prism 7的斯皮尔曼相关系数分析总粪便总胆汁酸与其他生化和细菌特征的关系。Benjamin-Hochberg方法对微分类群和BA转化基因组进行了分析。临床定量特征、代谢产物和基因的变异,在多组比较时采用非参数Kruskal-Wallis检验,两组比较时采用Mann-Whitney检验。具有统计学意义的差异被定义为P<0.05

主要结果

1.

IBS-D患者胆汁酸合成增强,同时伴有过多的胆汁酸排泄和腹泻症状加重。肠道菌群衍生的胆汁酸的组成(如GUDCA、UDCA、7-KDCA等)发生了变化。BA+IBS-D患者血清和粪便中BA转化菌群异常,提示肠内转化胆汁酸菌群的异常可能是该病的病因之一。

A).正常对照组(HC)和IBS-D患者组的粪便总胆汁酸分布直方图。IBS-D组和HC组的粪便总胆汁酸排泄量呈偏态分布(经Shapiro-Wilk检验,P<0.05)

B)C).分别为血清7-羟基-4-胆甾烯-3-酮(C4)和成纤维细胞生长因子19的浓度在各组间的分布。)。BA+IBS-D组的血清C4升高,FGF19降低。

D)E)F).通过排便频率(D)、布里斯托大便分类法(E)、IBS严重程度评分系统(F)评估BA+IBS-D组和BA-IBS-D组之间的肠道症状严重程度。在BA+IBS-D组中,粪便总胆汁酸水平与血清C4水平和腹泻症状评分(Bristol大便规模和排便频率)呈正相关,而与血清FGF19水平呈负相关。

G)H).粪便中占优势的胆汁酸成分的绝对含量。I).粪便中占优势的胆汁酸成分在各组间占的比例。图例中仅显示了占胆汁酸总数1%以上的成分,I这些组分在BA+IBS-D组中都有显著增加。

显著性标记:与HC组比较(*P < 0.05, ***P < 0.005);与BA-IBS-D组比较(#P < 0.05, ##P < 0.01,

###P < 0.005)

2.在BA+IBS-D组中存在一个特定的富含梭菌的微生物群,具有不同的基因组,用于BA去结合、C7异构化和脱羟基。IBS-D队列中富含梭状芽孢杆菌的微生物群与胆汁酸合成和排泄的增加有关。

A).与HC和BA-IBS-D组相比,BA+IBS-D组的粪便微生物群落表现出更高的Bray-Curtis差异。在BA+IBS-D亚组中,肠道生态系统的不稳定性更大。

B).BA+IBS-D组 厚壁菌门与拟杆菌门的比值显著升高。

C)D)E).分别为转化胆汁酸的基因组和细菌的相对丰度。Alistipes和Bacteroides菌的相对丰度降低主要与cgh基因有关。编码7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-hsdh)的hdhA基因丰度增加归因于大肠杆菌、梭菌、布鲁氏菌、瘤胃球菌和梭状芽孢杆菌种类的增加。

F)G). IBS-D队列中细菌丰度与生化指标之间的斯皮尔曼相关性。梭状芽孢杆菌的属和种分类的相对丰度与粪便总胆汁酸和血清C4浓度呈正相关,与血清FGF19水平呈负相关。

显著性标记:与HC组比较(*P < 0.05, ***P < 0.005);与BA-IBS-D组比较(#P < 0.05, ##P < 0.01)。斯皮尔曼相关系数的统计学意义定义为P<0.05

3.移植富含梭状芽孢杆菌的微生物群可以诱导受体小鼠腹泻样表型,促进胆汁酸的合成和排泄,但这些作用可能不依赖于胆汁酸的回肠吸收和肝反馈抑制。

A). ABX诱导伪无菌小鼠粪便微生物区系移植的实验程序(n=6/组)。接受HC供体粪便微生物群的小鼠归为ABX+HC组,接受BA+IBS-D和BA-IBS-D供体粪便微生物群处理的小鼠分别归为ABX+BA+和ABX+BA-两组

B). 小鼠的胃肠道转运时间和粪便含水量。微生物移植一周后,BA+IBS-D微生物群受体小鼠的胃肠道转运时间缩短,粪便含水量增加。这与供体的腹泻症状相似。

C). 基于qPCR分析,供体和受体小鼠粪便中胆汁酸相关细菌的相对水平。受体的胆汁酸转化细菌的粪便特征与BA+IBS-D供体相似,拟杆菌的丰度降低,而厚壁菌门、梭菌集群XIVa和梭状芽胞杆菌的丰度升高。

D)E). 小鼠粪便总胆汁酸和血清C4水平。F). 小鼠肝脏中胆汁酸谱。BA+IBS-D微生物群受体小鼠的粪便总胆汁酸和血清C4增加,肝脏和回肠腔中牛磺酸结合的BAs(T-βMCA、TCA、TCDCA和TUDCA)升高。

G). 胆汁酸合成调节因子在小鼠肝组织中的相关基因表达。在BA+IBS-D微生物群受体中,肝脏组织中Cyp7a1mRNA和Cyp8b1mRNA的基因表达增加,但Shp和回肠组织中Fgf15的基因表达降低。

4.梭状芽孢杆菌的定植对小鼠胆汁酸合成和排泄的调控作用。梭状芽孢杆菌对胆汁酸排泄增加和腹泻样表型的影响参与了法尼醇X受体(FXR)介导的胆汁酸合成的反馈控制。

A).通过导入Clostridium Scindens菌株(C.s)或注射万古霉素(0.1 mg/mL,VAN)来调控梭状芽胞杆菌。对照(CTR)

B). 梭状芽孢杆菌处理小鼠的胃肠道转运时间和粪便含水量。与经赋形剂处理的小鼠(CTR)相比,梭状芽胞杆菌的定植显著降低了粪便稠度。万古霉素的治疗显著降低了胃肠道转运速度。

C). 基于qPCR分析,供体和受体小鼠粪便中胆汁酸相关细菌的相对水平。与CTR组相比,梭状芽胞杆菌定植小鼠的盲肠中的Clostridium

Scindens菌丰度显著增加,经万古霉素处理的小鼠盲肠中梭状芽孢杆菌的数量明显减少。

D)E). 小鼠粪便总胆汁酸和血清C4水平。在梭状芽胞杆菌定植小鼠中,粪便总胆汁酸和血清C4浓度显著增加,但经万古霉素处理的小鼠中,这些都降低了。

F). 小鼠肝脏中胆汁酸谱。牛磺酸结合的BAs(T-βMCA、TCA和TUDCA)在梭状芽胞杆菌定植小鼠中的肝脏和回肠腔中显著增加,而万古霉素处理的小鼠中则显著降低。

G). 胆汁酸合成调节因子在受体小鼠肝组织中的相关基因表达。Cyp7a1mRNA在梭状芽胞杆菌定植小鼠肝脏中表达升高,但在万古霉素处理的小鼠中显著降低。Fgf15mRNA在梭状芽胞杆菌定植小鼠回肠中表达降低。FGFR4和KLB在各组间的表达差异无统计学意义。

5.梭状芽胞杆菌衍生的胆汁酸组分对肠道FXR负反馈信号的有抑制作用。富含梭状芽孢杆菌的微生物群导致某些次级BA(例如UDCA、UDCA结合物和7-KDCA)比例较高,这些BAs可以减弱肠道FXR/FGF19信号,从而促进IBS-D患者肝脏合成和粪便排泄的增强。

A)B). 牛磺酸偶联BAs干预FXR基因及其靶基因在小鼠肝脏和回肠的表达。TUDCA降低了小鼠回肠中FXR基因的表达。TCDCA、TUDCA和T-BAs降低小鼠回肠中Fgf15表达,升高肝脏中Cyp7a1表达。4种BA处理对肝脏FXR表达均无影响,但TUDCA可增加Shp在肝脏中的表达。

C). Western blot显示FXR和FGF19在从小鼠富含梭状芽孢杆菌的微生物群中衍生出的胆汁酸-牛磺酸偶联物处理的肠细胞中的表达。T –BAs是TCA, TCDCA和TUDCA的组合。TUDCA和T-BAs都显著降低了NCI-H716肠细胞中FGF19的表达,这与体内观察结果相似。

D).FXR和FGF19基因在人体富含梭状芽胞杆菌的肠上皮细胞中的表达。E). 在FXR激动剂CDCA和梭菌衍生物胆汁酸的联合作用下肠上皮细胞FGF19基因表达的研究。CDCA和CA激活FXR并显著上调FGF19的表达。其它BAs对FXR无影响,但能有效拮抗CDCA诱导的FXR激活。

结论

这项研究在BA+IBS-D患者中发现了一种富含梭菌的微生物群,其BA转化活性不平衡。富含梭状芽孢杆菌的肠道菌群失调与BA合成/排泄增加有很强的相关性。富含梭状芽孢杆菌的粪便微生物群移植或梭状芽孢杆菌的定植显著促进了小鼠受体BA的合成和排泄。机制实验表明,梭状芽孢杆菌衍生的BAs可减弱肠道BA反馈抑制。研究人员认为,准确描述肠道微生物区系及其代谢物,结合肠道微生物区系的结构和功能特征,将提高现有IBS基于症状的治疗的精确度。

肠道微生物群调节树突状细胞抗原递呈及放射治疗诱导的抗肿瘤免疫反应

谷禾健康 原创

由于肠道菌群会影响T细胞和其他免疫细胞亚群的功能,无论是在肠道相关的淋巴样组织(GALT)内还是在肠道菌群之外,微生物群衍生的信号已被证明在多种疾病的调节及其调控中具有广泛的作用。近日,来自《The Journal of Clinical Investigation》一篇研究结果:“Gut microbiota modulate dendritic cell antigen presentation and radiotherapy-induced antitumor immune response”(肠道微生物群调节树突状细胞抗原递呈及放射治疗诱导的抗肿瘤免疫反应)指出肠道微生物群可以被调节用于改善放疗介导的抗肿瘤反应。并提示了一种新的机制,即消除产生短链脂肪酸的细菌有助于提高万古霉素和放疗介导的抗肿瘤疗效,这同时伴随肿瘤微环境的重塑以及肿瘤中抗原提呈和细胞毒性T细胞浸润的增加。

OVA:全称Ovalbumin,是一个蛋白。这个蛋白作为一个免疫学模型蛋白研究的比较清楚。尤其是小鼠的MHC I and II 展示这个蛋白的哪段多肽,都研究清楚了。比如最常用的C57B6小鼠,MHC-I展示OVA-257-264, MHC-II展示OVA-323-339.

OT-1 和OT-2是两种T细胞受体-TCR转基因鼠(都是B6)

摘要

肠道微生物群的改变会影响包括癌症在内的几种疾病的病理生理学。放疗(RT)是一种公认的根治性和姑息性癌症治疗方法,具有很强的免疫调节作用,还有诱导肿瘤相关抗原(TAA)与抗肿瘤CD8+T细胞的交叉诱导及抑癌作用。在这篇文章中,研究人员描述了肠道菌群组成对低分割放疗的影响,发现万古霉素治疗对荷瘤小鼠在放疗中引起的抗肿瘤作用有积极影响,并证明改变肠道菌群可以提高放疗效果。值得注意的是,万古霉素被耗尽的肠道细菌产生的代谢物丁酸盐消除了万古霉素的作用。研究结果表明,革兰氏阳性肠道细菌群落的改变可以引起肿瘤微环境重塑,介导引流淋巴结抗原呈递增加,并提高放疗的抗肿瘤作用。由于万古霉素是一种应用广泛且相对安全的临床药物,这些发现提高了利用这种抗生素在增强癌症患者放疗效果的可能性。

背景

低分割、高剂量放疗可产生免疫原性细胞死亡(ICD),并通过肿瘤相关抗原(TAA)交叉激活诱导适应性抗肿瘤免疫。肿瘤细胞屈服于ICD刺激抗原呈递细胞(APCs),如树突状细胞(DCs),有效地吞噬肿瘤抗原,并将它们交叉呈递给CD8+细胞毒性T淋巴细胞。这一过程最终会产生一种特异性免疫反应,能够影响远距离未受辐射的肿瘤,被称为“abscopal effect”。 RT与免疫疗法的结合最近引起了相当大的临床兴趣,因为它有可能将RT从一种用于治疗局部疾病的方式转变为一种用于治疗全身恶性肿瘤的方式。然而免疫疗法与其他方法的结合只对一小部分患者有疗效,这提出了一个问题,即是否还没有发现RT介导的抗肿瘤免疫反应的重要调节因子此外,肠道微生物群衍生的信号已被证明在调节几种疾病及其治疗中具有广泛的作用,包括癌症及其对化疗的反应。研究人员最近证明了肠道微生物群影响过继细胞疗法(ACT)的抗肿瘤效果。在这篇文章中,研究人员选择万古霉素(一种主要作用于革兰氏阳性菌的糖肽类抗生素)作为特异性干扰肠道菌群的药剂,因为口服万古霉素后吸收非常差,不会进入体循环。

实验设计

1.实验小鼠准备

6~8周龄C57BL/6雌性小鼠、6~8周龄 Ifng-KO雌性小鼠、OT1小鼠。均为购买。为了确保更换笼子时野生型和Ifng-KO小鼠之间的微生物群同质性,将来自所有使用过的笼子的鼠粪混合添加到干净的未使用的笼子中,以使动物的细菌菌群正常化。6~8周龄C57BL/6雌性小鼠在100μL PBS中双腿皮下注射1×105 TC-1或B16-OVA细胞用于建立B16-OVA黑色素瘤模型和TC-1肺癌/宫颈癌模型。未受辐射的肿瘤(abscopal)在原发肿瘤后3天注射。当肿瘤约为50mm (10-11天)时,使用XRAD320iX辐照器对每只小鼠上的一个肿瘤进行21 Gy单次剂量的RT,同时采取预防措施,通过屏蔽非辐射区域来避免辐射到肠道的任何区域。在对肿瘤进行辐射的前一天,小鼠开始接受含有万古霉素0.5g/L的饮用水。在含丁酸盐的实验中,加入丁酸盐5g/L与饮用水中,并与万古霉素联合使用。在体内CD8耗尽实验中,小鼠接受每周一次(共3个剂量)的抗小鼠单克隆CD8阻断抗体或大鼠IgG2b同型对照的腹腔注射治疗。实验中每组使用5-10只小鼠。

2.所需细胞的细胞培养及分离纯化

TC-1细胞在37°C的5%二氧化碳中增殖;B16-OVA细胞在添加了10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM中生长;树突状细胞培养,取小鼠股骨骨髓细胞,接种于6孔板中,与10 ng/mL的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(IL-4)共同孵育7d。肿瘤用600U/mL的IV型胶原酶消化,再重悬于HBSS中。从肿瘤和淋巴结中分离出的树突状细胞用CD11c MicroBead UltraPure磁珠分离。瘤引流淋巴结用胶原酶D消化再重悬于HBSS中。OT1小鼠脾细胞中的T细胞使用Pan T Cell Isolation Kit II试剂盒分离。

3.细胞定量分析及基因表达分析

使用流式细胞仪从分离的纯化CD3+T细胞中进行细胞内染色以检测T细胞极化。并用以下针对小鼠标记的单克隆抗体来对T细胞进行表型:抗CD45、抗CD3、抗CD25、抗CD4、抗CD8。酶联免疫法检测IFN-γ水平。qPCR对所选基因的表达水平进行相对定量。利用光电二极管阵列探测器和自Waters Acquity uPLC System对粪便样本中短链脂肪酸进行了定量。用液相色谱高分辨质谱分析瘤引流淋巴结和肿瘤样品中的短链脂肪酸。酶联免疫斑点实验用于测定分泌特异性抗体或细胞因子的单个细胞对特异性抗原的应答能力,及产生应答的细胞数量。从处理过的小鼠中分离出B16-OVA肿瘤,并将这些细胞与从OVA转基因OT1小鼠中纯化的OT1OVA特异性CD8+T细胞共同孵育,用酶联免疫斑点实验检测产生IFN-γ的细胞。

4. 16S rRNA测序

收集小鼠粪便样本并在-80°C下冷冻,提取DNA,针对16S基因的V4-V6区进行PCR扩增。Roche 454GS FLX仪器测序。使用QIIME管线版本1.8使用默认参数处理DNA序列数据。去除了具有2个以上不明确碱基调用的低质量序列读取或长度小于200bp的序列。使用UCLUST选择可操作的分类单元,并使用QIIME中的默认一致分配方法生成分类分配。代表序列与PyNAST比对,并用于与FastTree构建系统发育树。使用QIIME计算每对样品之间的UniFrac距离。使用非参数统计检验(Mann-Whitney,Kruskal-Wallis)比较类群的相对丰度和组内UniFrac距离。

5.统计

双尾学生t检验用于比较指定的数据集。双因素方差分析比较肿瘤进展。对数转化后的双侧t检验比较细菌分类群的相对丰度。置换多变量方差分析(PERMANOVA)评估组间样本差异性。Kaplan-Meier估计器分析随时间变化的生存率。P值小于0.05被认为是显著的。对错误发现率的校正用于对多次比较进行校正。

主要结果

1. 口服万古霉素治疗可以增强临床前的黑色素瘤和肺/宫颈肿瘤模型中低分割放疗的抗肿瘤作用。

对照(Untreated)、单独万古霉素治疗(Vanco)、单独放疗(RT)、联合治疗(RT+Vanco)

A)和C) 分别来自B16-OVA黑色素瘤模型和TC-1肺癌/宫颈癌模型的受辐射的原发肿瘤(primary tumor)。

B)和D)分别来自TC-1肺癌/宫颈癌模型的未受辐射远端肿瘤(abscopal tumor)

E)和F)分别来自B16-OVA黑色素瘤模型的受辐射原发肿瘤和未受辐射远端肿瘤。发现加入万古霉素和RT作为联合治疗产生的抗肿瘤作用都大于单独使用万古霉素或单独使用RT介导的抗肿瘤作用。对照和单独放疗的队列相比,肿瘤也出现了生长延迟。在图E中无论是否使用万古霉素治疗,RT都控制了原发肿瘤的生长。在图F中,与单独使用放疗相比,在使用万古霉素和RT治疗后远端肿瘤生长显著降低。

2.万古霉素治疗增加了因放疗产生的肿瘤细胞溶解CD8+T细胞的数量。在CD8耗尽的小鼠中,万古霉素的作用被消除。万古霉素通过一种需要细胞溶解CD8+T细胞群的机制来增强放疗介导的全身抗肿瘤效应。

A). 来自B16-OVA黑色素瘤模型的原发肿瘤以及远端肿瘤的各组的CD3+细胞浸润的免疫组织化学定量。在免疫组化分析中发现有可测量的CD3+T细胞浸润,联合治疗后CD3+T细胞浸润明显高于单纯放疗(P<0.05)

B).来自各组原发肿瘤的OVA特异性CD8+T细胞的百分比。联合治疗的小鼠肿瘤中OVA特异性CD8+T细胞(即CD45+/CD3+/CD8+/TETOVA细胞的百分比)明显高于对照组、单独万古霉素治疗组和单纯放疗组的肿瘤(双因素方差分别为P=0.0117,P=0.0028,P=0.0472)

C).CD8耗尽小鼠的肿瘤生长率。在联合治疗前耗尽小鼠内的CD8+细胞影响了联合治疗本该有的抗肿瘤作用,这表示CD8+T细胞群是介导观察到的抗肿瘤作用所必需的细胞(P=0.0120)。

3.联合治疗的抗肿瘤作用是依赖于IFN-γ水平的。万古霉素重塑了肿瘤微环境,增加了肿瘤浸润的OVA特异性CD8+T细胞的功能,而IFN-γ是增强放疗诱导的抗肿瘤免疫效应所必需的组分。

A).放疗后5天B16-OVA黑色素瘤模型中原发肿瘤的Ifng mRNA表达水平。与单独放疗组或单独万古霉素治疗组相比,联合治疗组的Ifng mRNA表达水平显著增加(P=0.0131、 P=0.0293)。

B). 放疗后5天肿瘤裂解物中 IFN-γ 蛋白表达水平的酶联免疫分析。联合治疗组的IFN-γ蛋白表达水平相比其他治疗组显著增加(P=0.0028、P=0.0179)。

C).经过一夜的Kb-OVA肽刺激后,CD8+T细胞内 IFN-γ 的表达。联合治疗小组内的CD8+T细胞的IFN-γ数量明显高于单独治疗的任何一种治疗(两两比较P<0.0 5)。

D).联合治疗对Ifng基因敲除小鼠(Ifng-KO)的抗肿瘤作用消失。(与放疗组和单独万古霉素治疗组相比,分别为P=0.5601、P=0.0911)

4. 万古霉素治疗增加了肿瘤局部TAA(肿瘤相关抗原)交叉呈递,促进了抗原特异性T细胞对肿瘤的识别

A).辐射后第一天,小鼠TDLNs(瘤引流淋巴结)中Ifnb1 mRNA表达水平。与单独放疗相比,万古霉素治疗在TDLNs中协同增强了Ifnb1基因的表达。(P=0.0032)

B).放疗后第5天,肿瘤浸润细胞CD11c+ CD103+ DCs的抗mhc1 (Kb)-SL8 OVA肽染色。联合治疗组的DCs细胞与单独放疗组相比显著增加(P=0.0396)

C). 用TDLN单细胞悬液和OT1 T细胞(1:5 TDLN细胞/ T细胞)在没有OVA肽(-OVA)或存在OVA肽(+OVA)的情况下进行IFN-γ的酶联免疫斑点试验。放疗处理5天后收集细胞。来自联合治疗的小鼠的TDLNs的IFN-γ产生细胞的数量与只使用放疗的小鼠的TDLNs相比显著增加(分别为P=0.0398和P=0.0010)

D). 将来自各治疗组的TDLN中纯化的CD11c+DCs细胞在IFN-γ 酶联免疫斑点试验(1:10DCs/T细胞)中与幼稚的OT1 T细胞共培养过夜。联合治疗增强了CD11c+DCs细胞的局部抗原提呈功能

E).与每种治疗方法处理的小鼠DCs细胞共培养过夜的OT1细胞表达IFN-γ的百分比。从联合治疗组中分离纯化的CD11c+细胞能特异性的增加未诱导的(Naive)OT1细胞中CD8+T细胞产生IFN-γ的能力。

F). 将单独放疗或联合治疗的B16-OVA模型下的小鼠肿瘤分离并与OT1细胞在IFN-γ酶联免疫斑点试验平板上共培养24小时。与RT组相比,联合治疗可增加IFN-γ的分泌(P=0.0016)。MHC1阻断抗体显著减少了产生IFN-γ的细胞,表明MHC1依赖于CD8+T细胞的激活(P=0.0073)

5. 肠道细菌产生的短链脂肪酸在体外削弱了抗原提呈细胞活性,干扰了交叉启动的活性,在体内消除在放疗中万古霉素增强的抗肿瘤作用。

A).骨髓来源的树突状细胞对照(Untreated),用100μM丁酸盐处理(C4),或用100μM丙酸和OVA(100μg/mL)处理24h(C3),然后与OT 1小鼠的T细胞一起接种于酶免疫斑点试验平板上。与对照组相比,经C4或C3处理的骨髓树突状细胞分泌IFN-γ减少,这表明C4有单独抑制树突状细胞的抗原提呈细胞功能,只经C3处理的树突状细胞也表现出对抗原提呈细胞功能的部分抑制,但与C4共同处理时不能增强C4单独诱导的抑制(P=0.0134)

B).纯化的T细胞在IFN-γ酶免疫斑点试验平板中,在有或无100μM 丁酸盐的情况下,用aCD3/aCD28刺激纯化的T细胞。在刺激过程中,C4的存在对T细胞产生IFN-γ没有明显影响。

C)含万古霉素的饮用水中加或不加丁酸盐(C4)对辐射小鼠体内肿瘤生长的影响。万古霉素增强了放疗的抑瘤作用(P=0.0307),但C4的加入消除了这一作用(P=ns)

D) 对小鼠淋巴结中OVA呈递的树突状细胞进行计数,发现用经C4处理的小鼠这一数量显着减少

E)采用qPCR检测辐射小鼠体内 肿瘤中mRNA的Ifng的表达水平。经C4处理的治疗组。万古霉素对Ifng水平的影响降低。

F).肿瘤内抗原特异性T细胞的百分比。经C4处理的联合治疗组降低了肿瘤内抗原特异性T细胞的百分比。

6. 万古霉素处理改变了短链脂肪酸浓度和细菌群落组成。万古霉素治疗优先针对革兰氏阳性细菌群体,包括丁酸盐产生菌,并降低粪便和组织样本中的短链脂肪酸浓度。

A)B)C)D).粪便、盲肠内容物、肿瘤、瘤引流淋巴结中C4短链脂肪酸浓度。万古霉素显著降低了C4短链脂肪酸浓度。

E).细菌分类群丰度热图。白色方块表示样本中没有观察到的分类群。万古霉素处理引起了细菌群落组成的重大变化,包括大多数革兰氏阳性分类群的消失,并对革兰氏阴性分类群产生了一些影响。

F).细菌群落多样性。万古霉素治疗组中发现的细菌分类群数量比对照组减少了4倍(P=0.01)

G).未加权UniFrac距离的细菌群落差异。万古霉素处理后细菌群落的组成发生了一致的变化,对照组和万古霉素治疗组内样本距离显著低于组间距离(P<0.001)。

H). 已知含有产生丁酸的细菌种类的分类群的相对丰度万古霉素治疗消除了产生短链脂肪酸的梭状芽孢杆菌2个主要科:瘤胃球菌科和毛螺菌科(两个科均P<0.01)

结论

这些数据表明肠道微生物群可以被调节用于改善放疗介导的抗肿瘤反应。并提示了一种新的机制,即消除产生短链脂肪酸的细菌有助于提高万古霉素和放疗介导的抗肿瘤疗效,这同时伴随肿瘤微环境的重塑以及肿瘤中抗原提呈和细胞毒性T细胞浸润的增加。总之,去除对万古霉素敏感的细菌可以增强RT的抗肿瘤活性,这具有重要的临床意义。基于这些发现,研究人员建议以患者特有的方式使用肠道调节,以便将RT的局部抗肿瘤效应转化为可靶向转移性疾病的全身反应。

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