微生物16s科研测序分析服务

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16S rRNA :

16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因,长度约为1542bp,其分子大小适中,突变率小,是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。

16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区,保守区序列反映了物种间的亲缘关系, 而可变区序列则能体现物种间的差异。 

16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列, 16s rRNA是由16s rDNA转录来的 , 一般扩增检测和分析的对象都是16s rDNA

16s测序:

16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度系统进化、功能预测以及微生物与环境互作关系等。

适合样本类型:

粪便、动物肠道内容物、皮肤、组织、痰液、血液、唾液、牙菌斑、尿液,阴道分泌物、发酵物,瘤胃,废水,火山灰,冻土层、病害组织、淤泥、土壤、堆肥、污染河流,养殖水体、空气等有微生物存在的样本都可以用于16s测序分析

参数介绍:

取样:人/动物粪便,口腔,唾液,阴道,尿液,皮肤等可提供免费常用保存运输取样盒,其他样本可直接送样
测序平台:Illumina Novaseq
测序区域:V4,V3V4
测序数据量:10万 reads(V4); 5万 reads(V3V4)
周期:1-2周(V4);2-4周(V3V4)

送样建议:

粪便样本包括肠道内容物:我们提供专门取样盒(免费)。人、大鼠、猪等,直接用取样盒里的棉签沾取约绿豆至黄豆大小的粪便至粪便保存液即可。颗粒状粪便,如小鼠,可根据粪便大小取几颗至粪便保存液即可。

备注:取样盒里有详细的粪便取样操作说明。

人或者动物其他部位:例如口腔,鼻腔,阴道等:我们提供专门取样盒(免费)。取样方式也是用棉签沾取相应部位菌至保存液。但是根据研究项目,取样部位以及方式略有不同,这个不能一概而论,特殊项目最好单独咨询便于提供最佳方案。

土壤,底泥水,污泥:需要5-10g的鲜样,土壤,底泥样若有沙石等需要先过筛后再送样。

水体样,包括河流,湖畔,自来水等:需要先过滤膜,根据水体中含菌量选择一定体积的水体过滤膜,如自来水,一般需要5-15升水过滤膜,然后将滤膜送过来即可。

DNA:浓度不低于5ng/ul, 总体积不少于40ul。

报告内容:

部分分析图表展示(高级图表免费):

合作流程:

常见问题:

1、应该做多少个生物学重复?

关于生物学重复的数量问题,这里给一个大致的范围,当然如果各位有钱,请自行忽略这个问题。

一般来说,粪便样本(包括人、动物等,也包括肠道内容物)建议5-25个生物学重复。其他诸如土壤、水体、DNA等建议3-12个生物学重复。

2、可变区如何选择?

目前16s测序主要的测序区段包括V4、V3V4,V1V2,V6,此外还有全长等不同的区段选择,不同可变区或全长由于引物的不同以及不同种属相应区段内的变异多样性差异,对菌属的丰度评估会有一定的差异。

主流的可变区选择是V4区V3V4区,V4区长度为256bp左右,加上两侧引物长度为290bp左右,使用双端2x250bp或2x150bp可以测通,此外如454、life、Illumina Hiseq 4000的测序平台读长也可以主要涵盖该区段读长。

例如采用Illumina Hiseq测序平台对该项目进行双端测序(Paired-end),测序得到了fastq格式的原始数据(样本对应一对序列S_1.fastq和S_2.fastq)。再配对拼接成单条序列。其引物通用性相对是所有可变区中最高的,大量的大规模菌群调查研究都采用V4区作为检测区域,包括人体菌群研究如:HMP,肠道菌群如美国肠道计划AGP,欧洲的FGFP等,以及全球土壤菌群调查,目前仍然是国际研究中使用最广泛和认可的检测区域。

Illumina的Miseq提供了长达2x300bp以及Hiseq2500和最近的NovoSeq提供有2x250bp的测序方案。为进一步利用读长,目前有相当一部分研究选择V3V4区,该区段长度在460bp左右,相较于V4度多出了V3区段约100bp左右的片段,在少部分菌属中可以增加一定分辨率。

经过对比,V3V4区的检测结果和V4区在绝大部分菌属中的丰度一致,但由于引物不同,在少量菌属中丰度会有不同偏向,V3V4从OTU层面上并未发现较V4区有明显增加。引物的选择和提取、储存方法是影响菌群检测丰度构成的主要因素,不同研究之间的比较需要考虑到实验方案的一致,相同的方案可以直接比较。

以下是同一批小鼠粪便样本V4(10万 clean reads)和 V3V4(5万clean reads)测序数据比较:

原始序列数据

V4(下表)

V3V4(下表)

以上两表是对原始序列数据进行统计,表中可以看出有效序列tags、高质量序列clean_tags、OTUs数量  V4区都远高于V3V4区。V4区测序获得下机数据在13万条左右,V3V4区测序获得的下机数据在5万条左右。

α多样性指数比较

V4(下表)

V3V4(下表)

以上两个表分别是对alpha多样性指数计算的结果比较。

在前面我们也了解过,chao1 指数和ace指数是用来评估样本中所含OTU 数目的指数。从chao1 指数和ace指数可以看出,用 V4测序获得的结果要明显大于V3V4的结果。这是因为V4测序通量测序深度更好,每个样下机的测序数据可以到10万条以上,一般在13万条左右,所以经过序列比对获得的OTU数目更多,相比较用V3V4测序每个样下机的数据大约在4到5万条左右,经过序列比对获得的OTU数目相对少一点。

shannon指数和simpson指数是用来评估菌群的丰富度和均一度 的。从shannon指数和simpson指数,用V4和V3V4测序指数相差不大,或V4比V3V4略高一点,证明两种测序之间菌群的丰富度多样性和均一度较接近。

物种主要构成比较

V4(下表)

v4属水平前10个物种构成:lactobacillus、akkermansia、helicobacter、allobaculum、desulfovibrio、adlercreutzia、odoribacter、bacteroides、prevotella、[prevotella]

V3V4(下表)

V3V4属水平前10个物种构成:lactobacillus、adlercreutzia、flexispira、allobaculum、desulfovibrio、prevotella、odoribater、oscillospira、[prevotella]、bacteroides

从前10个物种构成来看,有8个是相同的,物种的主要构成基本一致,测序的稳定性较好。从种类来看,V3V4测到的属水平个数稍多一点。

各分类水平鉴定到的物种种类比较

V4(下表)

V3V4(下表)

以上两张表代表了每个样本在各分类水平上鉴定到的物种种类数。从整体上来看,分别用V4和V3V4测序得到的数据,在各分类水平上鉴定到的物种个数相对比较稳定和接近,(尤其在目水平和科水平上)。用V3V4测序获得的物种数比V4相对稍多一点,但是在水平和水平则反而是V4更丰富,最终鉴定到的物种个数也跟该样本的测序质量有关。

合作文章:

解决了从前期准备到怎么看报告、如何利用数据等问题,包括个性化图表的制作,离发表文章也就不远了,就像长跑已经能看到终点。

但仍然会有零星小问题,如何 “跑赢最后一公里”?

我们能做的就是为大家创建一个良好的交流环境,提供的交流平台致力于用最少的时间,最高效地解决问题。

1

某老师项目,样本:63个环境样本,检测时间:2018年7月,项目数据文章已发表在环境领域顶级SCI期刊(ENVIRONMENT INTERNATIONAL),文章介绍如下:

平台上相互交流,提出需求,共同完成。

项目进度一目了然。所有的任务完成就勾选,唯独售后一直为你开放,直至发表文章。

2

某老师项目,样本:DNA,检测时间:2018年9月,项目数据文章已发表环境顶级SCI期刊ENVIRONMENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY,文章介绍如下:

从收到样本,项目系统就已开始记录。

随时随地方便交流。

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样本:人粪便,检测时间:2018年5月,项目数据文章已发表在SCI期刊Frontiers in Physiology,文章介绍如下:

科研路漫漫,谷禾与你常相伴

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点击下载报告解读

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