掠食性细菌作为活的抗生素对抗感染

掠食性细菌作为活的抗生素对抗感染

谷禾健康

后抗生素时代,当人类对某细菌无可奈何时,何不让细菌对抗细菌?

抗生素已经彻底改变了现代医学,但其有效性受到多重耐药细菌传播的威胁,而目前尚无有效的治疗方法。抗生素耐药性(AMR)通常由不必要的抗生素使用引起,是一种严重的全球健康和经济威胁。

特别值得关注的是,抗生素生产线不断减少,开发中的抗生素数量有限(数量和多样性都有限),以满足当前和预期的患者需求。此外,科学和经济挑战促使许多大型全球制药公司停止其抗生素开发计划,使得对新的感染控制方法的需求更加迫切。因此迫切需要用于治疗革兰氏阴性感染的新疗法。

最近一种潜在的方法是使用活的掠食性细菌。由于蛭弧菌Bdellovibrio bacteriovorus广泛存在于自然界中,而目前也尚没有与蛭弧菌相关的疾病报告,科学家认为有可能围绕它们建立一种安全无害的生物治疗手段,去抗击病原菌的感染。但毕竟蛭弧菌本身也是一种细菌,人和动物的免疫系统如果发现它们,会怎样对待这些“友军”?会增强对蛭弧菌的抵抗力吗?

本文讨论了支持掠食性细菌替代抗生素的可行性的基础科学。

· 掠食细菌—蛭弧菌B. bacteriovorus

蛭弧菌 Bdellovibrio bacteriovorus是寄生于其他细菌(也可无寄主而生存)并能导致其裂解的一类细菌。它虽然比通常的细菌小,能通过细菌滤器,有类似噬菌体的作用,但它不是病毒,确确实实是一类能”吃掉”细菌的细菌。

1962年首次发现于菜豆叶烧病假单胞菌体中,随后从土壤、污水中都分离到了这种细菌。根据其基本特性,命名为Bdellovibrio bacteriovorus

其中,” Bdello”一词来自希腊字,是”水蛭”的意思,”vibrio”意为”弧菌”,而种名”bacteriovorus”是 “食细菌”的意思。“捕食”的对象正落在多出产致病菌的细菌类群——革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、志贺氏菌等)中。

蛭弧菌的掠食生活方式

B. bacteriovorus通常会持续3-4 h消耗其革兰氏阴性细菌的猎物。这种掠夺性生命周期是一个复杂的过程,在分子水平上已经开始被理解。最初,B. bacteriovorus识别,附着并进入猎物细胞,对其进入口进行加固,穿越和重新密封。侵袭伴随着猎物细胞的圆形化,稳定的胶质细胞的形成以及猎物细胞的死亡。

同时,通过依次释放一组酶,B. bacteriovorus消化了猎物,并利用所形成的养分库长出了长丝。 单个细丝的同步分裂会产生奇数或偶数个子代细胞,每个子代细胞会产生鞭毛或滑行引擎(取决于条件),然后从死亡的猎物细胞中爆发并开始寻找新的猎物。 根据猎物细胞的大小,以及猎物细菌内部可用的养分,每个细胞平均释放4–6个B. bacteriovorus后代。 尽管被认为是专性的捕食性细菌,但B. bacteriovorus仍可转变为不依赖宿主的生活方式,可以在全培养基上的无菌生长。

为什么蛭弧菌是掠食性细菌?

B. bacteriovorus生命周期和基因组的一些特征决定其成为一种潜在的抗革兰氏阴性细菌病原体的治疗剂。在捕食生命周期中,被捕食细胞在短时间内(<30分钟)被杀死,因此,被捕食者必须快速表达防御手段,以抵抗捕食,这是尚未见到的。

与某些抗生素不同,某些抗生素可引起一连串事件,导致细菌自溶和炎症分子释放,B. bacteriovorus细菌捕食不会导致猎物的最初溶解,因为在溶解之前,猎物的内容物是从稳定的蛭质体结构内消耗的。此外,没有单一的受体识别和附着猎物。在猎物入侵后,在数量和功能多样性方面,具有潜在遗传冗余的猎物破坏酶都出现了上调,这表明简单的猎物对B. bacteriovorus捕食的抵抗不太可能发生。

蛭弧菌对宿主会有哪些影响

为了实现B. bacteriovorus的治疗潜力,必须在生物学相关系统中充分表征其对革兰氏阴性病原体的捕食性。 这种表征还必须同时解决诸如宿主反应,毒性,炎症,组织损伤或伤口愈合抑制等问题。

其中一些问题已通过体外细胞培养和体内动物模型解决,评估了掠食性细菌对免疫系统各个组成部分以及整个宿主的影响。 许多人类细胞系,包括角膜-上皮细胞,血液单核细胞,巨噬细胞,肾上皮细胞,肝上皮细胞和脾单核细胞,已经暴露于不同的捕食性细菌中,测定了不同暴露的时间范围、持续时间(2至24小时),下促炎和抗炎细胞因子水平。

已知可响应细菌外膜脂多糖(LPS)而被刺激的细胞因子,是宿主抵抗病原体所必需的。 这些研究表明,尽管B. bacteriovorus在免疫反应方面并不沉默,但暴露后产生的炎性细胞因子水平可忽略不计或很低。 B. bacteriovorus不像同时检测到革兰氏阴性病原体那样具有免疫刺激性,这可能部分是由于其独特的脂质A结构以及它拥有带鞘的鞭毛

额外的细胞活力成像,细胞毒性测量以及暴露于掠食性细菌后对动物和人类培养细胞形态变化的评估初步表明,B. bacteriovorus对人细胞无毒,尽管还需要进行更多的研究。  Raghunathan及其同事使用人类巨噬细胞系(U937细胞)研大量掠食性细菌能够在细胞内存活长达24小时,从而确定了一段持久性和潜力捕食细胞内病原体的能力。

另外,通过在药理学抑制剂存在下进行吸收实验,证明了宿主肌动蛋白细胞骨架的作用及其在B. bacteriovorus吸收中的重排。B. bacteriovorus最终通过吞噬体途径被转运,这是由于它们靶向酸性液泡。 鼠巨噬细胞系中的类似观察结果支持了这一点,并且两者都是考虑给予B. bacteriovorus作为治疗剂的重要观察结果。 这些研究说明了B. bacteriovorus靶向细胞内病原体的潜力,而许多抗生素和其他生物控制剂(例如噬菌体)可能无法利用这些细菌。 尽管后一点正在积极研究中。 这些体外细胞实验以及下面描述的动物模型,是研究功效,缺乏毒性和潜在捕食者生物利用度的重要步骤。

早期体内宿主反应集中于B. bacteriovorus在吸热和放热脊椎动物肠道中的生存能力。研究了在鲶鱼(点状黄疸)、豹蛙(林蛙)、小鼠和兔子的肠道中实验投喂的B. bacteriovorus菌株MS7的生存能力和持久性,表明在接种后24-48小时内,B. bacteriovorus几乎没有恢复。通过饮用水给小鼠提供的3天B. bacteriovorus不能从肠道中完全恢复。同样,在注射后24小时左右,无论是使用无菌培养物,还是同时注射B. bacteriovorus,都没有或很少从兔回肠环中发现B. bacteriovorus。

B. bacteriovorus对动物没有致病性。这些研究已经扩展到包括评估宿主发病率、组织病理学、促炎和抗炎细胞因子水平、体内捕食性细菌传播以及长期评估大鼠、小鼠斑马鱼幼虫模型的一般健康状况。总的来说,在一系列动物模型中以及通过多种给药途径在体内给药已经证明,它们不会损害这些动物的健康

蛭弧菌捕食范围:体外和体内捕食

事实证明,B. bacteriovorus对多种猎物具有体外功效,包括与肠道,口腔,伤口和眼部感染有关的细菌和生物制药。B. bacteriovorus成功地减少了实验室缓冲液和人血清中的病原体数量和生物膜中的猎物,而生物膜通常是抗生素治疗的重大阻碍。 重要的是,已经显示出许多具有多重耐药性的人类临床分离株容易被B. bacteriovorus捕食。 该清单包括许多需要新治疗的E(S)KAPE病原体,包括表达mcr-1的革兰氏阴性大肠菌素抗性分离株。 体外研究还调查了成功捕食所需的B. bacteriovorus与猎物的比率; 如果抗生素不能治疗感染,则作为将来的体内实验和临床的重要考虑因素。

尽管实验性体外系统,尤其是实验室缓冲液或富含生长培养基的环境可能显示出掠食性功效,但它们不足以替代体内治疗的复杂性,而体内治疗必须考虑到宿主的免疫反应以及病原体的生存策略。 动物感染模型在评估B. bacteriovorus在体内捕食革兰氏阴性细菌的能力以及解决此类宿主对宿主的任何反应(以及由此产生的安全性)方面都发挥了作用,越来越多的证据表明,至少在动物中,以及将来将这种掠食性细菌用于治疗应用的可行性,将其扩展到人类。

一项对感染肠炎沙门氏菌p125109的鸡群实验表明。 在B. bacteriovorus处理后的三天内,与对照动物相比,经细菌性芽孢杆菌处理的禽类的盲肠中沙门氏菌数量显着降低。 此外,与对照动物的许多盲肠相比,经B. bacteriovorus处理的禽中盲肠的外观是正常的。

进一步的重要研究表明B. bacteriovorus能成功地在体内捕食病原体。 使用大鼠模型,Shatzkes及其同事证实B. bacteriovorus可以治疗肺炎克雷伯菌感染的大鼠,显示与对照组相比,细菌性芽孢杆菌治疗的动物的病原体负担明显减少。 另外一项通过向大鼠尾静脉注射引发疾病的败血病模型。 B. bacteriovorus不能显着减少感染。 这是首次将B. bacteriovorus直接施用到血流中,并且是评估掠食性细菌清除血流感染能力的重要一步。

斑马鱼幼虫的物理特征以及与人类的广泛基因组同源性包括良好的理解,充分发展的免疫系统和光学透明的性质,非常适合于创新的活荧光显微镜检查。

诺丁汉大学伊丽莎白·肖克特和伦敦帝国理工学院的塞尔吉·莫斯托维小组用模式生物斑马鱼做了研究。

接下来,研究者放心地开始了“以菌治菌”环节。他们用一种叫福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)的病原菌来感染斑马鱼——所选取的菌株同时对链霉素与羧苄青霉素具有耐药性。他们向斑马鱼的后脑先接种了致死剂量的志贺氏菌,再注射蛭弧菌。由于这两种细菌被带上了不同颜色的荧光蛋白标记,研究者得以观察它们的数量和分布变化情况。他们发现,相比于对照组,注射了蛭弧菌的斑马鱼后脑内志贺氏菌大量减少,被感染的斑马鱼在72小时后的存活率也更高。在更高分辨率的显微观察中,研究人员也找到了蛭弧菌在斑马鱼体内和体外都能够侵染并杀死志贺氏菌的证据。

研究者认为,在抗击志贺氏菌感染这件事上,蛭弧菌和斑马鱼免疫系统其实某程度上达成了巧妙的“配合”:蛭弧菌对志贺氏菌的“捕食”开始得非常迅速,能够在感染初期控制住志贺氏菌繁殖的势头,帮免疫系统减轻应对的压力。而等到大批白细胞赶来时,蛭弧菌已经饱餐过一顿,收拾残余志贺氏菌的工作,免疫系统自己也能完成好。

1897年,日本细菌学家志贺洁发现了志贺氏菌(Shigella).

作为杆菌性痢疾的祸首,这类细菌每年导致约1.63亿严重痢疾病例,并夺走超过100万人的生命,可谓是最臭名昭著的病原菌之一。志贺氏菌是一类革兰氏阴性的杆状细菌,可以制造出能杀死细胞的志贺毒素。

在最近的一项研究中,Russo及其同事证明了B. bacteriovorus 可用于显着减少实验感染小鼠肺部的鼠疫杆菌(yersinia pestis)数量。 但是并非所有的体内B. bacteriovorus 施用都已成功地减少了病原体数量。 尽管在先前的研究中使用组织培养模型在体外取得了令人鼓舞的结果,但给予B. bacteriovorus 治疗经牛莫拉氏菌(Moraxella bovis )感染的牛犊是牛角膜结膜炎的病原体,未能导致角膜溃疡形成的显着改善。

从上面的大量研究可以看出,越来越多的证据表明Bdellovibrio sp持续非病原性且足够长以具有治疗活性,对免疫微生物群的不良影响极小,并且不成为正常宿主微生物群的一部分。 无论是成功的还是不成功的体内试验,如本文所述,对于评估哪些适应症,给药途径(局部给药还是静脉给药)和感染部位都至关重要,在的掠食性细菌给药将最有效地对其进行评估。

了解蛭弧菌捕食与宿主反应之间的关系

治疗后动物和人类感染的康复结果取决于多种因素的相互作用,例如患者的免疫系统和总体健康状况包括肠道菌群,病原体的性质以及治疗的类型和提供方式。 在将体外和体内细菌捕食视为宿主反应的独立实体时,未捕获革兰氏阴性病原体的细菌捕食与宿主反应之间的相互作用和协同作用。

该模型表明,B. bacteriovorus在非致病性条件下持续了足够长的时间,可以在实验性感染期间有效地捕食志贺氏菌。 在这项工作中,用显微镜观察了与宿主免疫系统细胞的相互作用。 此外,这项研究发现B. bacteriovorus的最大治疗益处来自细菌捕食和宿主免疫系统的协同作用。 给药后,掠食性细菌种群最终会通过与宿主免疫系统的相互作用而清除,实际上这种清除可能对(自我)限制治疗有益。

与其他微生物抗菌方法的比较

在考虑治疗掠食性细菌感染时,研究人员可以向噬菌体研究和临床界寻求动力,以应对从体外到临床环境的挑战。 尽管在一些国家已经使用了多年,但最近的一些引人注目的病例已证明在临床环境中成功施用了噬菌体鸡尾酒来治疗耐药性感染。

从表面上看,B. bacteriovorus和噬菌体具有许多潜在的生物防治剂特性。 它们都表现出掠食性或寄生性生命周期,它们是自我复制和自我限制的,仅在存在易感宿主或猎物时才持续存在,并且在裂解性噬菌体的情况下,两者都具有广泛相似的生命周期。 当将它们引入动物和人类体内时,它们似乎也几乎没有副作用。 但是,两者之间存在一些显着差异,这可能会限制和区别它们在某些适应症中的使用。

首先,与噬菌体相比,B. bacteriovorus无疑是“活的”并且具有代谢活性,噬菌体是惰性颗粒,直到它们通过特定受体与宿主建立接触。 这可能对B. bacteriovorus既有好处,也有缺点,因为它可能使用需要能量的过程,例如噬菌体无法获得的主动“定位”猎物。 但是,如果未发现猎物,则B. bacteriovorus不能进入休眠状态,并且会死亡。 相反,噬菌体可以在不消耗任何能量的情况下保持“生存”许多年,但无法主动寻找宿主。 他们必须依靠随机概率遇到宿主,并通过比B. bacteriovorus更快速地复制并且具有更大的爆发来补偿这种相对的低效率。

先前对伤寒沙门氏菌大肠杆菌的研究表明,噬菌体并不总是消除其宿主的全部种群。B. bacteriovorus和噬菌体的复制都可能受到最低宿主/猎物阈值的限制,在此阈值之下,它们无法无限期地维持其种群。 然而,这可能在治疗上是有益的,因为通常不需要消灭病原体即可显着减轻或完全缓解疾病症状。

单个噬菌体的宿主范围通常限于一个菌种或一个或两个密切相关的菌种内的许多菌株,这使得其种群的维持比B. bacteriovorus更具挑战性。需要考虑宿主特异性和细菌对噬菌体耐药性的快速获得;与之相比,广泛的细菌捕食范围和缺乏掠食性细菌的简单抗药性机制使其具有优势。 有趣的是,最近有科学金工作强调了将掠食性细菌与噬菌体一起使用的组合能力。 噬菌体敏感性和Bdellovibrio捕食的独立动力学使得在某些条件下更大程度地杀死了大肠杆菌

当被引入到吸热动物体内时,B. bacteriovorus和噬菌体都将面临挑战性条件。 与细菌噬菌杆菌相比,噬菌体在遇到苛刻的物理和化学条件(例如更高的温度和极端的pH值)时更有可能具有弹性。噬菌体可以穿过血脑屏障,但如果不进行故意修饰,可能无法在细胞内持续存在。 确实,以前的研究表明,当它们进入血液时,它们可以被网状内皮系统迅速隔离。 至少在某些情况下,可以通过在哺乳动物中连续传播噬菌体来重新分离能够在哺乳动物中长时间循环的噬菌体来应对这一问题。 众所周知,噬菌体能够通过普遍的和专门的转导在细菌之间转移DNA,这是一种不适用于B. bacteriovorus的风险。可以通过仔细筛选噬菌体基因组以除去具有整合能力的特定噬菌体和其他可能带有编码细菌毒素或其他毒力因子的基因的噬菌体,来减轻这种风险。

Bdellovibrio和噬菌体的治疗应用需要两者的工业生产。 每种噬菌体都面临着不同的挑战,因为噬菌体的产生数量更大且速度更快,但是它们的产生可能需要大量培养病原性宿主细菌。 相反,可以使用非病原性的Bdellovibrio宿主,例如大肠杆菌和恶臭假单胞菌,但是需要将它们与最终的治疗制剂有效地分开。 另外,维持Bdellovibrio制剂的生存力可能比噬菌体更具挑战性。 有趣的是,从生产这些生物防治剂的治疗制剂的技术挑战中可以学到什么教训,以及确定将它们一起用作治疗剂是否可以实现任何协同作用。

蛭弧菌对宿主反应的影响将基础科学转化为应用,以应对AMR的挑战

最近从事DARPA病原体捕食计划的一些研究人员,已经改变了研究领域,并证明了使用活的全食性B. bacteriovorus在体外和体内杀死广泛的抗药性(AMR)临床病原体的潜力。体内进一步支持其作为治疗手段的承诺。要被视为可靠的治疗选择,需要来自未来的人类试验的有力证据表明,这种治疗有效,至少在特定情况下,对患者没有(或最小)负面影响,并且与现有治疗相比具有一定优势

研究人员需要证明其临床价值并衡量治疗效果,以说明对患者的益处。但现在是否拥有所需的所有信息? 如果没有,还需要解决什么?

根据体内动物模型,研究人员需要在人类身上进行安全性和有效性试验。动物模型是至关重要的,但也有局限性,迄今为止的协议管理捕食性细菌之前,或不久之后,病原体的兴趣。需要对更确定的感染进行调查,并支持确定捕食性细菌的剂量范围(以及可能的病原体数量)、剂量数量和治疗感染所需的时间表。也许令人惊讶的是,在感染和康复期间,对人体不同部位病原体实际数量的了解仍然是一个非常发展的领域。大规模捕食者生长和纯化方法的发展目前受到限制,需要扩大更大规模的安全性和有效性试验。感染治疗是时间关键,因此评估稳定性,长期储存和提供一个活的,掠夺性的积极治疗需要进一步的工作。

结 语

总之,用另一种细菌来治疗细菌感染似乎是反直觉的,离使用它们作为药物改善患者的生存状况还有一段时间。虽然蛭弧菌对其他病原的杀伤能力还有待验证,而且考虑到人体内大量必要有益的共生菌群,如何避免大量蛭弧菌“伤及无辜”也是一个值得关注的问题。需要进一步的工作来评估捕食性细菌从给药部位的传播,并确定暴露对宿主或其驻留生态位微生物群的长期影响。

但是我们相信,未来以细菌对抗细菌治疗某些感染会是一条后抗生素时代新的机遇。

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