宏基因组科研测序分析服务

研究背景

近年的研究热点集中于环境和生物体相互作用的微生物群体，而大量复杂的微生物群体存在培养困难，构成复杂（包括细菌、古菌、真菌、原生生物、病毒甚至小型真核生物）。 为了克服传统纯培养技术的不足，充分挖掘此类未培养微生物所蕴涵的巨大潜能，发展了 宏基因组学的研究方法，该方法绕过纯培养技术来研究微生物的多样性及功能。

产品介绍

宏基因组测序也就是shotgun测序， 以环境中所有微生物基因组为研究对象，通过对环境样品中的全基因组DNA进行高通量测序，获得单个样品的饱和数据量，基于denovo组装进行微生物群落结构多样性， 深度全面的了解微生物群体的构成，甚至获得单个菌株的完整基因组，在这些高质量基因组序列的基础上可以更加精细化开展其基因构成、分布，次生代谢合成，抗生素耐药基因及其演化， 微生物群体基因组成及功能，特定环境相关的代谢通路等分析 甚至菌株的生态演变和水平转移事件等研究。 进一步发掘和研究具有应用价值的基因及环境中微生物群落内部、微生物与环境间的相互关系。

此外对于缺乏深度研究和高质量参考基因组的样本，如土壤和特殊环境下的样本，宏基因组获得的较为完整的基因组不仅可以丰富参考基因组数据库，同时可以提供更加准确的物种分类。

建库流程

建库流程
1)    将检测合格的基因组DNA样品用酶切随机打断成400bp-500bp的片段并末端修复加A；
2)    将测序引物连接到DNA片段上；
3)    进行PCR扩增引入测序index
4)    对构建的文库进行质量检测；
5)    将质量检测合格的文库上机测序。

样本类型

粪便、动物肠道内容物、皮肤、组织、痰液、血液、唾液、牙菌斑、尿液，阴道分泌物、发酵物，瘤胃，废水，火山灰，冻土层、病害组织、淤泥、土壤、堆肥、污染河流，养殖水体、空气等有微生物存在的样本都可以用于宏基因组测序。

参数介绍

测序平台：Illumina Novaseq，PE150，默认：5-6G/样，每增加一个G加100元。

项目周期

周期：2-3周

样本类型

粪便、动物肠道内容物、皮肤、组织、痰液、血液、唾液、牙菌斑、尿液，阴道分泌物、发酵物，瘤胃，废水，火山灰，冻土层、病害组织、淤泥、土壤、堆肥、污染河流，养殖水体、空气等有微生物存在的样本都可以用于宏基因组测序。

报告内容（网页结题报告，在线交互）

报告示例图表

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分析案例

 < 案例一 > 肥胖患者的肠道微生物组

第一项研究是关于肥胖患者减肥手术后的宏基因组和代谢数据的分析研究。

研究纳入了61名严重肥胖的受试者，他们是可调节胃束带术（AGB，n = 20）或Roux-en-Y胃旁路术（RYGB，n = 41）的候选人。减肥手术后1、3和12个月随访24名受试者。使用宏基因组学测序和LC-MS分析肠道菌群和血清代谢组。另外纳入了10人和147人分别作为宏基因组和代谢检测的验证集。

研究思路

这样的设计分别有什么作用？

第一点持续的动态采样可以获得持续变化情况，尤其是在一个特定变化后（减肥手术），持续的最终采样有助于确认菌群的变化出现和特定事件或生理病理变化的前后，尤其是在确定因果中有重要帮助。

第二点获得多维的数据有助于帮助我们全方位的了解菌群变化背后的带来的生理和代谢变化以及之间的关联。

第三点独立验证集的存在将大大增强研究的可信度，尤其是该研究纳入的样本量并不多，无法全面有效的控制无关因素，使得很多统计检验的效力无法显现。这也导致该研究仅在基因总量和多样性上获得较好的重复效果，而更多的菌群精细特征以及具体基因和代谢通路没有得到深入分析。但是独立验证集保证了核心结论的可靠性和重复性，这点在宏基因组研究中非常重要。

从下图可以看到研究针对样本的总基因多样性水平与生理指标和疾病状态进行相关性分析和组间差异分析，图中给出了显著相关和差异的指标。

使用的统计检验方法是pearson和sperman相关和t-test以及Kruskal-Wallis检验。

下图是研究将MAGs与各项生理和代谢值进行相关性分析后的热力图。该研究由于测序较早，并未独立拼接，而是直接使用了之前一项人类肠道菌群研究获得组装基因组参考序列。

进一步研究分析了术后特定变化模式的MAGs以及它们与代谢生理指标的相关性，见下图：

上图的研究可以通过pattern search的方法寻找特定变化模式的菌种。

研究的主要结论发现是低基因丰富度（LGC）存在于75％的患者中，并且与躯干脂肪质量和合并症（2型糖尿病，高血压和严重程度）增加相关。LGC改变了78种宏基因组种（MGS），其中50％与不良的身体成分和代谢表型有关。九种血清代谢产物（包括谷氨酸盐，3-甲氧基苯基乙酸和L-组氨酸）和含有参与其代谢的蛋白质家族的功能模块与低MGR密切相关。术后一年，BS会增加MGR，但尽管RYGB患者的代谢改善比AGB患者大，但术后一年的MGR仍然很低。

Tips ：

总体而言该项研究可以使用浅宏基因组来完成所有测序和分析，进一步扩大样本数量，如果能同时获得人的转录组数据甚至能更加明确的找到菌群变化与特定代谢通路的关联关系。

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< 案例二 >  食物与人类肠道微生物组

第二项研究是Dan Knights实验室发表在Cell Host & Microbe,2019的一篇针对34个人17天每日饮食和菌群变化的相关研究，试图揭示日常食物选择与人类肠道微生物组组成之间的精细关系。

可以看到，研究同时记录了粪便样本的菌群宏基因组和每日的饮食记录。研究的核心在于将每日饮食的食物通过营养构成进行量化，并构建类似物种进化树的食物物候树。

此外由于有每日的数据，可以通过前一日的食物与第二日的菌群数据进行时间序列分析，构建食物与菌之间的关联以及时间相关性。

最后基于菌群数据和前一日饮食来构建模型预测判断后一日的菌群状态，帮助我们了解食物对于个体菌群的影响因素并实现定量和预测。

研究中对数据的处理过滤标准如下：删除所有具有低读取计数（每个样品<23,500个读取）的样品。物种级别的分类表仅限于研究对象中至少存在25％的研究日，且在10%的研究样本对象中发现的那些物种。

最后，相对丰度<0.01％的稀有物种被丢弃，将物种数量限制为290个注释。将得到的分类表汇总到较高的分类级别（即属，科，门等），以进行下游分析。

菌群和饮食以及营养构成的堆叠图很好展现了变化和对应。

下面这张图很好的显示了饮食食物的变化与菌群变化之间的时间变化关系：

下面这张图通过对每个人单独进行菌属与食物的Spearman相关，展现了菌与食物之间的关联的个体化差异，在特定菌属对应相同食物不同人会出现完全不同方向的变化，这也正是这项研究所揭示的，这种关联关系的复杂性。

Tips ：

本研究虽然有大量样本，但并未进行组装，而是直接使用了Refseq的细菌完成基因组序列作为参考。研究由于样本数量众多，测序深度也很有限，类似研究也可以使用浅宏基因组方式完成。

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  < 案例三 >  类风湿关节炎的人群肠道微生物组 

接下来的一个研究是比较典型的宏基因组组装并与疾病进行关联分析的案例，研究的是类风湿关节炎人群的肠道微生物组的全基因组关联研究。

研究使用较高深度的宏基因组shotgun测序（每个样本平均13 Gb）对日本人群（病例 = 82，对照 = 42）进行了RA肠道微生物组的MWAS分析。MWAS由三个主要的生物信息学分析渠道（系统发育分析、功能基因分析、途径分析）组成。

使用了之前研究中6139个完成拼接日本人肠道宏基因组作为参考序列以及其他几项研究的参考基因组，在过滤部分种过多的基因组之后，最后一共使用了7881个参考基因组。

将QC后的序列直接比对到参考基因组，并根据基因组长度计算对应物种的相对丰度。

基因方面选择denovo组装，使用MegaHIT，然后再contig上完成ORF预测和CD-HIT聚类去冗余，最后与UniRef和KEGG数据库比对。

最后使用bowtie2将测序序列比对到注释后的unigene序列上获得基因丰度，经过KEGG注释得到代谢途径的丰度。研究的数据处理流程图如下：

在数据分析流程和方案选择上人体肠道菌群由于研究众多，以及有多个深度测序拼接完成的Binning参考基因组数据集，确实可以直接使用参考基因组直接比对。

对于其他一些环境或来源的样本这个深度的数据量可以考虑独立拼接和分箱。该研究中使用已有参考基因组，大概88%的序列能比对到参考基因组，如果直接组装这个比例应该可以更高一些。另外在获得基因丰度是可以考虑使用Salmon，比对获得基因丰度更为方便。

获得相应数据后对相对丰度，该研究使用Box-Cox transformation对数据进行标准化，并过滤了一些低丰度的菌属。Case-control的相关性分析使用的R的glm2模块，将年龄、性别和测序上机分组作为协变量。

对于菌属的关联分析，最终将显著性结果以火山图和GraPhlAn图的形式展现如下：

上面其中D图使用每个菌的丰度进行UMAP分析，并映射关联效应的展示比较有意思。

不过在基因层面上并未找到相应的关联，可以看到下图UniRef90的NMDS分布图两组之间无法有效区分，多样性也没有显著差异。

Tips ：

这项研究在菌层面发现了多个普雷沃氏菌属的菌在日本人群中与类风湿性关节炎存在关联，不过除此之外其他方面的发现并不多，仅找到一个基因存在显著关联，涉及的临床调查也相对有限，且人群队列数量不算多，并无独立验证集，因此亮点并不多。如果能纳入免疫相应指标可能能研究的更细致一些。

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  < 案例四 ＞ 永冻土中参与有机物降级的关键菌群

最后这项研究是对来自永冻土融化梯度的214个样品的宏基因组测序组装了1,529个基因组，揭示了参与有机物降解的关键种群，包括其基因组编码先前未描述的木糖降解真菌途径的细菌。

通过宏基因组denovo组装和分箱Binning，最终获得了1529个永冻土菌群基因组。基于这些数据描绘了永冻土融化梯度下的菌群构成特征，如下图。

论文是2018年发表的，测序是在2011和12年测的，使用的是CLC Genomics Workbench 较早的4.4版分单样本组装，然后使用MetaBAT进行分箱，最后的标准是70%完成度和低于10%的污染。

其中糖苷水解酶基因使用dbCAN数据库的HMM进行预测，碳代谢使用KEGG数据。

研究还同时选择了部分样本进行了宏转录组和宏蛋白组的测序，对碳代谢同时结合转录组和蛋白组的数据，展现了特定通路下不同永冻土的菌群构成和表达丰度差异。

基因组拼接的分布情况，以及不同地域样本分布和菌属丰度情况如下：

木糖降解途径在每个样本中的分布和维恩图，另外详细的展现了主要门对每个代谢途径的贡献和基因表达丰度，如下图：

这张图分析了特定菌与地理位置和CO2以及甲烷的浓度的关联性，如下图：

对关键物种的CH 4 :CO2浓度比相关代谢途径的重建，以及相应基因的基因家族分析。

Tips ：

总结一下这项研究，永冻土的菌群参考基因组数据缺乏，该研究从大量地点采集样本重建了1500多个参考基因组。

首先从物种构成特征上与永冻土融化阶段特征进行分析，并与重要环境因子进行分析，锁定重要的特征菌。

然后针对重要的代谢途径和关键基因结合宏转录组和宏蛋白组全面解析代谢途径的分布和差异变化。对关键的物种重建了相关代谢途径并对其相关基因家族进行分析。

研究基本上从头构建了一个生态环境下的菌群结构数据，并利用获得的基因组深度解析特定代谢途径和基因的构成和表达变化，应该说既宽又深。很多样本采集和测序是2011年和 2012年就开展的，虽然测序技术远不如现在成本低和成熟，但是其独特的研究对象和全面深入的分析仍然使整项研究和目前的一些研究相比完成的更加出色。

PCR实验室

产权资质

谷禾优势

样本需求量低：常规宏基因组建库建议样本量在500ng以上，公司研发实现了低当量微生物样本提取和建库，保证提取丰度以及片段完整性同时，样本量需求低于同行其他公司要求；对于样本获取困难的样本，也可以选择微量建库，样本量可低至10ng。

免费取样盒和针对性取样建议：粪便及环境样本提供取样盒助力临床/科研取样，人体口腔、痰液、腹水、脑脊液、尿液、皮肤等高寄主细胞含量样本可根据我们的处理方案简单处理后大幅降低宿主DNA比例。

 严格标准的实验流程：自动化样品处理平台辅助，每轮设置阳性对照，上轮检测样本对照，阴性对照。评估污染，轮次比对，最大化减少误差，保证样本重复性和稳定性

Illumina测序平台：宏基因组测序（PE150）采用先进的Illumina Novaseq测序平台，快速、高效地读取高质量的测序数据、结合样品特点和数据的产出，充分挖掘环境样品中的微生物菌群和功能基因

大数据分析流程质量流程控制严格：优化的数据质量控制，包括过滤比对质量低、非特异性扩增、覆盖度低、低复杂度的序列，从而快速准确获得样本中微生物信息及其丰度信息，最大化提高质量数据

分析内容丰富全面：物种分析，基因预测与分析，多样性和相似性分析，功能分析，网路互作分析，代谢网络，关联分析等

完整详细的报告：提供质检实验报告，分析统计报告，分析报告解读，原始数据

 高效个性化服务：在线项目系统方便您及时查看项目动态和下载报告以及与分析人员高效交流，免费支持个性化图表修改以及重新分组出报告。

 价格低，周期快：包括提取，测序到分析，最快2周出报告。

大数据分析团队和多中心大项目分析经验（团队主要源自浙江大学，包括生物信息学，计算机，微生物以及统计分析等专业，积累了多年的大健康项目多中心项目分析经验，有助于宏基因组大数据，多样本，多表型，多组学联合分析

兼容性强的合作模式：有专门团队负责，提供切实可行的项目方案，兼顾临床和科研双需求模式。

投稿期刊

宏基因组示例报告和视频解读

科研路漫漫，谷禾与您常相伴！

营养不良和口服万古霉素对人体肠道菌群和营养吸收的影响

肥胖和营养不良是普遍面临的健康问题，而肠道菌群在其中扮演的什么样的角色？最近一项研究通过交叉过量、过低饮食干预以及随机双盲万古霉素抗生素实验，揭示了不同热量摄入和抗生素会破坏肠道菌群特定代谢产物（如：丁酸和其他短链脂肪酸）影响肠道屏障，并改变特定微生物群落（如阿克曼菌），这种变化是粪便热量流失的原因，表明肠道菌群在饮食能量吸收中起着因果的作用。

单位：美国国家卫生所

期刊： Nature Medicine 《自然医学》

摘要

文章揭示了营养不良和口服万古霉素对人体肠道菌群和营养吸收的影响。以往的研究发现，营养不良显著增加粪便热量损失，且降低了拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度，这是人类肠道中的两个主要门。还有各种证据表明，早期使用抗生素与儿童体重增加有关，在营养不良中，抗生素促进生长的证据好坏参半。在本文中，研究人员进行了一项长期的住院研究，使用了两种干预措施。在每个实验中，研究人员都测量了过量饮食和饮食不足期间的粪便卡路里流失，这是营养吸收的直接表征，第一阶段是随机交叉饮食干预，所有受试者按随机顺序接受3天的过量和不足饮食喂养。第二阶段是随机、双盲、安慰剂对照的药物干预，使用万古霉素或安慰剂（NCT02037295）。研究人员观察到，肠道菌群结构在营养不良和饮食过量的情况下有轻微的变化，但口服万古霉素后群落结构伴随着多样性降低发生了更显著的变化。两种干预措施中嗜粘蛋白艾克曼菌的丰度都增加了，这导致了更多的粪便热量流失。这些结果表明，营养吸收对环境扰动敏感，并与临床前模型相关，表明肠道菌群在饮食能量吸收中可能起因果作用。

背景

全球肥胖症的流行促使人们努力确定影响能量平衡的环境和宿主因素，能量平衡的定义是能量摄入和消耗之间的平衡。虽然卡路里消耗是能量摄入量的关键决定因素，但个体消化和吸收所消耗的饮食底物的能力的不同程度也可能影响能量平衡。在过去的十年中，利用啮齿动物模型得到的研究成果，支持了数以万亿计的微生物在人类胃肠道（肠道菌群）的因果作用，由于它们对能量摄入和消耗的广泛影响，形成了能量平衡的个体间变化。但可惜的是，尚无直接证据表明微生物群对营养吸收有影响.

实验设计

实验对象：

选取了除葡萄糖耐受和肥胖症以外的27名健康志愿者（男17名，女10名，年龄35.1±7.3，BMI 32.3±8.0），其中25名完成了整个实验。在整个研究过程中，参与者都是住院患者，每天都接受监测，没有被报告过副作用，特别是腹泻或腹部症状。

设计方案：

第一阶段：随机的交叉饮食干预

所有受试者均以过量（OF）和节食（UF）三天的随机顺序进行饮食，期间会有3天的洗脱期。OF为WMD的150%的饮食，UF为WMD的50%的饮食。

第二阶段：药物干预

同样的受试者被随机分为安慰剂组和口服万古霉素组

注：

(WMD)体重维持饮食【20%大卡蛋白质；30%大卡脂肪；50%大卡碳水化合物】；(DXA）双能X线吸收法，用于骨密度测定；(OGTT) 口服葡萄糖耐量试验；(Dye marker)表示粪便收集所使用的染料标记物；(CH) 间接量热法，用于评估24小时能量消耗；(HPN,LPL) 肝素诱导的LPL测定；(CBC) 全血细胞计数

主要结果

1. 营养不良和抗生素都会损害养分的吸收。与摄入的热量相比，营养不良和万古霉素都导致粪便(在粪便中测量的热量百分比更高)有更多的热量流失。

“ Δ ”表示组间的平均差异；“ P ”表示双边配对学生t检验； 红点表示开始饮食阶段为OF的受试者，白点表示开始饮食阶段为UF的受试者

a)：过量饮食组（4,446.5 ± 547.8 kcal d−1）的每日摄入热量显著高于营养不良组（1,494.2 ± 211.0 kcal d−1），

b)：与营养不良的人相比，过量饮食的人每天消耗的卡路里绝对数量明显更高。

c)：当以每天摄入的卡路里的百分比来表示时，UF期间的粪便热量流失相对于OF明显更大，且有很强且显著的体内相关性（Pearson’s r = 0.70, P = 0.004）

d)：UF比OF转运时间快，转运时间被定义为每次干预期间染料标记第一次出现和最后一次出现之间的时间(以h为单位)。

Δ ”表示组间的平均差异；“ P ”表示双边非配对学生t检验；误差条表示95%置信区间的均值

a)：3天的平均摄入热量。安慰剂组（Placebo）和万古霉素组（Vancomycin）每天摄入的热量是相当的。

b)：万古霉素导致粪便热量流失显著增加。

c)：粪便平均热量流失百分比。

d)：万古霉素组和安慰剂组的转运时间没有差异（P=0.2）

2.使用扩增子和宏基因组测序相结合的方法，评估了饮食干预和药物干预对肠道微生物群落结构的影响。在饮食干预组间分析中发现了几种对饮食敏感的细菌物种。在药物干预组间分析中也发现了几种显著富集的物种。且扩增子和宏基因组测序结果具有一致性。尽管存在这些差异，但在这两种干扰下，有两种细菌的种类都发生了一致的变化。嗜粘蛋白艾克曼菌和一种隶属于Lachnospiraceae NK4A136群的一个未确认的种。

饮食干预：

a)：整体肠道菌群在OF和UF期间的定植。在UF期间，肠道菌群由于相对地缺乏营养，这可能导致细菌定殖的减少。但是在UF期间与OF相比，总的定殖水平显著增加（P=0.01，双边配对的Wilcoxon检验）。

b)：两种饮食措施的Bray-Curtis距离的PCoA第一主坐标的差异。受试者按饮食顺序分开；c)：在两种饮食措施期间每天从10个受试者中取样，其PcoA分析结果。每个点代表一个样本，其中颜色表示受试者身份，形状表示饮食方式（WM，保持体重）；d)：随着时间的推移，微生物群落到基线样本(第一天)的距离。颜色代表饮食，每个点代表一个样本字母表示受试者身份。发现在整个3天的UF和OF干预过程中，总体微生物群落结构保持不变，在基线上保持显著的个体间差异。

e)：在被评估的10个个体中，有2个个体被发现在UF组中的微生物群落总体结构上有显著差异，这可能表明肠道菌群的基线关系到其对饮食干预的敏感性。（对每个受试者进行Adonis分析，R2值量化不同饮食上的方差，“*”表示P<0.05，纵坐标的字母表示受试者身份）

f)：在整个第一阶段的16天内，微生物的总体Shannon多样性相对稳定。

g)：通过16SrRNA鉴定出的4个与饮食显著相关的物种：嗜粘蛋白艾克曼菌、Bacteroides coprocola、毛螺旋菌、瘤胃球菌。纵坐标为相对丰度，横坐标为时间（d）。

 (经FDR调整后的P值，Q < 0.1，双侧Wald检验的DESeq2)。线代表mean ± s.e.m.

h)：基于宏基因组测序的物种分类，发现了9种细菌在不同饮食组间的显著差异（FDR < 0.05, 配对的Wilcoxon检验），每个点代表一个样本，纵坐标表示相对丰度。这与16S rRNA基因测序的分析一致。

药物干预：

a)：不同治疗组的肠道菌群的定植水平无明显差异（P = 0.26，双侧非配对Wilcoxon检验）。每个点代表每个受试者样本的平均值。

b)：不同治疗组的微生物群落Shannon多样性。（P <0.0001，双侧非配对Wilcoxon检验）。每个点代表每个受试者样本的平均值。

c)：不同治疗组间的基于Bray-Curtis距离的PCoA分析。发现万古霉素对肠道微生物群落结构也有显著影响，超过了先前存在的个体间差异。（每个数据点都显示了每个受试者样本的平均值和标准差）

d)：通过宏基因组测序得到的不同治疗组间差异丰富物种的热图。横坐标代表受试者样本，纵坐标代表物种(FDR<0.05，双侧非配对Wilcoxon检验)。其中万古霉素组的物种相对丰度有下降的趋势，31种下降，10种增加。与16SrRNA基因测序数据一致，在万古霉素处理的个体中，有3个Veillonella菌属显著富集，还检测到多种乳杆菌和克雷伯氏菌以及感染乳杆菌的强毒噬菌体(LcNu)的富集。

e)：万古霉素和安慰剂与UF和OF之间的16S rRNA序列变异的Venn图。

3. 对UF和OF组、万古霉素组和安慰剂组与代谢疾病相关的宿主-微生物相互作用的机制研究。丁酸盐是肠道细菌代谢的主要终产物。脱氧胆酸，一种次级胆酸，较低的浓度可能意味着肠道屏障的保护和较低的营养吸收。

通过分析KEGG代谢途径，发现了三条在万古霉素和安慰剂之间差异丰富的代谢途径。其中的两条(丙酮酸发酵为丁酸和乙酰丁酸梭菌产酸发酵超途径)与糖发酵为主要短链脂肪酸丁酸盐(又名丁酸)有关。说明万古霉素治疗期间肠道菌群可能会减少丁酸的产生或细菌代谢。

“ Δ ”表示组内干预措施前后的差异

a)：OF和UF期间丁酸盐的平均浓度；b)：万古霉素组和安慰剂组的丁酸盐的平均浓度。UF和万古霉素处理组的丁酸盐平均浓度均显著下降，这支持肠道菌群在这些干预过程中获取营养的能力下降的说法。

c)：OF和UF期间脱氧胆酸的平均浓度；d)：万古霉素组和安慰剂组的脱氧胆酸的平均浓度。脱氧胆酸的平均浓度在UF和万古霉素处理组也显著降低了。

结论

在这项分两个阶段的研究中，研究人员直接测量了摄入的和粪便的卡路里，证明了限制热量摄入和口服万古霉素都会导致粪便热量流失增加，血浆丁酸水平降低。这种影响的幅度约为摄入卡路里的2.5%，这将转化为100公斤受试者在1年内体重减轻约1.2公斤。另一方面，研究人员观察到UF和OF对肠道微生物群落结构的轻微干扰，而口服万古霉素引起了广泛的变化，降低了肠道细菌的多样性，并使肠道细菌的相对丰度发生了显著变化。这两种扰动都导致了嗜粘蛋白艾克曼菌的相对丰度增加。而在人一项基于人体的随机、双盲、安慰剂对照的先导研究显示，补充嗜粘蛋白艾克曼菌有降低体重和脂肪量的趋势。此外，体外研究表明，丁酸和其他短链脂肪酸可以刺激肠道屏障的形成，从而保护肠道免受LPSs的破坏。根据研究人员的观察表明，热量摄入和抗生素可能会破坏这些代谢产物和其他调节屏障功能的微生物代谢产物之间的平衡，导致营养吸收的改变。研究中也有一些局限性，比如尽管肠道微生物群落结构和代谢物浓度发生广泛变化，但未发现口服万古霉素对粪便热量的影响、不知道其他抗生素是否会对粪便卡路里产生影响、任何关于营养吸收的机制都是推测出来的，因为没能直接评估营养在肠道中的传输等。

多快好省的宏基因组研究技巧

原创 谷禾健康

近年的研究热点集中于环境和生物体相互作用的微生物群体，而大量复杂的微生物群体存在培养困难，构成复杂（包括细菌、古菌、真菌、原生生物、病毒甚至小型真核生物）。因此如何用高通量精准的了解这些群体的构成，基因功能分布以及具体的表达活性和代谢状况成为首要问题。

高通量测序技术的发展，让我们可以不经过培养，一次性了解微生物群落构成甚至基因代谢组成。

随着技术的进步，检测方法也逐渐丰富，对应的分析手段和软件算法也逐步完善，使我们可以根据研究需要选择不同的检测和分析策略来获得海量的数据并进行相应的研究分析。

01

简 介

免于培养的微生物学研究方法主要基于测序，高通量测序使我们一次可以获得整个微生物群体的数据信息，简单来说包括两种策略：

1、基于特定标记基因的扩增测序方案（常见的16s，ITs，18s或特定功能基因）

2、对整个群落DNA进行测序，获取全部微生物基因组进而进行分类和功能分析的策略（鸟枪法宏基因组测序shotgun metagenomics）。

基于16s基因的分析方法

由于其极低的成本，对于样本DNA的低要求非常适合于大规模群体样本的调查和分析，随着DADA2等分析方法的改进，物种分类精度和准确度也有所提升，加上PICRUST等功能预测方法一定程度上弥补了基因信息的缺失，因此16s这类基于基因的微生物研究方法仍然是不可或缺的方案。

下表列了16s常见的分析软件，目前QIIME2作为整合包使用最为方便，VSEARCH也作为UPARSE的开源版本使用也非常广泛。

16s测序的分析流程如下图，获得序列经过聚类后获得OTU或ASV，并得到相对丰度。

经过PICRUSt可以得到预测的基因分类丰度，进而进行alpha多样性和Beta多样性以及组间差异和相关性分析。

PICRSt的工作原理如下图，将OTU表内16s序列进行对应物种16s拷贝数标准化后，将物种丰度乘以已经整理好的物种的基因注释数表就获得基因的预测丰度。

02

浅宏基因组

浅宏基因组测序方案是去年knights-lab在msystems上发表的针对16s分辨率和宏基因组高成本之间的一个折中方案，通过降低测序深度，每个样本50万reads，但是物种的分辨率并没有低于一般宏基因组（普遍5~10G数据量）。

不通过拼接组装，直接基于kraken2等kmer，或MetaPhlAn2等标记基因的参考基因组方法进行种属丰度分类。结合其到菌株的物种分类和丰度数据可较16s方案下的PICRUST更加准确的预测基因构成。

Hillmann B, Al-Ghalith GA, Shields-Cutler RR, Zhu Q, Gohl DM, Beckman KB, Knight R, Knights D. 2018. Evaluating the information content of shallow shotgun metagenomics. mSystems 3:e00069-18. https://doi.org/10.1128/mSystems.00069-18.

我们发现有些小伙伴的需求是：

想要获得更全和更精细分类精度同时不需要获得完整基因组序列和重建菌群基因的。

那么这时候，我们提供的浅宏基因组测序就可以成为很好的选择，其成本低（快要接近16s测序分析的价格了，文末有福利），分析简便快速，同样能获得宏基因组的基本丰度数据。不过浅宏基因组也有其适用范围，根据样品类型的不同，一些样品可能包含 >99％的人类宿主DNA，这不仅增加了序列成本，而且给测量带来了不确定性。

在许多研究中也会采取在进行宏基因组测序文库的准备之前去除宿主DNA的方法。但是，在去除宿主DNA后，可能没有足够的微生物基因组DNA用于宏基因组测序，这通常需要最少50ng的输入。因此浅宏基因组较适合于宿主DNA含量较低的样本，如人类粪便、水体、土壤等；而如口腔唾液、肺泡灌洗液、血液等人体体液类样本就不太适合。

下图是宏基因组测序数据中比对到人类基因组的序列比例，根据样本类型不同而不同。

我们可以免费提供针对粪便及环境样本助力临床/科研取样。

人体口腔、痰液、腹水、脑脊液、尿液、皮肤、阴道分泌物等高寄主细胞含量样本可根据我们的处理方案简单处理后大幅降低宿主DNA比例。

处理方案如下：

高宿主含量DNA样本（包括唾液、血液、肺泡灌洗液、腹水、阴道分泌物和黏膜类样品）的取样前处

将200微升唾液等体液样本以10,000g离心8分钟 

弃去上清液，通过移液将细胞沉淀重悬于200μl无菌水中，短暂涡旋，然后在室温下静置5分钟，以渗透压裂解哺乳动物细胞

添加终浓度为10μm的PMA（叠氮溴化丙锭）（向200μl样品中添加10μl的0.2 mM PMA溶液），并将样品短暂涡旋，然后在黑暗中于室温温育5分钟

然后将样品从标准台式荧光灯放置在<20cm的冰上水平放置25分钟，短暂离心并每5分钟旋转一次

完成后，可将样品冷冻在−20°C或转移到取样管的储存液中

Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, Zaramela LS, Knight R, Zengler K. Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion. Microbiome. 2018;6(1):42. Published 2018 Feb 27. doi:10.1186/s40168-018-0426-3

本处理方案以后宿主DNA可以降低8%以下。

03

宏基因组

说起宏基因组，对于熟悉宏基因组或者打算做宏基因组的同学可能已经迫不及待想知道这个怎么分析啊，怎么看结果啊之类的问题… 但在这之前，首先你应该了解的是宏基因组是什么，做宏基因组你能得到什么。

此外，对于缺乏深度研究和高质量参考基因组的样本，如土壤和特殊环境下的样本，宏基因组获得的较为完整的基因组不仅可以丰富参考基因组数据库，同时可以提供更加准确的物种分类。

因此，深度宏基因组测序是解析新环境样本的核心方法，不过从单一样本中重建出完整的菌株基因组有相当困难，一般需要较多样本或设置梯度样本从而利用更高深度和共同变化来获取分箱信息，当然对应测序和分析成本会更高。

至此，我们了解了16s、浅宏基因组、宏基因组三种方式，我们将它们各自的特点总结如下表，便于你更直观地去了解（文末有福利~）。

宏基因组报告中有哪些分析内容？

上图可以快速预览一下我们报告中的分析内容。

接下来，我们会详细介绍这些内容是如何从原始数据开始一步步实现的，同时也会选取一些文章案例来给大家做详细解读，希望给大家带来一些思路。

数据分析流程

测序数据需要经过质检，去除接头和低质量序列，一般还会进行一步过滤人的基因组序列，然后分为两个路径，使用参考数据的比对方法和从头组装的方法，下图是一个完整的宏基因组分析流程：

看完上图，可以对宏基因组测序的基本流程有个大致了解。

对于宏基因组测序而言，最重要的就是获得微生物群准确的物种构成及其丰度。

一、 物种构成

首先你需要了解的是无论16S测序还是宏基因组测序获得的均是相对丰度，即每种菌占所有菌属的比例。

要获得绝对的丰度需要在取样时做好取样量的计量，并在提取和建库中加入已知绝对量的参照DNA。

宏基因组测序获得物种构成及其丰度有以下两条路可以走：

我们先讲其中之一： 直接比对 。

直接比对是基于参考数据的，那么基于参考数据的物种构成分析主要有两类方法：

一类是基于Kmer和LCA比对特征来分析对应物种丰度，如kraken2等。

另一类是基于特征标记基因进行分析的，如MetaPhlAn2等。

基于参考基因组的分析工具如下表：

除了上面表中列出来的，另外还有

Centrifuge：比kraken2慢2x,内存使用少很多

Sourmash：类似CLARK,可以使用整个refseq作为数据库。

主流的kraken2——快速、准确度高、内存要求高

目前主要使用kraken2为主，因为快速，准确度也相当不错。不过，对于内存的要求较高，另外受数据库本身质量影响较大，默认kraken2的参考数据库只包括了细菌、古菌、病毒和人，还需要添加其他域的参考基因组。但涵盖的测序参考种仍然有限，对于菌株水平的鉴定受一定影响。后续使用Bracken可以针对kraken2的比对结果进行计算相对丰度。

MetaPhlAn2——物种跨度大、实用

MetaPhlAn2首先从全基因组数据库中找出clade-specific marker genes，然后利用这个marker genes的数据库对高通量测序得到的shotgun序列进行注释，目前主要用于后面直接使用reads获得基因和代谢通路丰度的HUMANn2的流程中，其物种跨度较大，速度也可以接受。

以上我们了解了直接使用reads获得丰度。

如果有足够测序深度和样本数量还可以通过组装出参考基因组来鉴定获得。该部分我们在下面的组装和分箱流程部分详细讲。

接下来，看一下我们报告中获得的结果和图：

使用Kraken2对其中的微生物进行物种注释。我们的Kraken2使用的数据库是由Refseq（2020.04.20）细菌，古细菌、真菌、原生动物和病毒库以及GRCh38人类基因组构建的。

通过查询数据库序列中的每个k-mer，然后使用所得的LCA分类单元集确定序列的适当标签，对序列进行分类。数据库中没有k-mers的序列不会被Kraken2分类。这里我们是在使用k-mer=35的条件下进行物种注释。

使用Bracken对物种注释结果计算相对丰度。Bracken是一种高度精确的统计方法，可从宏基因组学样本计算DNA序列中物种的丰度。Braken使用Kraken2分配的分类标签来估计源自样本中每种物种的读数数量。

对物种注释结果使用 KRONA 进行可视化展示。

注：圆圈从内到外依次代表不同的分类级别（界门纲目科属种），扇形的大小代表不同注释结果的相对比例。

上面的是使用KRONA对单个样本的构成图形化，所有样本合并使用柱状图就可以了解具体的样本构成丰度，从门-纲-目-科-属-种-甚至菌株每个层次都可以进行显示（下面是截取我们报告中的相关图）。

如果嫌柱状图的展示方式单一，当然也可以有别的选择。比如说以Circos的环图形式展现：

也可以进行聚类分析：

有了这些数据我们就可以进行alpha多样性（指每个样本内部菌群多样性）的分析了。

各样本和多组之间也可以进行Beta多样性的比较分析：

计算样本之间的菌属构成相似度：

组间的差异分析：寻找差异或代表性菌属，如下：

Trukey多组间检验

LefSe分析

其中LEfSe基于线性判别分析（Linear discriminant analysis，LDA）的分析方法，筛选组与组之间生物标记物Biomarker（基因、通路和分类单元等），即组间差异显著物种或基因。当分组较多时较难获得每个分组独特的Biomarker。

以上是关于物种组成部分，但是有些小伙伴会有这样一些疑惑：物种构成变化很大怎么办？个体差异也很大？之类的诸多疑问。

是的，微生物群落一般对应特定的环境，其物种构成有时候变化迅速，而且个体或不同地点的构成差异极大。如人体的肠道菌群，个体之间的菌群构成差异很大，仅少量核心菌在绝大部分人的肠道内出现，个体特异性菌株也非常常见。那么如此多样性和复杂的构成如何应对相似的环境呢？

研究显示不同的菌属可能有着相似的基因或代谢能力，差异极大的种属在基因功能层面可能有着相似的构成。因此，获得微生物群的基因和功能代谢构成及分布对于解释和了解微生物如何响应和适应环境就尤为重要。

二、功能构成

下图可以帮你更好地理解上面这段话。从图中我们可以看到，舌背样本和粪便样本虽然在种属上有很大差异，但它们在基因功能层面却有着相似的构成。

与物种构成丰度的分析类似，基因功能构成分析也同样可以包括两种方法：

方法一、通过直接基于reads的参考数据库方法获得

方法二、通过组装后预测注释基因并得到丰度

在具体展开方法之前，我们需要先了解关于基因功能的基本概念。

基因功能

每个菌的基因组中都包含大量的编码基因（ORF）以及非编码的RNA。这些基因之间又存在同源或序列相似性，达到一定相似程度的称为同源基因（一般通过CD-hit聚类为unigene，gltA这类基因名称，而数据库中一般聚类为如uniref90，eggNOG_ortholog等不同相似度的非冗余基因），这些同源基因除了序列相似同样也有着相似的功能，基于其功能或具备的蛋白功能域可以进一步分类为基因家族（Pfam），酶（EC 1.4.1.13），代谢通路（ko:K00266），更进一步层层分类为GO或顶层代谢通路Metacyc或COG等。

我们先来看方法一，具体是如何操作的？

主流的HUMAnN2——获得基因和代谢通路丰度的同时可直接进行下游分析

基于测序原始序列直接获得基因构成丰度的软件目前最主要的是HUMAnN2，其首先使用MetaPhlAn2进行物种分类（关于这个软件我们在前面物种组成部分已经讲过），并提取相应物种参考基因组用于比对，未比对上的用于进一步和uniref数据库进行蛋白质序列比对。原理见下图：

HUMAnN2的便利之处在于获得基因和代谢通路丰度的同时可以直接进行下游分析，将导出的表用于如LEFSE等差异分析，此外还可以反向给出不同样本中每个基因或代谢通路里的物种贡献。

下图是基于HUMAnN2的不同代谢通路的菌贡献比例图：

在我们的宏基因组报告中获得的是这样的：

而另外一种方法是通过组装获得，我们在前面物种构成小节也已经提到过组装分析，那么这里我们就组装拼接分析这部分展开讲解一下。

三、基于组装拼接的分析

什么样的条件下可以进行组装分析？

当测序深度足够的情况下，目前illumina二代和Pacbio以及Nanopore等长片段测序技术已经足以组装出高质量的细菌基因组草图，结合Binning方法可以一次性获得大量物种的高质量接近完成基因组。此外还有Hi-C等手段可以进一步完成基因组以及对应质粒的完整拼接。

组装的流程是什么样的？

来看一下整个基于组装的流程：

① 提取、测序

首先从样本中提取基因组DNA，进行测序，可以使用Illumina的段片段深度测序也可以辅助三代长片段测序。

② 获得contig序列

接着对序列经过质检过滤处理后直接使用序列进行拼接，获得contig序列，这时通常每个菌的基因组会有几十到数千个contig片段，由于构成复杂，很多近缘菌之间的基因组存在大量相似序列，以及每种菌丰度都不一致，所以contig阶段的片段仍然较多。

③ Binning分析 

基于序列构成特征如GC含量、核苷酸多态性、覆盖度以及基因的物种相似度等多种数据，如果有多个样本或梯度可以同时结合样本丰度变化来进行分箱也就是Binning分析，将具有相同特征和变化的contig聚类归为同一个来源的箱，每个bins通常来自单一菌也就是一个菌株的基因组（我们的数据分析中包含这部分分析内容）。

④ 进一步质检评估

之后会进行进一步的质检，如checkM等评估每个Bin的完整度（核心基因以及rRNA等的完整性）和污染比例（如错误拼接，不同物种来源等）。一般要求50%以上的完整度以及10%以下的污染，当然样本数量越多，测序深度越高，测序读长越长理论上binning的质量也会更好，能获得更多高质量的单一菌完整基因组。

借用一张分箱的说明PPT：

目前组装contig方面比较好的软件主要是SPAdes和MegaHIT。分箱方面MetaWRAP流程可以将整个组装和分箱优化全部完成，包括前期质检到组装以及使用三种分箱方法concoct, metabat2和maxbin2，并最终进行合并提纯优化，输出最终的分箱。

同时还可以对每个分箱bins进行物种鉴定和定量，这样我们就可以获得基于拼接组装后的物种丰度构成表，开展上述的物种多样性和样本差异统计分析。

⑤ 注释

最后使用PROKKA进行基因预测，获得的编码序列我们经过进一步CD-Hit聚类去冗余，然后使用eggNOG-mapper对其进行进一步的功能比对注释。使用salmon完成基因的定量，这样我们就得到基于组装注释的基因丰度数据了。之后就可以进行基因和功能层面的多样性、构成以及样本和组间差异分析。

我们获得的最基础的uniref，eggNOG，KEGG和GO等注释如下：

KEGG

COG

eggNOG

组间差异分析，如KEGG途径：

除此之外，还可以使用其他的功能基因数据库来进行进一步的基因注释和分析。比如：

CAZy：

VFDB毒力因子注释：

抗性基因注释：

TCDB数据库注释：

PHI数据库注释：

BCGs分析：

以及基于antiSMASH和BiG-SCAPE来对代谢物的合成生物基因簇BCGs进行分析。

固定代谢能力评估：

或更聚焦于特定代谢的如下图中的氮、磷、硫和碳固定代谢能力和水平的评估：

当有了大量样本的菌群构成丰度信息，以及各种基因和代谢丰度数据后，我们需要根据样本的meta信息，基于不同分组，时间或环境因子等数据进行统计分析和检验，进而发现和探索可能的关联以及背后的生物学意义。

四、统计检验

那么在面对宏基因组这类数据时在进行统计检验分析时需要注意什么呢，应该采用哪些分析，并如何解读这些结果呢？

首先，微生物组数据分析分为四大类：

在对所有数据进行统计检验前一般建议对数据进行基本的质量过滤。一类是去除绝大部分样本都不存在的物种和基因，如Prevalence in samples (20%)，还有一类是去除变异度过小的Percentage to remove (10%)基于Inter-quantile range。

为什么可以过滤这两类？

上述的两类由于其携带的信息量和变化过小在进行组间比较统计检验的时候都建议过滤，因为要么是污染，要么与差异无关。

宏基因组数据具有一些独特的特征，例如测序深度的巨大差异，稀疏性（包含许多零）和分布的巨大差异（过度分散）。在进行后续的统计检验之前建议针对不同的分析方法进行相应匹配的标准化处理。标准化包括：

Rarefaction和缩放方法：这些方法通过将样本放到相同的比例进行比较来处理不均匀的测序深度；

转换方法：包括处理稀疏性，组成性和数据中较大变化的方法。

那么各种标准化方法是什么，应该选择哪种方法？

参考MicrobiomeAnalyst网站提供的信息，以下是一个简短的介绍：

请注意，数据标准化主要用于可视数据探索，例如beta多样性和聚类分析。有时候不使用标准化也能获得最佳结果，比如：单变量统计和LEfSe。

同时，其他比较分析将使用其自己的特定标准化方法。例如，对metagenomeSeq使用累积总和定标（CSS）标准化，对edgeR应用M值的修剪均值（TMM）。

经常有小伙伴问，这个数据是用的什么标准化？没有做标准化怎么办？这类问题。

目前，尚无关于应使用标准化的共识性指南。建议大家可以探索不同的方法，然后目视检查分离模式（即PCoA图）以评估不同标准化程序对实验条件或其他感兴趣的宏基因组数据的影响。

有关这些方法的详细讨论，请参考使用者最近发表的两篇论文 

①  Paul J. McMurdie等

（https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003531）

② Jonathan Thorsen等

（http://doi.org/10.1186/s40168-016-0208-8）

以上是关于标准化的这部分内容需要了解的知识，接下来我们来看具体如何操作，怎么得到那些图表？它们分别代表什么？

一般我们需要先进行探索性分析，也就是不设预订的假设，首先从主成分分析结果中了解样本的菌属和基因的大概分布。

主成分分析是根据不同距离算法计算样本之间的距离矩阵，然后进行降维，最终形成一个三维的空间分布。样本之间在空间上分隔越远表明样本之间的差异越大。

比如我们报告中的下图，疾病和正常样本可以较好的区分，一般此处我们还会进行一个统计检验，来判别PC1和PC2这几个维度上两组之间是否真的存在统计差异。

基于丰度图来评估各样本和分组的基本构成，如：

之后我们可以针对不同分组或处理之间的样本进行统计检验，可以使用的检验方法包括两组间的非参数统计检验T-test/ANOVA，3组以上组间统计检验可以使用Tukey test，其直接生成各组将的统计差异，并提供字母标注，直观简便，如：

具体的统计方法选择可以参考下表：

除了常规的非参数检验外，包括metagenomeSeq和DEseq以及edgeR等统计方法包可以很好的分析组间差异特征。LEfSe则一般用于寻找特征标志物。

那么有了大量的差异特征菌属或基因之后，我们是否能基于这些差异菌属有效的区分不同的分组呢，或构件一个模型来预测或分类呢？

这时候可以使用随机森林（Random Forest）一类的决策树机器学习模型，来利用这些差异特征构建分类模型，并使用AUC等指标来评估基于这些模型的预测有效性和准确度（我们报告中如下图）。

当然也可以使用其他更复杂的如深度学习等方法来构建分类模型。

除了性别、疾病、地点等分类差异之外，我们通常还有很多元数据，包括临床指标或环境因子等信息，这些数据通常是连续型数值，对于这类数据我们可以进行相关性分析。

当然反过来，将菌群特征作为表型也可以和如基因组的基因型或SNP构成来进行相关性分析。

对于菌群数据的相关性分析比较推荐：

SparCC方法，可以构建菌种或菌属之间的相关性网络，相对稳定。

对于与疾病或环境变量进行相关性分析可以使用：

Sperman秩相关分析。

另外RDA/CCA分析也可以有效的反映菌属与环境因子等指标直接的关系（我们报告中如下图）。

Mentel检验也可以用于判断菌群构成特征与单个或一组环境因子之间是否存在显著相关。

要 点 

宏基因组从大量菌群和基因构成中寻找关联是需要足够的样本量才能达到有效的统计效力，因为一次性获得了大量的特征数据，样本量过少会带来统计结论的无效，越是组内差异大，组间差异小的研究足够大的样本量才能得到可靠的结论。

一般动物样本具有较好的背景可控，组内样本数量建议至少6个，而人群研究由于背景复杂，个体多样性高，一般建议组内50例以上较好。

以上看完后，你应该对宏基因组的数据分析流程有了整体的认识，也学会了相应的一些操作，但是不一定能直接从自己的这些数据、图表中真正探索到和实际生物学相关的有价值的研究成果。

所以，我们又选取了一些已发表的研究作为案例，结合实际问题来具体分析，从实验设计到具体分析流程方法和图表的展示，再到相应的结论，掌握这类文章的总体思路。

之后无论是刚开始的实验设计，还是后面的分析，都会更加得心应手。

建议想好整个实验思路再开始（或者也可以咨询我们，我们专业的数据分析团队会为你提供切实可行的项目方案）。

04 案例解析

  < 案例一 > 肥胖患者的肠道微生物组

第一项研究是关于肥胖患者减肥手术后的宏基因组和代谢数据的分析研究。

文献来源：Aron-Wisnewsky J, Prifti E, Belda E, et al. Major microbiota dysbiosis in severe obesity: fate after bariatric surgery.Gut. 2019;68(1):70–82. doi:10.1136/gutjnl-2018-316103

研究纳入了61名严重肥胖的受试者，他们是可调节胃束带术（AGB，n = 20）或Roux-en-Y胃旁路术（RYGB，n = 41）的候选人。减肥手术后1、3和12个月随访24名受试者。使用宏基因组学测序和LC-MS分析肠道菌群和血清代谢组。另外纳入了10人和147人分别作为宏基因组和代谢检测的验证集。

研究思路

这样的设计分别有什么作用？

第一点持续的动态采样可以获得持续变化情况，尤其是在一个特定变化后（减肥手术），持续的最终采样有助于确认菌群的变化出现和特定事件或生理病理变化的前后，尤其是在确定因果中有重要帮助。

第二点获得多维的数据有助于帮助我们全方位的了解菌群变化背后的带来的生理和代谢变化以及之间的关联。

第三点独立验证集的存在将大大增强研究的可信度，尤其是该研究纳入的样本量并不多，无法全面有效的控制无关因素，使得很多统计检验的效力无法显现。这也导致该研究仅在基因总量和多样性上获得较好的重复效果，而更多的菌群精细特征以及具体基因和代谢通路没有得到深入分析。但是独立验证集保证了核心结论的可靠性和重复性，这点在宏基因组研究中非常重要。

从下图可以看到研究针对样本的总基因多样性水平与生理指标和疾病状态进行相关性分析和组间差异分析，图中给出了显著相关和差异的指标。

使用的统计检验方法是pearson和sperman相关和t-test以及Kruskal-Wallis检验。

下图是研究将MAGs与各项生理和代谢值进行相关性分析后的热力图。该研究由于测序较早，并未独立拼接，而是直接使用了之前一项人类肠道菌群研究获得组装基因组参考序列。

进一步研究分析了术后特定变化模式的MAGs以及它们与代谢生理指标的相关性，见下图：

上图的研究可以通过pattern search的方法寻找特定变化模式的菌种。

研究的主要结论发现是低基因丰富度（LGC）存在于75％的患者中，并且与躯干脂肪质量和合并症（2型糖尿病，高血压和严重程度）增加相关。LGC改变了78种宏基因组种（MGS），其中50％与不良的身体成分和代谢表型有关。九种血清代谢产物（包括谷氨酸盐，3-甲氧基苯基乙酸和L-组氨酸）和含有参与其代谢的蛋白质家族的功能模块与低MGR密切相关。术后一年，BS会增加MGR，但尽管RYGB患者的代谢改善比AGB患者大，但术后一年的MGR仍然很低。

点 评 ：

总体而言该项研究可以使用浅宏基因组（在文章开头第二部分详细介绍过）来完成所有测序和分析，进一步扩大样本数量，如果能同时获得人的转录组数据甚至能更加明确的找到菌群变化与特定代谢通路的关联关系。

 < 案例二 >  食物与人类肠道微生物组

第二项研究是Dan Knights实验室发表在Cell Host & Microbe,2019的一篇针对34个人17天每日饮食和菌群变化的相关研究，试图揭示日常食物选择与人类肠道微生物组组成之间的精细关系。

文献来源：Johnson Abigail J,Vangay Pajau,Al-Ghalith Gabriel Aet al. Daily Sampling Reveals Personalized Diet-Microbiome Associations in Humans.[J].Cell Host Microbe, 2019, 25: 789-802.e5.

可以看到，研究同时记录了粪便样本的菌群宏基因组和每日的饮食记录。研究的核心在于将每日饮食的食物通过营养构成进行量化，并构建类似物种进化树的食物物候树。

此外由于有每日的数据，可以通过前一日的食物与第二日的菌群数据进行时间序列分析，构建食物与菌之间的关联以及时间相关性。

最后基于菌群数据和前一日饮食来构建模型预测判断后一日的菌群状态，帮助我们了解食物对于个体菌群的影响因素并实现定量和预测。

研究中对数据的处理过滤标准如下：删除所有具有低读取计数（每个样品<23,500个读取）的样品。物种级别的分类表仅限于研究对象中至少存在25％的研究日，且在10%的研究样本对象中发现的那些物种。

最后，相对丰度<0.01％的稀有物种被丢弃，将物种数量限制为290个注释。将得到的分类表汇总到较高的分类级别（即属，科，门等），以进行下游分析。

菌群和饮食以及营养构成的堆叠图很好展现了变化和对应。

下面这张图很好的显示了饮食食物的变化与菌群变化之间的时间变化关系：

下面这张图通过对每个人单独进行菌属与食物的Spearman相关，展现了菌与食物之间的关联的个体化差异，在特定菌属对应相同食物不同人会出现完全不同方向的变化，这也正是这项研究所揭示的，这种关联关系的复杂性。

点 评 ：

本研究虽然有大量样本，但并未进行组装，而是直接使用了Refseq的细菌完成基因组序列作为参考。研究由于样本数量众多，测序深度也很有限，类似研究也可以使用浅宏基因组方式完成。

  < 案例三 >  类风湿关节炎的人群肠道微生物组 

接下来的一个研究是比较典型的宏基因组组装并与疾病进行关联分析的案例，研究的是日本人群类风湿关节炎的肠道微生物组的全基因组关联研究。

文献来源：Kishikawa Toshihiro, Maeda Yuichi,Nii Takuroet al. Metagenome-wide association study of gut microbiome revealed novel aetiology of rheumatoid arthritis in the Japanese population.[J] .Ann. Rheum. Dis., 2020, 79: 103-111.

研究使用较高深度的宏基因组shotgun测序（每个样本平均13 Gb）对日本人群（病例 = 82，对照 = 42）进行了RA肠道微生物组的MWAS分析。MWAS由三个主要的生物信息学分析渠道（系统发育分析、功能基因分析、途径分析）组成。

使用了之前研究中6139个完成拼接日本人肠道宏基因组作为参考序列以及其他几项研究的参考基因组，在过滤部分种过多的基因组之后，最后一共使用了7881个参考基因组。

将QC后的序列直接比对到参考基因组，并根据基因组长度计算对应物种的相对丰度。

基因方面选择denovo组装，使用MegaHIT，然后再contig上完成ORF预测和CD-HIT聚类去冗余，最后与UniRef和KEGG数据库比对。

最后使用bowtie2将测序序列比对到注释后的unigene序列上获得基因丰度，经过KEGG注释得到代谢途径的丰度。研究的数据处理流程图如下：

在数据分析流程和方案选择上人体肠道菌群由于研究众多，以及有多个深度测序拼接完成的Binning参考基因组数据集，确实可以直接使用参考基因组直接比对。

对于其他一些环境或来源的样本这个深度的数据量可以考虑独立拼接和分箱。该研究中使用已有参考基因组，大概88%的序列能比对到参考基因组，如果直接组装这个比例应该可以更高一些。另外在获得基因丰度是可以考虑使用Salmon，比对获得基因丰度更为方便。

获得相应数据后对相对丰度，该研究使用Box-Cox transformation对数据进行标准化，并过滤了一些低丰度的菌属。Case-control的相关性分析使用的R的glm2模块，将年龄、性别和测序上机分组作为协变量。

对于菌属的关联分析，最终将显著性结果以火山图和GraPhlAn图的形式展现如下：

上面其中D图使用每个菌的丰度进行UMAP分析，并映射关联效应的展示比较有意思。

不过在基因层面上并未找到相应的关联，可以看到下图UniRef90的NMDS分布图两组之间无法有效区分，多样性也没有显著差异。

点 评 ：

这项研究在菌层面发现了多个普雷沃氏菌属的菌在日本人群中与类风湿性关节炎存在关联，不过除此之外其他方面的发现并不多，仅找到一个基因存在显著关联，涉及的临床调查也相对有限，且人群队列数量不算多，并无独立验证集，因此亮点并不多。如果能纳入免疫相应指标可能能研究的更细致一些。

  < 案例四 ＞ 永冻土中参与有机物降级的关键菌群

最后这项研究是对来自永冻土融化梯度的214个样品的宏基因组测序组装了1,529个基因组，揭示了参与有机物降解的关键种群，包括其基因组编码先前未描述的木糖降解真菌途径的细菌。

文献来源：Woodcroft Ben J,Singleton Caitlin M,Boyd Joel Aet al.Genome-centric view of carbon processing in thawing permafrost.[J] .Nature, 2018, 560: 49-54.

通过宏基因组denovo组装和分箱Binning，最终获得了1529个永冻土菌群基因组。基于这些数据描绘了永冻土融化梯度下的菌群构成特征，如下图。

论文是2018年发表的，测序是在2011和12年测的，使用的是CLC Genomics Workbench 较早的4.4版分单样本组装，然后使用MetaBAT进行分箱，最后的标准是70%完成度和低于10%的污染。

其中糖苷水解酶基因使用dbCAN数据库的HMM进行预测，碳代谢使用KEGG数据。

研究还同时选择了部分样本进行了宏转录组和宏蛋白组的测序，对碳代谢同时结合转录组和蛋白组的数据，展现了特定通路下不同永冻土的菌群构成和表达丰度差异。

基因组拼接的分布情况，以及不同地域样本分布和菌属丰度情况如下：

木糖降解途径在每个样本中的分布和维恩图，另外详细的展现了主要门对每个代谢途径的贡献和基因表达丰度，如下图：

这张图分析了特定菌与地理位置和CO2以及甲烷的浓度的关联性，如下图：

对关键物种的CH 4 :CO2浓度比相关代谢途径的重建，以及相应基因的基因家族分析。

点 评 ：

总结一下这项研究，永冻土的菌群参考基因组数据缺乏，该研究从大量地点采集样本重建了1500多个参考基因组。

首先从物种构成特征上与永冻土融化阶段特征进行分析，并与重要环境因子进行分析，锁定重要的特征菌。

然后针对重要的代谢途径和关键基因结合宏转录组和宏蛋白组全面解析代谢途径的分布和差异变化。对关键的物种重建了相关代谢途径并对其相关基因家族进行分析。

研究基本上从头构建了一个生态环境下的菌群结构数据，并利用获得的基因组深度解析特定代谢途径和基因的构成和表达变化，应该说既宽又深。很多样本采集和测序是2011年和 2012年就开展的，虽然测序技术远不如现在成本低和成熟，但是其独特的研究对象和全面深入的分析仍然使整项研究和目前的一些研究相比完成的更加出色。

p.s. 以上展示的图表，我们都可以帮你实现~ 

05 工具分享

 一、 MicrobiomeAnalyst 

网址：https://www.microbiomeanalyst.ca/，只需要biom文件或丰度表就可以进行绝大部分统计检验分析，而且生成图表完整，可以直接使用。偶尔会有服务器不稳定，上传提示错误的情况。

特别推荐其中的Taxon Set Enrichment Analysis模块，直接提交物种列表（一般是找到的差异物种列表），可以直接在各种已有的相关性（人体基因-菌属相关，生活方式-菌属相关，疾病-菌属相关）中进行富集分析，能很好的帮助判断和提供差异菌群的具体关联和证据支持。

完整的支持分析包括：

可以直接生成下面的图：

基本上常见的分析和图都能在线实现。

 二、 gcMeta 

另一个是https://gcmeta.wdcm.org/，是中科院微生物研究所搞的平台，里面包括了宏基因组的样本数据和在线分析平台，可以直接上传原始数据，直接使用工具进行在线分析，大部分常见工具都有，也有一些流程。

对于缺乏计算资源或想自己动手分析的朋友挺友好的，非常推荐试试看。

最后，帮大家整理了宏基因组可投稿的期刊，具体研究方向和影响因子见下表：

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来源： 谷禾健康

体重增长：目前为止我们所知道的一切

肥胖到底美不美？ 我不知道。

我只知道肥胖有可能会影响到健康。

肥胖威胁到健康的范围很广，包括2型糖尿病、冠状动脉疾病、中风、睡眠呼吸暂停和诱发某些癌症等严重疾病，甚至加速衰老，影响寿命。

肥胖不仅会产生这些生理上的不良影响，也会对患者心理造成一定影响，比如说由于行动不便导致无法工作，无法正常社交，甚至抑郁…

肥胖给很多人的生活带来困扰。但是，我们会发现这样一些现象，有些人是所谓的“吃货”，却不怎么胖，而有些人说自己“连喝水都会胖”。

看来肥胖背后的原因恐怕不简单。

今天，我们来详细讨论一下关于肥胖。

首先来看一下，肥胖的定义。

肥胖给很多人的生活带来困扰。但是，我们会发现这样一些现象，有些人是所谓的“吃货”，却不怎么胖，而有些人说自己“连喝水都会胖”。

看来肥胖背后的原因恐怕不简单。

今天，我们来详细讨论一下关于肥胖。

首先来看一下，肥胖的定义。

01

用什么来衡量肥胖

世界衡量标准

BMI全称身体质量指数，是世界卫生组织（WHO）确认的，衡量成人肥胖/超重的金标准。我们平常知道的都是以 BMI>25 算超重。

但由于人种差异带来的体脂比、肥胖形态的不同，亚洲许多国家和地区有自己的标准。

亚太地区标准

亚太地区肥胖和超重的诊断标准：

*亚太地区肥胖和超重的诊断标准专题研讨会依据亚洲人的情况制定。在BMI相对较低时，就易出现腹型或内脏肥胖，并显示患者高血压、糖尿病、高脂血及蛋白尿的危险性明显增加。

02

肥胖的现状

《中国成人肥胖患病率的地理变化：2013-2014年国家慢性病和危险因素监测调查》（以下简称《肥胖调查》）中有写到我国肥胖现状。

*《肥胖调查》由中国疾病预防控制中心张晓博士及其同事们共同完成。

该团队利用了中国慢性病和危险因素监测数据库，评估了2013-2014年全国和各省肥胖率。

将“中国肥胖标准”定义为：

普通型肥胖：BMI ≥28；

腹型肥胖：女性腰围大于85cm，男性腰围大于90cm

按照这个标准，该调查报告显示：2004年-2014年间，中国肥胖症患病率增加3倍多。腹型肥胖增长超50％。

从地区来看，“京津冀”的肥胖发生率很高。以天津为例，女性腹型肥胖率达49.4%，男性为54.4%。

儿童肥胖率也在日趋上涨

据经济合作与发展组织的调查数据显示：

至少有五分之一的儿童患有肥胖和超重。

《中国儿童肥胖报告》显示：

1985-2014年，我国7岁以上学龄儿童超重肥胖率：

肥胖已经是一种全球流行病，而且肥胖人数正越来越多。

03

哪些因素影响肥胖？

3.1 能量摄入/消耗

我们知道，要维持健康的体重，需要保持食物摄入和能量消耗的平衡。

而这种平衡是由控制进食行为和能量代谢的中枢神经系统来负责。

饮食

饮食是影响体重非常重要的因素。饮食通常与饥饿感和饱腹感有关。我们饿不饿并不是自己能决定的，而是听大脑发出的信号，告诉我们饿了（产生饥饿感），该吃东西了，也就产生了食欲。那么这个食欲是怎么调节的呢？

这里有一个理论叫作“葡萄糖稳态理论”，这也是短期调节食欲的基础。

这就好比是特定脑区是一个指挥中心，它整合来自大脑、外周循环和胃肠道的信号，以调节能量的摄入和消耗。

神经元

在下丘脑弓形核（ARC）中，含有两类调节能量代谢的神经元：促进食欲神经元和抑制食欲神经元。

此外，pvn神经元进一步处理信息投射到其他回路，从而控制能量摄入和消耗。

小分子信号

当我们吃东西之后会诱发一系列的信号，包括肠道激素、肽、代谢物和营养素，进而影响能量摄入。大脑又会激活身体的不同机制，来控制食欲，或利用吃的食物和营养来开启发酵过程，合成代谢产物。

图1 体重调节的关键代谢机制

此外，在大脑中，传出信号被产生并发送到不同的组织，以促进产热和/或能量储存，并有助于能量消耗。（对应图中红线部分）

胃肠激素调节——饱腹感的生理介质

胃肠激素通过对胃肠运动和分泌的局部影响来优化营养物质的消化和吸收过程。在这方面研究最多的是胆囊收缩素（CCK）、胰腺多肽、肽YY、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、氧调节蛋白和胃饥饿素ghrelin。

它们通过各种不同的机制来增加你的饱腹感，让你别再吃了（具体方式在后面碳水化合物的小节展开）。

神经递质

许多肠肽既是激素又是神经递质。CCK和GLP-1等肽在投射到中枢神经系统内外对能量平衡至关重要的区域的神经元中表达。

大脑皮层高级神经活动，通过神经递质影响下丘脑食欲中枢，在调节饥饿感和饱腹感方面发挥一定作用。神经递质种类很多，包括五羟色胺、多巴胺等。

基于谷禾人群队列，我们选择了146例超重和肥胖人群，以及179例对照正常体重人群。其中超重标准为BMI>28，队列年龄分布为35~75岁。

根据菌群测序数据和相关营养及代谢调查进行KS统计检验，发现：

神经递质的检测数据显示与神经兴奋有关的多种神经递质和代谢物质肥胖人群普遍偏高，包括:

谷氨酸、五羟色胺、色胺和多巴胺。

而神经抑制类的γ-氨基丁酸（GABA）则偏低：

这些结果与食欲和饮食产生的神经兴奋是否有直接联系还需要进行更深入的生理分子机制的研究。

短链脂肪酸

短链脂肪酸影响与之相关的短期途径，调节食欲和食物摄入。能量收集上的差异似乎是由细菌产生的短链脂肪酸引起的，它提高了消化残余物的能量利用率。

短链脂肪酸有助于血糖稳定以及饥饿和饱腹激素的平衡。结肠输注短链脂肪酸混合物增加血浆PYY水平，这是由上皮G蛋白偶联受体（GPR41和GPR43）的激活触发的。

[具体关于短链脂肪酸的文章：你吃的膳食纤维对你有帮助吗？点此复习]

睡眠改变会影响饱腹感

这就涉及到“生物钟系统”。饮食脂肪和碳水化合物与生物钟系统相互作用，在生物钟系统中，特定的脂肪酸和葡萄糖可以影响行为和分子的昼夜节律，通过改变能量状态传感器影响中枢神经系统、非中枢神经系统和外周器官。这一假设符合葡萄糖稳态理论。

代谢的昼夜节律振荡受日常喂养模式和能量利用模式的影响，影响内分泌系统(瘦素、胰岛素或ghrelin分泌)与睡眠模式之间的昼夜节律排列。睡眠改变（如睡眠不足）可以改变内分泌昼夜节律，影响饱腹感和/或饥饿感，以及与主观幸福感有关的其他方面。

运动改善肥胖者的代谢灵活性

代谢灵活性的程度，即在骨骼肌和脂肪组织中将葡萄糖和脂肪酸之间的燃料选择转移的能力。

体育锻炼已被证明在改善肥胖患者的代谢灵活性方面具有关键作用。研究报告说，随着饮食脂肪的增加，肥胖者开始运动后增强了肌肉脂肪酸氧化。

3.2 三大类营养物质

人体摄入的营养物质中，有包括碳水化合物、脂肪、蛋白质在内的宏量营养素，也有微量营养素诸如维生素和矿物质等。但人新陈代谢的最核心内容是三大营养物质的代谢及其相互转化。

我们先看看这三大营养物质是如何直接或间接产生热量。注意热量不等同于能量。能量加上氧气参与，转化为热量。

在三大营养物质的代谢中，起枢纽作用的是糖类代谢，蛋白质（身体携带氧气的关键）要转变成为热量，需要先转变成为糖类，才能够燃烧产生热量，脂肪的燃烧，也需要糖类的参与才能够顺利完成。也就是说，蛋白质、脂肪是能量的两个储藏仓库，而糖类，会直接释放热量。

接着我们具体来看每种营养素与肥胖之间的关系。

 3.2.1 碳水化合物

碳水化合物包括不同类型的分子，从复杂的多糖和淀粉到单糖，如单糖或双糖，以及不同的纤维，能量值和消化率不同。

这些结构差异导致它的物理性质、消化率和功能的不同。碳水化合物对食物摄取和饱腹感的影响是通过与胃肠-脑神经内分泌信号、肠道发酵（由短链脂肪酸或其他代谢物诱导）和碳水化合物的物理或化学性质（如膨胀和粘度）相关的几种途径介导的。

碳水化合物通过调节胃肠道肽释放来影响饱腹感

与维持血糖水平有关的食欲和饱腹感调节由胰岛素和胰高血糖素调节，胰岛素和胰高血糖素由胰腺分泌，分别导致导致糖原生成和糖原分解。 事实上已证实，包括纤维在内的碳水化合物，对饱腹感相关胃肠道肽（CCK，ghrelin，GLP1，PYY和GIP）餐后释放有影响。单糖和双糖，如蔗糖、果糖和乳糖，是人类消耗的最常见的糖，它们在食欲和食物奖励中的作用与甜味受体有关。

纤维和淀粉是饮食中最复杂的碳水化合物结构。 

它如何产生饱腹效应？

纤维通过调节胃肠道转运、葡萄糖吸收和粪便膨胀起作用。

低能量密度(2kcal/g)和水化能力产生饱腹效应，它们提供粘度和膨胀，影响肠道中的机械感受器，影响血糖反应和饱足信号，增加肠道蠕动能力，并作为肠道微生物的主要底物。

3.2.2 脂肪

脂类具有较高的能量密度，其消耗可能通过间接机制直接影响食物摄入和能量消耗以及代谢，从而影响肥胖和相关疾病。

脂类在能量积累中起着核心作用，在内分泌系统中起着重要的作用。 它在食欲和饱腹感调节中的作用包括通过感觉受体和化学感受器。

「瘦素」——脂肪与下丘脑饱腹调节中心沟通的桥梁

瘦素是由脂肪组织分泌的一种激素，分泌过程依赖胰岛素。

当体内瘦素水平较高时，会告诉大脑身体有足够的能量储备，不要再吃了。瘦素和胰岛素共同作用于下丘脑和其他脑区，从而抑制食物摄入，增加能量消耗。

可想而知，当瘦素长期处于低水平时，往往伴随着肥胖。低水平的瘦素在不断告诉大脑，身体正处于饥饿状态，那么很有可能出现暴饮暴食，且身体在不停地储存能量。

脂肪的质量比数量更重要

越来越多研究表明，除了饮食中的脂肪或碳水化合物的数量外，膳食脂肪的质量（主要指天然不饱和脂肪而不是反式或饱和脂肪)比数量更能决定饮食对维持体重的影响。

具体来看，目前研究的重点是脂肪质量与脂肪酸饱和度之间的关系。饮食中omega-6脂肪酸与omega-3脂肪酸比例的增加与通过脂肪生成、脂肪组织稳态、脂肪褐变和炎症机制增加体重，和肥胖的风险增加有关；这种增加是由脑-肠-脂肪轴通过二十烷类代谢物和大麻素系统的多动介导的。

在这种情况下，高脂肪消耗在与脂肪沉积有关的胃肠道调节喂养途径上的调节作用影响脂质的吸收和利用，减弱饱腹信号并促进超重，其中CCK、ghrelin、GLP1和其他神经肽与食欲和/或饱腹有关。此外，中链甘油三酯、共轭亚油酸和多不饱和脂肪酸引起不同的饱腹和胃排空效应。

多不饱和脂肪酸导致能量摄入和消耗变化

此外，多不饱和脂肪酸在调节身体成分中起着重要作用；它们导致能量摄入和支出的定向变化，以及脂质周转和脂肪生成的改变，这是由神经内分泌系统介导的。 此外，一些饮食脂质可能通过促进棕色和米色脂肪的生成来刺激产热功能。脂类也在食物质地中起作用，这可能会使食物更可利用。

当然，脂肪也可能表现出不受欢迎的口感，这可能导致食物的排斥，从而干扰能量的摄入，而不是餐后机制。

肥胖也与诱导的食物偏好和减少底物氧化、酮体保留糖代谢机制以及脂溶性和/或脂肪生成活动或炎症途径的变化有关。

要想躲避肥胖，建议多选不饱和脂肪酸

单不饱和脂肪酸摄入量与BMI呈负相关，突出了脂肪分布的重要性，而不仅仅是脂肪总量，而且影响的差异取决于遗传背景。

食用不饱和油不易导致肥胖，这表明脂肪质量比数量更重要（例如，在那些遵循地中海饮食模式的人中观察到的或食用树坚果）。

平时食用油的选择，动物油脂，橄榄油，菜籽油等都要好于色拉油、调和油。

3.3.3 蛋白质

蛋白质分子结构的多样性，决定了蛋白质分子有多种重要功能，它们也负责酶的功能，并具有内分泌调节作用。

膳食蛋白质和蛋白质衍生分子表现出食欲和厌食效应，这些效应是由不同的神经肽和肠道激素介导的，如胃饥饿素、CCK、GLP1、PYY、瘦素、胰岛素和特定氨基酸。

蛋白质有助于保持无脂质量和骨骼肌，从而促进能量消耗的维持。

高蛋白饮食对食欲抑制作用

蛋白质在饮食中的比例影响食欲调节和饱腹感的诱导。例如，干预性研究显示了高蛋白饮食对食欲抑制的饮食作用。富含蛋白质的饮食导致饥饿感减少，能量消耗和β-羟丁酸水平增加，这可能有助于食欲下降。

蛋白质具有明确的产热性质，由氧化磷酸化过程、尿素合成、糖异生和能量产生的中间代谢途径介导。然而，对于特定的蛋白质，如明胶gelatin，在食欲抑制中也有独特的作用。

此外，与蛋白质诱导饱腹感有关的机制已被归因于氨基酸（如酪氨酸、色氨酸或组氨酸）、影响胃迷走神经传入的鲜味物质（包括味精）或来自甜味剂的阿斯巴甜(asp-phe)氨基酸有关的钙传感受体，它们调节食欲和餐后发生热。

长期动物蛋白的摄入对体重的维持有不利的影响

然而，一些长期的纵向分析表明，动物蛋白的摄入对随访5年后体重的维持有不利的影响。 事实上，每天食用250克肉类，与肉类含量较低的等热量饮食相比，每年增加422克体重。因此，以动物蛋白和糖为代价增加植物蛋白的摄入量，可能是在人群水平上对抗超重和肥胖的一种方法。

这些结果突出了营养素比例的重要性。但进一步的研究还应侧重于蛋白质来源和血糖指数的体重维持。

04

同样的饮食，不同的肥胖机制

4.1 遗传机制

些人哪怕吃正常量的食物就是比一般人容易发胖，这可能与肥胖基因有关。

接下来我们来看看遗传因素在决定个体对肥胖的易感性方面起了什么样的作用。

不同的研究报道了总脂肪比例与食物摄入调节相关基因（如FTO）、脂肪代谢相关基因（如APOA5）和脂肪细胞分化相关基因（如PPARG）在不同人群中的相关性。

肥胖基因——FTO基因（减弱饱腹感）

与没有风险等位基因的参与者相比，那些具有FTO变异型rs9939609的风险等位基因的人报告显示，主观饱腹感较低，能量密集的食物消耗较高，这表明具有遗传风险的个体已经损害了中枢神经系统的饱腹感。

此外，有FTO危险等位基因的个体也会消耗较高比例的能量作为脂肪，显示出肥胖风险的加剧。

APOA2等位基因的存在通过调节参与支链氨基酸和色氨酸代谢的途径，在饱和脂肪酸摄入时增加的肥胖风险。

与之相反，APOA5基因变异rs662799的C携带者，在饮食中消耗更多的脂肪，则可避免肥胖。

然而需要注意的是，即便是检测出了携带肥胖基因，也不意味着必然会永久肥胖下去；反之，不携带肥胖基因，也不意味着可以胡吃海喝不运动。要知道决定肥胖的不止基因这一个因素，例如还有肠道微生物群的影响。如果说基因难以改变，那么肠道菌群是你可以改变的。

4.2 菌群介入，影响肥胖

易患肥胖的个体的肠道微生物群可以通过饮食、益生菌等来改变。

碳水化合物（即纤维）、蛋白质和脂肪的摄入会影响肠道微生物群，从而使宏量营养素与微生物群相互作用。具体在前面 深度解读|饮食、菌群和健康 一文有详细阐述。

个体微生物群的组成是独特的，是个体代谢和体重状况的代表性特征。

人体摄入宏量营养素、肠道菌群与肥胖的关系

↑, 增加；↓,减少；NA，不可用；第三列：营养物质和/或饮食基质与肠道微生物群之间的关系

4.2.1 菌群和肥胖之间的关系

菌群丰度和种类

菌群丰度和多样性与肥胖呈负相关

开创性的研究已经描述了微生物群与肥胖之间的关系。数据显示肥胖小鼠的厚壁菌数量增加，拟杆菌数量减少，这表明这些微生物对宿主代谢可能有影响。这些结果随后在人类研究中得到证实，研究人员在研究中比较了来自瘦弱或肥胖人群的样本。

一些研究描述了肥胖者从食物中获得的能量的增加，并确认了这些人粪便样本中的普雷沃氏菌科和古细菌的增加。此外，菌群丰度和多样性与肥胖呈负相关，即菌群丰度低的人会提高肥胖、胰岛素抵抗和血脂异常，以及低度全身炎症风险。

基于谷禾人群队列数据发现：

肠道菌群的种类数量肥胖人群要显著低于对照人群（下左图），均值分别为850比1150，这一现象与之前的研究是符合的。

有害菌

在有害菌属的丰度水平分布上，肥胖人群也要高于对照人群（上右图）。进一步对具体菌属进行分析，发现肺炎克雷伯氏菌的丰度水平肥胖人群更高（下左图）。

有益菌

而双歧杆菌属的水平肥胖人群普遍较低。

一项调查同卵双胞胎脂肪摄入质量的研究发现，单不饱和脂肪酸与双歧杆菌和拟杆菌的丰度正相关，以及n-3多不饱和脂肪酸和乳酸杆菌之间存在正相关关系，而n-6多不饱和脂肪酸与双歧杆菌是负相关。

一些学者认为在饮食中添加益生菌可以减轻饮食中脂肪对体重维持和脂肪积累的有害影响。

4.2.2 菌群如何影响肥胖

肠道微生物群影响超重和肥胖个体体重和代谢的两种可能机制。

（1）肠道微生物群将不可消化的膳食纤维发酵为短链脂肪酸，这些脂肪酸可能由肠道上皮代谢或是葡萄糖和脂质从头合成的一部分。

（2）由于紧密连接处的薄弱导致肠道通透性增加，来自肠道细菌表面的脂多糖（LPS）能够进入循环，并可能在包括肌肉、肝脏和脂肪组织在内的多个组织中引起免疫反应、炎症、巨噬细胞浸润和胰岛素抵抗。胰岛素抵抗和厌食激素（包括胰高血糖素样肽1[GLP-1]和肽酪氨酸[PYY]）在下丘脑的表达降低刺激了食物摄入的增加。

此外，微生物蛋白水解可产生支链氨基酸和芳香烃氨基酸，可通过微生物交叉喂养（微生物物种的营养相互依赖性）进一步代谢。这些交叉喂养途径的紊乱导致这些氨基酸的吸收增加，并与肠道完整性和胰岛素抵抗的损害有关。

糖化和蛋白水解代谢物生产中涉及的微生物群落和微生物网络

肠道微生物的功能群、主要代谢途径和生产碳水化合物和蛋白质发酵产生的代谢物的中间体，包括糖解产物短链脂肪酸，琥珀酸盐和乙醇以及蛋白质水解代谢产物，包括氨、吲哚和酚类化合物、硫化氢、胺和支链脂肪酸（BCFAs）。

4.2.3 饮食干预菌群

越来越多的研究者开始对饮食模式感兴趣，以研究食物营养素、肠道微生物群组成和遗传背景之间复杂相互作用。

对人类的一项观察研究表明，肥胖人群中存在小肠细菌生长，他们的饮食中富含碳水化合物和精制糖，缺乏纤维。饮食蛋白质和碳水化合物对肠道微生物群的调节作用改变了蛋白质消化的衍生物。这些衍生物通过改变芳香族和支链氨基酸的发酵以及作为短链脂肪酸的前体而影响能量代谢。

基于谷禾肠道菌群的营养量化算法可以有效反映和量化饮食及营养元素的摄入状况。数据显示，主要饮食结构中精制糖摄入肥胖人群显著偏高，而乳制品摄入普遍偏低。

低聚果糖调节菌群，与短链脂肪酸相关

膳食宏量营养素发酵产生的代谢产物对肥胖及合并症的影响已被广泛研究。此外，碳水化合物的摄入被认为是调节肠道微生物群的主要因素。纤维通过调节胃肠道转运、葡萄糖吸收和粪便膨胀起作用，影响血糖反应和饱足信号。

可发酵膳食纤维在调节微生物方面具有关键作用肠道菌群。益生元，如低聚果糖，对肠道微生物群的影响已经被一些研究证明，因为低聚果糖调节了粪便细菌和其他细菌的丰度，并与丁酸盐的产生相关，通过降低下丘脑神经肽Y的表达而减少食物摄入。

还研究了富含糖和人工甜味剂的“西方”饮食对肠道微生物组成的影响。不幸的是，甜味剂和人体肥胖的肠道微生物群之间的联系仍然不清楚。

富含脂肪的饮食可以通过抗菌作用影响肠道微生物群

其他研究者认为，饮食中脂肪摄入对体重增加的影响，除了燃料正平衡外，还有其他作用。富含脂肪的饮食可以通过抗菌作用影响肠道微生物群，从而促进与肥胖相关的全身促炎症状态相关的失调的发展。对健康人进行的横断面研究发现，在习惯性饮食中，拟杆菌和放线菌与脂肪摄入呈正相关。此外，与体重指数相关的现有分类群也与饱和脂肪酸的热量摄入相关。

一些作者认为在饮食中添加益生菌可以减轻饮食中脂肪对体重维持和脂肪积累的有害影响。

饮食干预后的菌群改变与脂肪改变有关

一项包括一组健康人的对照喂养试验发现，在饮食干预24小时后，肠道微生物群的组成发生了变化，这些变化在10天内保持稳定。

研究人员还报告了长期饮食模式和菌群之间的关系。更具体地说，他们报告了拟杆菌与蛋白质、动物脂肪之间的关系，普雷沃菌与碳水化合物之间的关系。同样，其他营养干预措施也发现，大鼠高脂高糖和低脂高糖饮食后，菌群多样性下降。这些饮食与肠道炎症的增加和迷走神经-肠道-大脑连接有关，与身体脂肪沉积的增加有关。

综合分析，健康饮食模式下菌群丰富，炎症减少

以往有多项研究显示肥胖人群在一些炎症指标上较高，存在长期的炎症反应，我们针对主要炎症指标的统计检验同样发现以下炎症指标确实存在偏高：

一些作者强调了使用肠道微生物群的综合分析和代谢组学分析，客观评估对坚持健康的饮食模式，帮助阐明这些模式的明确饮食组成，如地中海饮食模式，以及它们在心脏代谢紊乱的复杂相互作用中的假定作用。例如，一项试验报告了肥胖人群中与健康饮食模式相关的肠道微生物群组成的差异。更具体地说，那些饮食摄入更健康的人微生物丰富，炎症标志物浓度降低。

在这些研究的基础上，数据表明饮食因素之间的相互作用，如宏量营养素分布、肠道微生物群组成和遗传背景，与肥胖中发现的代谢障碍有关。对个体特征和对肠道菌群代谢物相关敏感性的整体研究有助于制定新的策略，提高肥胖防治效果。

05

结 语

现在我们知道各种因素会改变肠道微生物，肠道微生物的改变会导致代谢功能的改变，从而导致肥胖。

要精确的了解每个人具体的问题所在，就要了解自己的肠道微生物，请进行肠道菌群检测，不仅了解肠道菌群，更重要的是能找出肥胖背后的真正问题，确定适合你身体的方式，科学减肥。

相关阅读：

饮食习惯与疾病风险

主要参考文献：

San-Cristobal R, Navas-Carretero S, Martínez-González M Á, et al. Contribution of macronutrients to obesity: implications for precision nutrition[J]. Nature Reviews Endocrinology, 2020: 1-16.

de Clercq, Nicolien C., et al. “Gut microbiota in obesity and undernutrition.” Advances in Nutrition 7.6 (2016): 1080-1089.

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Hou X, Lu J, et al. Impact of waist circumference and body mass index on risk of cardiometabolic disorder and cardiovascular disease in Chinese adults: a national diabetes and metabolic disorders survey. PLoS One. 2013,8(3): e57319.DOI: 10.1371/journal.pone.0057319.

Geographic variation in prevalence of adult obesity in China: results from the 2013-2014 National Chronic Disease and Risk Factor Surveillance. Ann Intern Med. 29 October 2019.2.

Lone Jameel Barkat,Koh Wee Yin,Parray Hilal A et al. Gut microbiome: Microflora association with obesity and obesity-related comorbidities.[J] .Microb. Pathog., 2018, 124: 266-271.

20种有效改善肠道健康的科学方法

本文由谷禾健康整理编译自：VICTORIA FRANKEL, Give Your Gut a Chance: Microorganisms and Your Immune System和VIOME,19 Science-Backed Ways to Improve Your Gut Health

每当一种传染病威胁到许多人的健康时，免疫系统如何运作的话题就经常出现。

从整体上看，人类的免疫反应有助于对抗病原体。在生病的时候适当地使用免疫系统是保持我们健康的一个重要部分。由于我们的免疫系统很大一部分位于肠道内，肠道微生物群在决定我们的免疫反应何时以及如何运作方面起着关键作用。

大家都希望保持自身免疫系统的最佳运作，特别是随着呼吸道疾病的流行和病毒感染影响我们的生活。随着人们对季节性传染病如流感和新近出现的新型冠状病毒（又名COVID-19）的日益关注，许多人正在寻找是否有办法提高自身持续免疫能力。

但最新的科学表明，你的肠道微生物群、你吃的食物和整体免疫力之间可能存在持续的有益关系。

01

我们生活在一个微生物的世界里

商店里或者仓库中，衣服上，书桌上…到处都是微生物。只要正常生活，身体就不可能处于一个无菌的环境。

事实上，我们的身体内充满了细菌，这些微生物帮助我们维持体内平衡和免疫酶活性——通常是通过与我们的免疫细胞相互作用。这已经被证明会影响自身免疫、炎症、癌症和我们对疾病的易感性。

读过我们前面文章的小伙伴都知道，体内的微生物群对人体而言十分重要，例如肠道微生物群对我们的消化系统、神经系统、免疫系统等等都有重要影响。

肠道微生物群

把你的肠道微生物群想象成一种工具。当功能失调时，它会在执行正常任务时造成无意伤害，就像一把刀。然而，当保持在合适的条件下，它可以精确地执行。

一个健康的肠道微生物群功能良好，不太可能损害你的肠道。这个薄薄的屏障可以保护微生物在它们喜欢的环境中安全健康，并且防止它们出来探索我们不愿看到的其他领域，比如你的血液。

当肠壁受损时，我们的肠道微生物群就可以逃逸到不属于它们的地方，就像其他器官一样。当它们在这些区域累积时，它们分泌的毒素和代谢物会导致炎症反应，损害这些组织并导致慢性疾病的发展。

因此，我们需要重视肠道微生物群健康平衡。它也在感染时控制我们的免疫反应中发挥作用。

排除病原菌

许多共生或有益的微生物有助于保持肠粘膜的健康。

当我们的肠道微生物群能正常产丁酸（关于短链脂肪酸详见之前的文章 你吃的膳食纤维对你有帮助吗？），它有助于我们的肠道保持强大和完整。相反地，我们的肠壁在感应到病原体时，通过保护这些共生细菌群落而得到回报。事实上，我们的免疫细胞可以非常“聪明”地识别特殊的肽。

可见，肠道微生物组在人体对感染的免疫反应和维持整体健康中起着至关重要的作用。

02

如何判断肠道健康

从排便看肠道健康

“定期”是描述良好排便习惯或正常排便功能的一种方式。

我们经常谈论排便要规律，但这常常被误解为需要每天上厕所排便。有些人两天排便一次就很焦虑，觉得好像不健康，其实没必要过于担心。

但只要保持规律，轻松的排便，每天排便1-3次至每周3次都是正常的。饭后约30分钟内排便（通常是早餐），但是这可能因人而异。

怎么知道我是否有肠道健康问题？

导致日常生活中许多因素导致肠道微生物群失衡。这些包括睡眠质量差，压力大，不健康的食物以及过度使用抗生素。肠道健康问题有很多物理指标。这些包括：

胃部不适

腹胀，腹泻，便秘等都是肠道健康问题的明显症状。当肠道微生物群达到平衡时，人体可以更有效地消化食物。

自身免疫问题

一些科学家认为肠道健康不良会加剧体内炎症。这会阻止免疫系统正常运行。结果可能是自身免疫性疾病。

对甜食的渴望

如果你总是想吃甜食类食物，那么肠道细菌可能会失衡。高糖饮食和加工食品会减少肠道的有益菌，然后你会渴望更多的糖分，从而导致炎症，而炎症会导致多种疾病，甚至被证明会导致癌症。

体重变化

在没有改变运动习惯或饮食习惯的情况下，体重是否正在增加或减轻？

肠内失衡会阻止人体适当调节血糖水平，储存脂肪和吸收营养，从而影响体重变化。

睡眠质量差

如果你有患有失眠症，那么长期疲劳是不可避免的结果。要知道90％的血清素是肠道产生的，而不是大脑。由于血清素是调节睡眠所必需的，因此肠道不健康就会影响你的睡眠质量。

皮肤问题

如果患有湿疹或其他皮肤疾病，则可能源于肠道不健康。肠道内部发炎可能导致蛋白质泄漏到您的体内。这会刺激您的皮肤并引起皮肤问题。

食物不耐受

如果您的身体无法消化某些食物，则可能是由于肠道中有害菌所致，可能导致腹痛，腹胀，恶心和腹泻。肠道菌群问题也可能引起食物过敏。

呼吸困难 / 哮喘

不同的肺部疾病会受到肠道微环境变化的影响，反之亦然。由此研究人员提出了“肠-肺轴”连接的概念。

在哮喘中，微生物群是导致这两者之间相互作用的重要因素。在人类和小鼠的研究中，肺和肠道之间的联系已经被反复证明。这种相互作用可以是双向的；肠道微生物可以影响肺部的免疫反应，而肺部刺激可以导致肠道反应。来自肠道菌群的短链脂肪酸对肺部的促炎反应有抑制作用。

详细可见之前的文章「哮喘」最新研究已逐步渗透到更精细层面

口臭

如果患有口臭（长期口臭），则可能会导致肠道菌群不平衡。口臭是微生物在牙龈，舌头和牙齿之间生活的结果。这些微生物产生难闻的气味。有时，这可能是由于牙龈疾病引起的。

心情变化

肠道和大脑通过迷走神经相连。肠道微生物组会产生或消耗大量的神经递质。微量营养素缺乏会损害您的肠道功能，并导致肠道渗漏。

除了许多其他慢性疾病外，肠漏也被认为是抑郁症和焦虑症的潜在病源。认为肠漏是因为肠道没有健康的边界。发生这种情况时，可能会出现疾病。当肠道屏障破裂时，它会开始连锁反应，引起低度的慢性炎症。

肠道功能受损也会影响您的身体利用多巴胺和血清素的能力。这些激素对你的快乐感知是必不可少的，也是积极精神态度中的另一个关键要素。肠道可以产生大约一半的人体多巴胺和90％的血清素。因此维持肠道健康平衡可以直接支持你的心理健康。

详细可见之前的文章 深度解读 | 肠道菌群和中枢神经系统的关系

另外，还可以通过粪便的颜色，形状，频率等去判断，详细了解可移步文末附录部分。

03

20种科学方法有助于改善肠道健康

如果你在搜索引擎或者网站上搜索改善肠道健康时，会发现大量建议。遍历所有内容时，你会发现大多数内容都是模棱两可的，甚至是冲突的。所以我们需要基于更科学的方法来改善。

完美的饮食神话

我们有时候往往会有这样一种想法，一种饮食方式比另一种饮食方式更好，其实对于个人的肠道微生物群来说是不可取的。同样，某些食物可以改善每个人的肠道健康的想法也不是完全正确的。

肠道微生物组科学揭示出一个事实，那就是没有普适的健康饮食。每个人（及其肠道微生物群）都需要不同的食物。 所以不要想着光吃某几种所谓的健康食物来拯救你的肠道健康。

在改善肠道微生物组方面，适用于所有人的唯一饮食建议是，每个人都应尝试食用多种食物。这是因为饮食多样性更有利于菌群维持健康平衡。

试想一下，你的微生物就好比一群挑剔的孩子，每个孩子都会去吃自己喜欢的食物。当您吃各种食物时，就相当于喂食了各种微生物。 

有时候，谷禾的消费者会对拿到的报告中的饮食建议感到不可思议。

比如说他们发现自己的列表里不推荐的有类似酸菜和泡菜这样的食物，这些食物对他们来说是非常传统，家常，甚至不可或缺的食物。为什么是不推荐的呢？这可能是因为这两种食物中的组胺含量都很高，而他们的肠道无法很好地处理。

什么肠道健康建议适用于大多数人？ 

你可以采取多种措施来改善肠道健康。下面列出的20种是以科学为基础的方法。这些结果不仅基于科学文献，而且还基于我们在大数据检测内容。 

我们将建议分为两部分。首先，您可以通过避免破坏性因素来改善肠道健康。 

避免这8种破坏肠道的食物和行为

1. 糖

很多女生爱吃甜食，实际上甜食对肠道微生物组不是很友好，因为像白色念珠菌这样的有害细菌和真菌会增多，已显示高糖饮食可改变肠道微生物组的组成和功能。

2. 人造甜味剂

人造甜味剂也不是一个很好的选择，因为它们会导致代谢异常，生物失调或生态系统失衡。

人造甜味剂会改变肠道微生物组的组成和功能，从而促进葡萄糖不耐症，从而导致疾病。尽管它们似乎可以代替糖，但最好是避免使用人造甜味剂。 

3. 转基因生物（GMO）食品

许多人都知道转基因生物不好，但并不知道为什么。这很大程度上与肠道微生物组有关。

对转基因食品进行了改良，使其能够在草甘膦等苛刻的杀虫剂中存活下来。本质上，当食用转基因食品时，是在增加这些化学药品的摄入量，这些化学药品会损害肠道。杀虫剂是专门为清除细菌而开发的，因此它们在肠道中起到一定作用也就不足为奇了。 

4. 防腐剂

我们知道加工食品对我们的健康不利，它也会影响肠道微生物群。具体来说，防腐剂，比如聚山梨酯80和羧甲基纤维素（CMPF），它们是许多加工食品中常见的乳化剂，直接改变了肠道微生物群的组成。所以尽可能避免吃加工食品，以改善肠道健康。

5. 抗生素

抗生素会导致肠道微生物群发生很大变化，因为它们无法区分有益菌和致病菌。有些情况其实没必要使用抗生素。总的来说，在服用抗生素时，我们需要格外小心。

详细可见之前的文章 细菌的天敌抗生素，如何用好这把救命的双刃剑？

6. 非甾体抗炎药

非甾体抗炎药（NSAID），例如某些药物，会改变肠道微生物群的组成，并导致肠道渗漏。当胃肠道内壁在其连接处有缝隙时，会发生漏肠，这会使颗粒泄漏到血液中。这可能导致炎症，最终导致自身免疫性疾病。 

当我们受到轻伤或不适时，我们会习惯性地拿出这些药物。在知道它们会损坏肠道的情况下， 是否值得用药需要慎重考虑。

7. 压力

肠道和大脑通过迷走神经不断交流-通过肠道激素信号传导，神经递质产生以及其他微生物代谢产物。压力会影响肠道微生物群，而肠道微生物组会影响压力，因此这是双向的。 也许你知道减轻压力对健康有益，但更具体地说，它对肠道健康有益。

8. 吸烟

有研究表明吸烟会改变肠道菌群的组成。研究人员发现，吸烟者的肠道菌群与肥胖者相似，并具有炎症性肠病等症状。

因此建议不吸烟。

增强肠道健康的12个技巧

1. 肠道微生物群检测

肠道健康在整体健康中起着关键作用。它会影响免疫系统，神经系统，皮肤和大脑。随着科学家对微生物群的了解越来越多，他们越认识到找到平衡是必不可少的。

每个人都有自己独特的肠道菌群，处于自己独特的平衡中。不同的食物将以不同的方式影响我们所有人。

也许令你感到不适的食物会使别人充满活力和健康，对你有效的药物对别人无效。因此，通过肠道微生物检测，可以更加准确了解自己的肠道健康状况并制定营养计划以满足自身需求。人们会越来越倾向于采用更加个性化的健康方法。

2. 出去接触大自然

在过去的几十年中，人们普遍从农村搬到城市。这意味着我们不再像以前那样接触大自然。平时生活里，我们不会经常在户外玩耍或在农场工作。因此，生活中遇到大量菌的机会减少了。 

你可以在户外玩耍时有意地将自己暴露于多种微生物中，从而使菌群加以平衡。安排远足，海滩时间和自然之旅，以扩大对不同生态系统的接触，尤其是在旅行时！（当然疫情期间，还是建议大家尽量减少出行或者戴口罩去人少的地方）

3. 尝试间歇性禁食

间歇性禁食对肠道微生物组非常重要。虽然9到12个小时不吃东西可能听起来是很长一段时间，但如果在晚上9点左右停止进食并且直到早上9点才吃早餐，就可能已经很接近了。某些细菌在卡路里密集的环境中繁殖，而另一些细菌在卡路里缺乏的环境中繁殖。

因此，偶尔可以在晚餐和早餐之间适当延长些时间不吃东西——这样你的微生物组可能会感谢你。

4. 充足的睡眠

没有充足的睡眠是一件很糟糕的事，不良的睡眠也会影响肠道微生物组的组成。

每晚7~8个小时睡眠很重要，但保证睡眠质量也同样重要。高质量意味着你正在进入深度的恢复性睡眠阶段。如果你每天醒来时感到不安，或者每天下午很困，那么就值得考虑一下您的睡眠质量，因为它会影响健康的许多方面。

5. 运动适量

锻炼对肠道微生物组也非常有用。运动被证明可以丰富多样性，并增加有益菌。

可以尝试通过快步走，慢跑甚至是瑜伽来提高整体肠道健康。不过凡事需要有个度，别把自己当成是极限运动员那样疯狂运动，过量的运动可能会带来不利影响。

6. 尊重自然规律

许多肠道菌群都以24小时昼夜节律运行。遵守自然规律可以帮助一切顺利进行。我们知道轮班工作和时差会导致疾病，这可能就是原因之一。 

7. 养宠物

研究发现，养宠物的孩子过敏和肥胖的几率反而较低。普遍认为这是因为动物身上的微生物会增加孩子的整体微生物多样性。这意味着你那些心爱的宠物也可能有助于保持肠道健康。听信谣言盲目抛弃宠物不可取。

8. 保持家庭微生物组健康

有些家庭非常爱干净，用洗碗机洗碗，经常对屋子全面消毒，包括孩子的玩具，衣服等等。在这样的环境下长大的孩子出去后反而更容易过敏。

在家里接触的微生物太少，菌群多样性下降。实际上孩子的生长发育过程中，在不断构建起自身免疫系统，需要有外界的微生物参与刺激体内的免疫细胞。过度清洁相当于干涉了免疫系统的正常构建，脆弱的免疫系统抵御不了外界的细菌，一出家门便容易生病。

9. 选择当季的有机蔬菜

当季的有机蔬菜不仅可以避免农药，而且还可以吸收土壤中的污物，产生有益的微生物。而且，其实用各种清洁剂洗那些蔬菜没有必要。

10. 有针对性的吃对自己有益的食物

每个人都是独特的，所以我们都有不同的营养需求，无法一劳永逸地解决所有饮食问题。有时候可以相信直觉，它知道哪些食物会帮助您，哪些食物现在对您有害。

没有普遍的健康饮食，可能普遍认为“健康”的食物实际上对您不健康。比如说建议您多吃蔬菜，蔬菜和坚果具有抗炎作用。但不一定适合你。

菠菜，麸皮，大黄，甜菜，坚果和坚果黄油都含有草酸盐。你体内如果没有那些能够将草酸盐代谢成无害物质的微生物，那么这些含草酸盐的食物对你来说就可能是有害的。

换句话说，像菠菜这样的“健康食品”实际上对这类人来说并不健康。同理，食品中的多酚通常被认为非常健康，但对某些人来说也不一定合适。

11. 如果可能，选择自然分娩

婴儿出生时会获得第一批微生物。当婴儿通过阴道出生时，其最初的微生物与母亲的阴道相似。通过剖腹产出生的婴儿，其微生物组中有来自母亲的皮肤微生物，这与以后生活中某些疾病的高风险相关。

当然有些危急时刻，剖腹产是必须的。这里要表达的是：阴道分娩对建立强大的健康微生物群很重要。当然，研究人员寻找能够抵消剖腹产负面影响的解决方案也很重要。

12. 母乳喂养超过配方

母乳喂养有助于婴儿的微生物群的构建，并奠定坚实的基础。有趣的是，母乳中含有人乳低聚糖，科学家最初认为这是没用的，因为婴儿无法消化它们。现在我们知道它们是专门用来滋养微生物的。

毫无疑问，肠道微生物群几乎在您健康的各个方面都可以发挥作用。这意味着我们必须开始照顾微生物群。

04

结 语

疫情面前首先要遵循国家预防COVID-19的指导方针：出门戴上口罩，避免聚众，勤洗手，避免触摸脸部，以减少感染病毒的机会。

同时，通过增强免疫系统从内部增强防御能力。而一个健康的肠道微生物组不仅能对冠状病毒等传染性病原体做出反应，而且还有助于防止潜在的具有危险性的过度免疫反应。

适当选择合适的措施，科学改善肠道健康。也许在防新冠的同时，也悄悄预防了某些慢性疾病的发生。

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附录一： 粪便颜色和性状

你吃的食物会影响大便的颜色。例如，如果你正在吃很多深绿色的多叶蔬菜，则您的大便可能看起来有点绿色。根据你的便便，需要注意以下几点：

浅色便便

如果您发现浅色的，几乎是粘土或黄棕色的便便，则可能是粪便中脂肪浓度较高的迹象。这可能与胆囊，肝脏或胰腺的炎症有关。它也可能与胆汁释放不足有关，胆汁用于帮助饮食中的脂肪处理。

黑色便便/红色便便

假如你最近没有吃过几份黑甘草或蓝莓、黑莓或甜菜等深色食物，则可能表明肠道出血。这可能是由多种不同的原因引起的：直肠或肛门出血，胃壁肿胀，食物或消化系统中附着的异物或癌症迹象。尽管原因可能有所不同，但如果您发现粪便中有血迹，最好咨询医生。

通常，健康的排便应该呈现出自然的棕色阴影。但是，大便的形状也可能表示饮食或健康状况下降。

附录二： 粪便形状和大小

比较便便的最简单方法之一就是查阅“布里斯托尔粪便图表”，这是一种易于理解的图表，可帮助您直观地观察便便的变化。该图表已在全国各地的医生办公室使用，可以通过描绘您可能遇到的7种不同类型的粪便，可靠地帮助您评估消化过程中健康指标的普遍差距。

便秘（1-2型）

类型1：单独的硬块

如果您发现肠蠕动似乎很小，粪便呈硬块状，很可能是您患有严重的便秘。这可能是由于脱水或低纤维饮食引起的。许多不同的药物也会引起便秘，与医生讨论如何减轻便秘症状可能会有所帮助。

类型2：香肠状但块状

比严重的症状好一级，但很可能您仍在遭受轻度的便秘。大便比小肿块大是一个明显的指标，表明您已接近足够的水分，但仍有改善的空间。增加运动量，水分摄入和吃富含纤维的食物可能会改善粪便的硬度，并有助于调节肠蠕动。

普通（3-4型）

类型3：香肠形但有裂纹

定期排便的一个很好的例子，可以保持其形状并易于通过。这表明您的饮食相对稳定，消化过程相当正常。

类型4：像香肠或蛇

理想的例子：易于通过并保持其形态。最佳排便。

可能表明腹泻（5-7型）

类型5：柔和的斑点

随着大便开始软化，这可能是营养吸收不良，消化道中气体过多或大便中脂肪浓度升高的迹象。如果持续存在，也可能是胃肠道感染或胰腺炎的征兆。它本身可能并不重要，但是如果同时有任何其他症状，寻求专业医护人员可能会有所帮助。

类型6：蓬松的碎片

在这种情况下，这可能是食物不耐受或过敏的迹象。此外，如果您正受到胃部感染或在使用通便药的情况下，可能会遇到这种糊状的大便。

近期服用抗生素也可能导致大便稀疏。如果症状持续，请寻求专业帮助。

类型7：水状，无固体碎片

腹泻的经典症状会对您的健康造成严重影响，并增加您脱水的风险。这不是正常的大便，长时间的剧烈腹泻不只是令人不舒服，还可能是有害的迹象。

腹泻表明您的消化系统正在排斥某些东西，并且可能与您可能遇到的细菌或寄生虫或病毒或近期旅行相关。此外，长期症状可能提示其他疾病，例如肠易激综合症，克罗恩氏病或其他消化系统疾病。如果您长时间腹泻，请立即就医。

相关阅读：

关于微生物群与胰腺癌，你想知道的都在这里

【部分参考文献】

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肠道微生物群与心血管疾病：机遇与挑战

冠状动脉疾病是世界范围内最常见的健康问题，也是导致发病率和死亡率的主要原因。肠道菌群在人类新陈代谢、免疫力等方面扮演重要角色，与冠状动脉疾病之间也存在相关性。

 本 文 要 点

1、肠道微生物群与CAD发展之间的因果关系尚未得到证实。

2、必须通过微生物代谢产物和与免疫系统的相互作用，了解肠道微生物群与CAD发展之间潜在的直接和间接因果关系。

3、动态因素包括我们的饮食和人口因素，如年龄、性别和种族，也会影响我们的肠道微生物群和CAD的发展，并使这一问题复杂化。

4、需要跨学科的方法来揭示肠道微生物群的调节所涉及的因素及其与CAD发展的关系。

5、阐明系统层面的多方面因素参与微生物介导的机制和人类健康与疾病，可以进一步指导新的预防和治疗CAD的干预措施。

01

冠状动脉疾病是什么

高血清胆固醇（高胆固醇血症）是最常见的心血管疾病（简称CVD，下同）的危险因素，称为冠状动脉疾病（简称CAD，下同）。

动脉壁内胆固醇沉积（斑块）的累积可导致动脉粥样硬化。

高胆固醇血症可能有遗传来源，并影响主要负责体内胆固醇稳态的身体功能，包括从头合成、肝脏分解代谢和胆汁分泌，以及肠道吸收。

胆固醇的来源

人体内的胆固醇来源于两种来源，在肝脏中从头合成，或通过饮食和富含胆固醇的食物进入人体。人体内大约四分之一的胆固醇来自膳食摄入（外源性），其余的是通过甲羟戊酸途径从头合成（内源性）。

冠状动脉疾病的形成

体内合成的胆固醇分为高密度脂蛋白胆固醇（简称HDL，下同）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL），后者可进入循环系统，成为冠状动脉疾病的重要标志。

我们看看LDL如果多了会发生什么：

可以看到它聚积在动脉壁动脉，随着时间的推移脂肪沉积形成斑块，使动脉狭窄。

高密度脂蛋白胆固醇与CAD呈负相关，也就是说它在阻止CAD的形成。通过发挥抗炎和抗氧化作用以及促进反向胆固醇转运（RCT）而具有抗动脉粥样硬化的功能，RCT可以消除低密度脂蛋白胆固醇。

然而，在炎症、糖尿病和氧化应激等条件下，高密度脂蛋白可能会失去其抗动脉粥样硬化特性，并成为促动脉粥样硬化（功能失调）物质。此外，低密度脂蛋白胆固醇升高是冠状动脉疾病的危险因素，这可能是由于巨噬细胞摄取低密度脂蛋白胆固醇颗粒导致泡沫细胞和动脉粥样硬化。

肠腔在控制体内胆固醇平衡方面起着重要作用，并通过胆固醇吸收负责外源性摄入。管腔内胆固醇可以来自不同的来源，主要来源于（i）我们的饮食，（ii）通过肝胆途径的胆汁，（iii）通过经肠胆固醇流出途径的新胆固醇。

图1  腔内胆固醇的外源性和内源性来源

在肝脏中，胆固醇被代谢成胆汁酸，并通过肝胆途径分泌到胆汁中，其中ATP结合盒转运体G5/ATP结合盒转运体G8（ABCG5/G8）在胆固醇从肝细胞流出到胆汁中起关键作用。

TICE是肝胆通路的另一种途径，血液中的胆固醇可以通过低密度脂蛋白受体（LDL-R）直接进入肠细胞，并通过ABCG5/G8和ATP结合盒转运体B1（ABCB1a/b）进入肠腔。

然后，肠腔中的胆固醇通过Niemann-Pick C1-like 1（NPC1L1）被吸收到肠细胞中，并与乳糜微粒结合进入循环系统，或者被肠道微生物群还原为低吸收的粪烷醇（5B胆固醇-3B-ol），大部分排出体外。

其他因素影响胆固醇平衡和CAD发展

除了体内多种胆固醇来源的复杂相互作用外，还有许多其他因素可以影响胆固醇平衡和CAD的发展，包括肠道微生物群。

到目前为止，已经有人认为肠道微生物群的改变与代谢紊乱如肥胖、糖尿病和心血管疾病（与年龄、性别和宿主遗传学无关），包括动脉粥样硬化、血脂异常、高血压和心力衰竭之间的关系。

这种联系可以通过直接（通过代谢物）和间接途径（通过免疫系统）实现。

肠道微生物群在维持宿主健康方面发挥着多重关键作用，包括帮助宿主获得营养和能量、肠上皮内稳态、药物代谢和毒性、免疫系统反应以及抵御病原体。

微生物代谢产物影响

这些微生物还可以产生微生物产物，如尿毒症毒素、胆汁酸、氧化三甲胺（TMAO）、短链脂肪酸（SCFA）、脂多糖（LPS）、一氧化氮、维生素K、维生素B复合物、肠道激素和神经递质，它们可以改变宿主的新陈代谢和在健康和疾病状态下影响身体功能。例如，对动脉粥样硬化的易感性已经被证明可以通过小鼠模型中的微生物群移植进行转移。

迄今为止，许多传染源与动脉粥样硬化有关，包括幽门螺杆菌、巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、肺炎衣原体和牙龈卟啉单胞菌。

Mitra等人的一项研究结果表明，在有症状和无症状的动脉粥样硬化斑块之间，微生物群表现出差异，无症状斑块有更多的宿主微生物群，包括卟啉单胞菌科、拟杆菌科、微球菌科和链球菌科。与此相反，有动脉粥样硬化斑块中含有越来越多的致病菌，包括螺旋杆菌科、奈瑟菌科和Thiotrichacaea.

此外，由于肠道微生物群整体状态的破坏而导致的肠道微生物群失调与炎症的增加有关，炎症与动脉粥样硬化的发展有关。

肠道菌群与高血压、心力衰竭、中风等有关

最近，肠道微生物群及其代谢产物的改变也与高血压和血管功能障碍有关。心力衰竭还与特定的肠道微生物种类有关，如增加的大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、病毒性链球菌等。

一项研究表明，有症状的中风和短暂性脑缺血发作患者的肠道微生物群发生了改变，增加了机会致病菌，包括肠杆菌、巨球菌、Oscillibacter和脱硫弧菌。

此外，肠道微生物群有能力导致血脂成分的实质性变化，从而影响冠状动脉疾病的发展。例如，厚壁菌如罗伊氏乳杆菌与高密度脂蛋白相关，而Eggerthella属与低密度脂蛋白相关。

目前，肠道微生物群与CAD发展之间的因果关系尚不清楚，因为许多其他人口因素，如年龄、性别和种族，不仅会影响肠道微生物群和胆固醇水平，而且还会影响我们的饮食，这是影响肠道微生物群和全身胆固醇水平的另一个组成部分。因此，体内胆固醇的调节是一个复杂的机制，其中的各种因素在一个多方面的系统中交织在一起。

图2 CAD发展中涉及的多方面机制

肠道微生物群可以直接（通过代谢物）和间接（通过免疫系统）导致CAD。

因此，需要进一步的研究，以了解潜在的机制，并确定哪些微生物菌株或其代谢物负责CAD的发展。

接着，将通过直接和间接途径探讨肠道微生物群的动态因素及其对高胆固醇血症和冠状动脉疾病发展的影响。

02

肠道菌群对CAD的直接影响

肠道微生物可以通过代谢产物如胆汁酸、粪甾醇、短链脂肪酸和三甲胺-N氧化物的产生直接影响高胆固醇血症和CAD的发育。

胆汁酸调节

肠道微生物可以影响肝脏胆固醇代谢的调节，并在改变胆汁酸中发挥作用，从而影响全身胆固醇水平（图3）。

图3  影响CAD的多方面机制

肠腔胆固醇和饮食的外源性和内源性来源，以及影响免疫系统和CAD发育的肠道微生物机制。

胆汁酸由限速酶胆固醇7-α-羟化酶(CYP7A1)形成，是肝脏中胆固醇的主要代谢产物，有助于脂肪、营养物质和亲脂维生素的吸收，也有助于调节脂质、葡萄糖和能量代谢。

初级胆汁酸

初级胆汁酸与氨基酸、牛磺酸或甘氨酸结合形成胆汁盐，分泌到胆汁中并储存在胆囊中，直到它们释放到小肠，在小肠中乳化脂肪并形成胶束，这些胶束被吸收到肠细胞中。

在肠道中，初级胆汁酸，如胆酸(Ca)和鹅去氧胆酸(CDCA)被肠道微生物和胆盐水解酶(BS H)去结合，形成次级胆汁酸，包括脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)和熊去氧胆酸(UDCA)。

胆固醇水平如何升高

腔内所有共轭和未结合的胆汁酸可被重新吸收（95%）并转运回肝脏，但UDCA和LCA除外，它们大多在粪便中排出。肠道内胆汁酸等信号分子也能激活核受体法尼样X受体（FXR）和膜G蛋白偶联的胆汁酸受体Gpbar-1（aka TGR5）。通过这一机制，胆汁酸可以下调胆汁酸的合成，从而导致胆固醇水平升高。

胆汁酸激活FXR的顺序为CDCA>DCA>LCA>CA，FXR可诱导成纤维细胞生长因子19（FGF19）激活成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4），抑制CYP7A1下调胆汁酸合成。

FXR还可以通过增加ATP结合盒B亚家族成员11（ABCB11）的表达，减少肝细胞对胆汁酸的摄取，增加胆汁酸的分泌。

原发性和继发性胆汁酸比值可能与高胆固醇血症和CAD的发生有关。例如，在Myerhofer等人的一项研究中，心力衰竭患者的血浆原发胆汁酸减少，继发胆汁酸与原发胆汁酸的比例更高，胆汁酸也可以通过以下途径在心血管功能中发挥作用。

肠道菌群调节胆汁酸比率

通过调节心房和心室心肌细胞的通道传导和钙动力学及调节血管张力来降低心率。此外，研究人员还提出，肠道微生物群调节胆汁酸比率，如果不平衡和处于不健康状态，可能导致继发胆汁酸减少，从而增加初级胆汁酸，如CDCA，激活FXR，降低胆汁酸生成，从而增加胆固醇和CAD的发展。因此，肠道微生物群及其相关的潜在机制需要进一步研究。

粪甾醇生产

某些肠道微生物群长期以来一直被认为具有将可吸收胆固醇转化为粪甾醇的能力，这是一种还原的不可吸收粪甾醇，可在粪便中排出。

人体内的粪甾醇的产生开始于生命第一年的后半段，并依赖于性别，年轻女性比年轻男性具有较高的转化能力。

此外，目前认为，人类群体中微生物胆固醇到粪甾醇的转化率是双峰的，高转化率显示几乎完全的胆固醇转化，而低转化率显示粪甾醇含量不到粪便中性固醇含量的三分之一。

迄今为止，分离出的降胆固醇菌株仅限于真杆菌属和拟杆菌属，但仍有许多有待发现。

使用动物模型，口服E. coprostanoligenes导致饮食诱导的高胆固醇血症兔的血浆胆固醇浓度显著降低，并在最后一次细菌喂养后持续至少34 天。

对于人体模型，已经有许多关于肠道胆固醇代谢的研究，并且已经提出了人类血清胆固醇与人类粪便中粪烷醇/胆固醇比率之与粪便中粪甾醇/胆固醇的比值呈反比。

然而，这些研究采用了非常小的样本量，样本群体的变化有限，缺乏不同的人口背景，包括未能成功地分离出导致粪甾醇/胆固醇转化的特定微生物菌株。此外，参与胆固醇在肠道内转化为粪甾醇的基因或酶仍然未知。

短链脂肪酸生产

SCFAs是一种微生物衍生的代谢物，由复杂的碳水化合物发酵形成，影响宿主的一系列过程，如宿主微生物信号、能量利用和结肠pH的控制，从而影响微生物群的组成和肠道运动。我们在前面的文章中也多次提到短链脂肪酸主要有乙酸、丙酸和丁酸。

拟杆菌门可以产生乙酸、丙酸，厚壁菌门可以产生丁酸。SCFAs与Alistipes putredinis、拟杆菌、罗斯氏菌（产丁酸盐的菌）、直肠真杆菌和普氏粪杆菌 呈正相关。

此外，它们通过调节紧密连接蛋白的表达，在维持肠屏障完整性方面起着不可分割的作用。

SCFAs还可以通过阻止胆固醇合成和/或将其转移到肝脏来降低血脂水平；因此，它们被认为是CAD发展中的一个保护因素。

在某些CAD患者和高血压患者的肠道失调中，通过激活G蛋白偶联受体41（GPR41），产生SCFA的细菌也减少了。因此，他们在体内的作用和目标需要进一步的研究。

三甲胺-N-氧化物（TMAO）生产

膳食胆碱、甜菜碱、磷脂酰胆碱、卵磷脂和左旋肉碱参与了TMAO的产生，TMAO是冠状动脉疾病发展的危险因素。

平时我们吃的包括红肉、鸡蛋、鱼、芸苔类蔬菜、花生和大豆等都有这种TMAO。

TMAO升高带来风险

具体来说，TMAO水平的升高与死亡和非致命性心肌梗死或中风的风险增加有关。肠道微生物通过(A)胆碱的产生和(B)中间分子三甲胺(TMA)的产生也在TMAO的产生中起作用。

最近才发现肠道微生物通过磷脂酶D(PLD)酶产生胆碱的能力。微生物介导的TMA分子可以进入宿主循环并进入肝细胞，在那里它被含黄素单加氧酶(FMO)代谢为TMAO，该酶由肝脏、肾脏和其他组织中的FMO基因编码。

高TMAO的产生会影响脂质，并导致43%的CAD风险，因为胆固醇转运的减少和胆汁酸运输、组成和细胞池大小的改变。TMAO还与C-反应蛋白(CRP)和内皮功能障碍有关，在肠道通透性增加的情况下，与LPS内毒素水平升高有关。此外，它还会导致钙的释放和血小板的高反应性，从而影响CAD。

与TMAO产生的有关菌群

肠道微生物群对TMAO的产生有重要影响。 健康人体内有大量产生TMAO的菌群，厚壁菌门与拟杆菌门的比例为2:1。在覆盖36个物种的102个基因组中发现了TMA的产生，TMA的产生者包括厚壁菌门，变形菌门，放线菌门，在拟杆菌门中不存在。

一项研究发现，来自于厚壁菌门和变形菌门的8种细菌，为生产TMA消耗了60%的胆碱，分别是：

产氢厌氧菌、天冬酰胺梭菌、C. hathawayi, 

C. sporogenes, Escherichia fergusonii, 

Proteus penneri, Providencia rettgeri, Edwardsiella tarda.

其他与高TMAO产生相关的肠道微生物包括：

阿克曼菌、孢子杆菌、普雷沃菌和瘤胃球菌，它们与动脉粥样硬化性冠心病相关。 

因此，代谢物包括胆碱、TMA和甜菜碱可以帮助预测CAD的发展。 例如，益生菌或药理学干预可以用来抑制或阻断特定的微生物代谢途径，以减少产生TMAO的微生物。

03

肠道菌群对CAD的间接影响

肠道微生物也可以通过间接途径导致CAD的发展，如操纵我们的免疫系统。

动脉粥样硬化是由动脉粥样硬化血栓形成引起的一种慢性炎症性疾病，在这种疾病中：

(A)表面侵蚀可导致血栓形成

(B)细胞因子损伤的斑块破裂，从而导致暴露的凝血系统，导致血流抑制并诱导CAD。

因此，炎症引起的巨噬细胞和免疫系统与CAD有关。例如，最近高白细胞(WBC)计数被认为是CAD发展的危险因素。

此外，一项研究确定IL-22途径可作为代谢性疾病治疗干预的新靶点，因为IL-22能提高胰岛素敏感性，保护肠粘膜屏障和内分泌功能，减少内毒素血症和慢性炎症，调节肝脏和脂肪组织的脂质代谢。

在我们体内，氧化低密度脂蛋白(oxLDL)也可以通过激活内皮细胞、巨噬细胞和T细胞来发挥促动脉粥样硬化和促炎症作用。

巨噬细胞可吞噬oxLDL，导致炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-18、IL-37和泡沫细胞，从而加重CAD。

TNF-α还通过激活蛋白激酶c(PKC)参与包括糖尿病在内的CAD危险因素，PKC增加胰岛素受体底物的磷酸化，导致其失活。

T细胞还可导致促炎细胞因子IL-2、IL-12和干扰素γ(I FN-γ)，这与动脉僵硬有关。 泡沫细胞、T细胞和巨噬细胞一起会导致出现脂肪条纹，从而促进CAD的发展。

肠道菌群群落结构影响免疫系统

肠道微生物群的群落结构可以极大地影响我们的免疫系统。 例如，肠道微生物群的低基因计数(LGC)与高WBC计数有关，正如前面所说的，这是CAD的危险因素。 在我们的肠道微生物群中，Lactobacillus reuteri 的存在与高WBC计数有明确的联系。

低基因计数的个体患有代谢紊乱，导致脂蛋白异常和促炎状态，这可能导致CAD。 LGC也与高的CRP水平相关，而与高CRP水平相关的则是低Oscillibacter、粪便杆菌 和瘤胃球菌。

类似于TLRs的模式识别受体(PRRS)在肠道中的表达也受到肠道细菌的调节，这些细菌帮助宿主通过病原体相关的分子模式(PAMP)和共生细菌在病原体之间导航，以及激活免疫感觉细胞。

此外，我们的菌群会影响调节性T细胞(Treg)，它们的减少会加剧感染结果，增加自身免疫性疾病、过敏和癌症的风险。例如，Prevotella可以通过Toll样受体2(TLR2)激活介导炎症反应，从而导致炎症和细胞17(Th17)免疫反应。

心肌炎

心肌炎（一种炎症性心脏病）进展为致死性心肌病，可能依赖于肌球蛋白特异性Th17细胞在肠道中由半乳糖苷酶模拟肽共同作用于多形拟杆菌和粪杆菌，可促进炎症性心肌病的发生。

梭菌簇IV增强Treg细胞丰度，并导致抗炎分子的产生。因此，TLR2与CAD发病机制有关。

NOD/CAD是另一类PRRS，通过激活炎症细胞因子和/或激活免疫系统转录因子NF-κb来识别应激反应并激活炎症半胱氨酸蛋白酶，从而产生炎症分子。

肠漏也会导致肠道微生物衍生成分如PAMP的易位，包括LPS，从而导致促炎细胞因子的产生。

SCFA既能抗炎也能导致炎症

肠道微生物代谢物，如SCFA，也可以影响免疫系统，通过激活G蛋白偶联受体41(GPR41)、GPR43和GPR109A，通过诱导由叉头盒P3(Foxp3)启动子控制的Treg细胞，发挥抗炎作用。

此外，它们还能产生抗炎的肠道激素，如胰高血糖素样肽1(GLP-1)。 虽然SCFAs有许多积极的作用，但它们的产生也可以通过激活Toll样受体4(TLR4)来改变细菌平衡并导致炎症。因此，它们在免疫系统中的作用有待进一步研究。

TMAO激活炎症小体影响免疫系统

肠道微生物衍生的TMAO也可以通过激活TXNIP-NLRP3炎症小体影响我们的免疫系统，导致炎症标记物如TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1B的表达，这些炎症标记物可以通过产生胆固醇填充的泡沫巨噬细胞促进动脉斑块的形成，最终导致CAD。

TMAO还能促进PKC/NF-κb激活，促进血管细胞黏附分子1（VCAM-1）的表达和单核细胞的黏附。 除了影响高密度脂蛋白胆固醇和抗炎特性外，肠道微生物及其相关代谢物还可以通过非炎症诱导途径影响免疫系统。

胆汁酸抑制NF-κb转录

初级（肠道菌群解偶联）和次级胆汁酸，例如，可以通过FXR和TGR5受体抑制促炎细胞因子的NF-κb转录。激活TGR5也能保护LPS诱导的炎症和动脉粥样硬化。

细胞因子如IL-10的积极作用

此外，某些细胞因子，如IL-10，可以产生积极的作用，如通过诱导RCT增加动脉粥样硬化病变中乙酰化和oxLDL的摄取和流出，从而降低小鼠血清胆固醇和动脉粥样硬化斑块。

这种细胞因子还可以通过增强肝脏驻留的Kupffer细胞的吞噬作用来降低总胆固醇。 这些细胞代表体内80%-90%的巨噬细胞，可能是治疗的新靶点。

剖析免疫系统和代谢系统之间的复杂相互作用，将有助于深入了解CAD的生物学基础，以及当前和未来的治疗方法如何影响代谢。

饮食影响整个系统

如前所述，我们身体胆固醇的四分之一来自饮食摄入。 这导致了关于饮食胆固醇是否会影响CAD发展的越来越多的争论。 

我们的饮食可以通过直接食用富含胆固醇的食物和间接地通过改变肠道微生物及其群落结构、胆汁酸的产生、粪甾醇的产生、SCFA的产生和TMAO的产生来影响胆固醇的调节和CAD的发展，从而使问题复杂化。例如，地中海饮食引起的肠道微生物群的有益修饰已被证明能改善肥胖、炎症、CAD和其他相关代谢改变。

图4  微生物群、饮食和CAD

饮食通过食用富含胆固醇的食物直接或间接地影响胆固醇水平和CAD的发展，影响免疫系统，并导致肠道微生物群及其代谢产物如胆汁酸、黄连醇、短链脂肪酸和TMAO的调节。

这种饮食更加强调水果、蔬菜和豆类，并且与增加SCFA水平有关。此外，饮食可以通过改变与胆固醇有关的炎症反应来影响免疫系统调控和CAD发展。

一项结果表明，高盐摄入会影响肠道微生物群，特别是通过消耗鼠李糖乳酸菌和增加Th17细胞和高血压。补充L.Murinus 可以抑制Th17的激活，改善高血压。

此外，与高饱和脂肪组成的饮食相比，由高不饱和脂肪组成的西方饮食可导致拟杆菌增多、厚壁菌和Bilophila wadsworthia（亚硫酸盐还原微生物）减少，而由高饱和脂肪组成的饮食可导致LDL胆固醇和B.Wadsworthia菌增加，这种菌与血脂异常和炎症增加有关。

高蛋白和高脂肪饮食也与瘤胃球菌的增加和拟杆菌、梭状芽孢杆菌、双歧杆菌、直肠杆菌、赤霉菌的减少有关，并增加粪便中的胆汁酸浓度，包括DCA浓度的升高，这可能导致肝癌。

此外，这些饮食可以激活与炎症反应相关的TLR4，如促炎细胞因子、Th1、CD4和T细胞，从而导致Treg细胞的下调。在高脂饮食诱导的糖尿病中，来自肠道的细菌被转移到组织和血液中，这取决于CD14和NOD1。

通过益生菌逆转

然而，这种菌血症可以通过益生菌（双歧杆菌）逆转，这可以减少糖尿病期间细菌、脂肪组织和炎症的粘附和移位。

在另一项研究中，益生菌给药干酪乳杆菌可减少细菌易位，并通过增加Clostridium coccoides, C. leptum 和总乳酸杆菌来改变肠道微生物群。与纯素相比，杂食动物产生更多的TMAO，高纤维饮食导致更高的SCFA和增加肠道菌群多样性。

饮食影响人体胆固醇的概念是一个持续的争论，需要进一步研究。尽管许多研究表明高饮食胆固醇与CAD之间存在直接关系，但其他研究表明饮食中胆固醇的临床影响在疾病发展中可能很小或可忽略不计。

这场争论可能是由于对胆固醇水平管理中涉及的身体系统机制缺乏了解，以及由于人群和环境因素而异的正常肠道菌群所致。

饮食的抗炎作用

我们的饮食也可以通过与转录因子NF-κB和PPAR-Y相互作用的omega-2（n-3）多不饱和脂肪酸产生抗炎作用，下调促炎基因，抑制TLR4的激活，从而产生抗炎反应。例如，我们饮食中的花青素（如蓝莓）是一种抗氧化剂，可以通过增加其多样性影响肠道微生物群，从而减少炎症反应。

益生菌和益生元也被深入研究，并证明通过增强肠道屏障、调节免疫功能和预防致病性感染来改善肠道环境。它们与炎症减少和SCFA、拟杆菌、双歧杆菌和厚壁菌减少有关。口服益生菌甚至可以降低22-33%的胆固醇，这是由于BSH的活性。

例如，益生菌乳酸杆菌和双歧杆菌可以通过（a）增加胆固醇对从头合成胆汁酸的需求，或（b）降低胆固醇溶解度并减少其吸收，从而解除胆汁酸的结合并增加排泄。

尽管益生菌和益生元越来越受欢迎，但关于它们可能对健康和疾病产生的特定免疫和生理影响的问题仍然存在，因此需要进一步研究。

微生物群、人口因素和CAD

在精确医学时代，一个关键的挑战是弥合人口统计学因素、肠道微生物组成和心血管系统病理生理学之间相互作用的知识差距。

除了男性和女性之间的环境和社会差异（如职业危害、生活方式、社会压力和获得医疗保健）外，在疾病发展、性染色体和性激素方面的差异也会导致CAD患者的性别差异。更具体地说，最近已经显示了血脂和脂蛋白代谢的性别差异，以及针对血脂异常的性别特异性考虑因素。

尽管CAD被认为是一种“男性疾病”，但越来越多的证据也显示了CADs在女性中的重要性，并提高了在CADs的发生、诊断、治疗和预后方面性别相关差异的认识。

例如，女性在生命后期更容易患上这种疾病。 这可能是由于激素和更年期的变化，这可能会影响胆固醇的比率，随着雌激素的停止产生，脂蛋白向低密度脂蛋白转移，并远离高密度脂蛋白胆固醇的女性。

性别差异也与肠道微生物群的整体结构有关

正如前面所讨论的，这与CAD的发展有关。 例如，在一项研究中，分别在男性和女性中发现普氏菌属、巨单胞菌属、梭杆菌属、巨球型菌属、双歧杆菌属、瘤胃球菌属和阿克曼菌属的显著增加。

然而，男性和女性在微生物多样性方面没有显著差异。基于性别和性别相关的肠道微生物组成和CAD发展差异的研究仍然很少，需要在数量和深度上进行扩展。

种族差异影响高胆固醇血症和CAD发展

种族差异，虽然在研究中经常被忽视，但已知影响高胆固醇血症和CAD的发展。 种族差异可以捕捉来自社会、经济和文化差异、人类遗传变异、生物地理祖先差异以及生活方式和饮食差异的生物变异。

包括吸烟、血压、肥胖和胆固醇在内的CAD发展的危险因素也可能在不同的种族群体中有所不同，导致某些群体的CAD发病较早，预后较差。例如：

南亚人是一个高风险族裔群体，他们的体育活动率较低。

居住在美国的非裔美国人也有更高的CAD发展风险，这可能是由于生活方式、环境因素和社会经济因素。非裔美国人有相对较高的糖、较高的钠和较低的钾含量的饮食，这会导致更高的血压。

此外，种族和饮食差异与微生物组成和丰度的变化有关，甚至与肠道微生物群的变化相关性比遗传、年龄、性别和BMI等其他因素更强烈。例如，对健康个体中农村和城市地区微生物群的比较研究报告显示，与美国和欧洲的人口相比，居住在非西部和/或农村地区的人口具有更高的菌群多样性。

在Deschasaux等人的另一项研究中，在荷兰人口中观察到较高的肠道微生物群多样性，在南亚的肠道微生物多样性最小，加纳人、土耳其人和非洲人在中间。 在荷兰人群中也观察到了厚壁菌增多，拟杆菌减少。而在南亚人群中观察到了放线菌增多。

人口因素之间的相互作用，如性别、年龄和种族，以及它们与我们的饮食、肠道微生物组成和CAD发展的联系，说明了我们身体因素在健康和疾病状态中的复杂性。 因此，需要更多的研究努力来理解这些因素涉及肠道微生物群的变化和CAD的发展。

图5  微生物群、老化和CAD

与全身炎症和不良健康结果相关的衰老机制。

身体中的胆固醇也会受到自然衰老过程的影响，这是一个无法控制的危险因素，会导致全身胆固醇代谢失调（图5)。到2030年，预计将有10亿人超过65岁。一般来说，衰老过程与心脏结构和功能的逐渐恶化有关，以及促进CAD发展。此外，通过衰老过程，LDL胆固醇水平可以增加，HDL胆固醇水平可以降低，这可能导致CAD的发展速度增加。

衰老过程引起的其他因素包括降低CYP7A1酶活性（减少胆汁酸合成的调节）、降低肝脏LDL胆固醇受体(降低LDL胆固醇清除率)和增加NPC1L1（胆固醇吸收介质）。衰老还影响肠道微生物群落，因为疾病的积累，饮食的变化，运动和行动能力的减少，以及某些药物的使用。然而，也有相反的发现表明不同年龄组参与者的肠道微生物结构没有显著差异。

总的来说，衰老与肠道失调增加有关，与肠道微生物多样性呈负相关。还有，参与SCFA生产的基因数量也随着年龄的增长而降低。 衰老影响免疫系统，全身炎症是衰老的标志之一，也是许多年龄相关疾病(包括CAD、糖尿病和癌症)风险增加的原因之一。

此外，衰老是由一个正反馈回路调节的，其中老年人的慢性全身炎症与发展和年龄相关的疾病有关，然后通过这些条件也导致炎症反应的增加。 由于这些原因，在精确的时代，包括年龄、性别和种族等人口因素的研究是有必要的。

精准医疗中的微生物群

目前，许多技术可以用来分析肠道微生物群与人类免疫学、神经学和内分泌学的关系。 由于这种关联及其在精确医学中的潜力，人类微生物群正在被广泛研究，作为粪便微生物移植、益生菌和益生菌的治疗靶点。.

尽管如此，对于大多数疾病，机械洞察力和翻译应用仍然很少。 人体微生物群在组成和空间上是动态变化的，微生物群个体内和个体间的变化可以通过药物的直接生物转化或微生物与宿主免疫系统的相互作用等间接机制影响药物的疗效和副作用分布。在此讨论了多种新出现的策略，以精确操作复杂的微生物群落，以改善心血管病的治疗结果。

预计在未来将朝着包含人类和微生物基因组以及它们的综合代谢活动的精确医学的包容性观点积极转变。

微生物群与药物治疗

目前治疗高胆固醇血症和CAD的方法包括能有效降低胆固醇水平的药物，并用于治疗高胆固醇血症和CAD预防。

他汀类药物可通过影响胆固醇合成中的限速酶达到疗效

羟甲基戊酰辅酶a(HMG-CoA)还原酶抑制剂，又称他汀类药物，可影响胆固醇合成中的限速酶，并已彻底改变了高胆固醇血症的治疗方法。在各种研究中，这类药物已被证明了显著降低总胆固醇、LDL胆固醇和甘油三酯的能力，并使HDL胆固醇增加18%、25%、11%和5%。

尽管他汀具有疗效，但它们对非LDL胆固醇的影响是有限的；因此，其他针对非LDL胆固醇的药物可能补充他汀类药物以降低心血管风险。例如，依泽替米贝是另一种降低LDL胆固醇的药物，它通过阻断NPC1L1来减少饮食和胆汁胆固醇的肠道吸收，从而降低LDL胆固醇。在一项随机对照的人类试验中，Ezetimibe（10毫克/天）与安慰剂相比，胆固醇吸收减少54%，总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇分别减少15%和20%。

药物副作用

虽然许多药物可以降低胆固醇，但它们往往是次优的，昂贵的，并带来许多不必要的副作用。例如，他汀类药物与骨骼肌、代谢和神经效应以及其他可能的副作用有关。他汀类药物治疗的停止也与心血管预后不良有关。此外，Ezetimibe还表现为肝脏内源性胆固醇合成的代偿性反馈上调，并可增加TICE，从而导致血清胆固醇升高。抑制肝NPC1L1还可提高胆汁中胆固醇饱和指数，并有可能导致胆结石。因此，虽然这些常规治疗提高了许多患者的生活质量和预后，但CAD和高胆固醇血症仍然是一种进行性疾病（注：进行性疾病是指症状不断加重、患者状况不断恶化的疾病。）。

另一个挑战是肠道微生物群可以通过干扰药物的药代动力学或药效学直接和间接地影响药物。例如，辛伐他汀、罗舒伐他汀和阿托伐他汀（3种常用的他汀类药物）显示了肠道微生物群调节的证据。 代谢物如胆汁酸，也可以影响药物的药代动力学，通过竞争药物运输机制跨越肠腔，或通过影响肝脏的摄取。 进一步研究肠道微生物群参与CVD和药物反应的分子机制将改善CVD患者的预后，并朝着微生物精确医学的方向发展。

接下来将提出纳米技术在揭示参与CAD开发的潜在机制以及针对微生物组的治疗工具方面的潜在作用。

基于微生物群和纳米医学的方法

纳米医学被美国国家卫生研究所(NIH)定义为纳米技术在控制生物系统、治疗、诊断和疾病监测方面的应用。这一新的医学分支是一个多学科的科学领域，其重点是开发至少在一个维度上位于0.1-100nm范围内的诊断和治疗纳米物体。

图6 纳米医学、微生物群和计算机辅助设计

纳米粒子在纳米医学中有许多应用，可以帮助预防、诊断和治疗CAD。利用纳米颗粒了解潜在的身体机制（即蛋白质电晕分析）、药物传递（即微生物组和代谢组靶向治疗）和清除颗粒（即对于低密度脂蛋白胆固醇调节免疫系统）可以导致一个更健康的肠道微生物群和免疫系统，从而导致更好的整体健康状态，排除CAD的发展。

纳米医学的进一步发展也可能为现代医学中许多悬而未决的问题提供解决方案，包括高胆固醇血症和CAD（图 6)。 肠道微生物群与疾病发病机制之间关系的研究已被证明是一项困难的任务，特别是在找出原因方面。纳米医学中的纳米粒子可以帮助我们理解CAD发展的潜在机制。纳米粒子在体内应用的一个有用方面是生物分子/蛋白质电晕的形成（即一层生物分子，在纳米粒子与生物流体相互作用时覆盖其表面）。

在2014年，研究人员发现不同疾病患者的蛋白质电晕分布有很大的不同，尽管传统的血浆分析显示变化可以忽略不计。这种效应被称为“疾病特异性蛋白电晕”，已在其他地方复制，并用于早期发现疾病，包括神经退行性疾病。

最近发现，使用具有不同物理化学性质的纳米粒子（即称为蛋白质电晕传感器阵列技术）可以提高蛋白质电晕疾病检测的灵敏度、特异性和预测精度。

另一种更好地分析血浆蛋白并获得有关CAD发展的有用信息的潜在方法可能是磁悬浮。 研究人员最近使用超顺磁性氧化铁纳米粒子悬浮血浆蛋白，发现悬浮血浆蛋白产生椭球图案。

机器学习和液相色谱质谱法证明有用信息

利用机器学习和液相色谱质谱方法，研究人员证明悬浮血浆蛋白的模式包含了有关血浆供体健康光谱的有用信息。这一策略对于监测肠道微生物模式与CAD之间的相互作用是非常有帮助和可行的。

先进的数据分析技术提供机会

利用先进的数据分析，可以定义蛋白质/生物分子模式，与肠道微生物剖面的变化和CAD的发生和/或进展有很强的关联。关于重要生物分子变异的作用的知识可能提供一个宝贵的机会，不仅是根据特定的肠道微生物模式早期检测CAD（这反过来又会影响血浆生物分子的组成)，但也用于开发新的治疗方法，基于肠道微生物的操作使用口腔纳米技术。

前瞻性诊断和治疗应用显示巨大潜力

目前的前瞻性诊断和治疗应用包括成像、组织工程、常规药物、蛋白质和遗传物质的传递以及清除低密度脂蛋白胆固醇。例如，肝素和壳聚糖共轭磁性纳米粒子在从血浆中去除LDL胆固醇方面显示出巨大的潜力。

纳米粒子还能调节免疫系统，并已被用于诱导抗炎作用。例如，广谱ROS清除纳米粒子已被用于小鼠研究，以有效地减少氧化应激和局部和全身炎症。

此外，壳聚糖纳米粒通过降低肠上皮单层的通透性和促炎细胞因子的分泌而诱导抗炎作用。而且，基于纳米粒子的TLR信号抑制剂已被用于减少炎症和治疗炎症性疾病。

纳米技术用于菌群调节来影响CAD发展

虽然纳米医学在CAD的诊断和治疗方面显示出相当大的和日益增长的能力，但其在调节肠道微生物群中的应用仍在研究中。 最近，研究人员提出了几种基于纳米技术的策略来控制肠道微生物的组成。通过调节肠道微生物有利于健康状态，可以直接（通过代谢物)和间接(通过免疫系统）以积极的方式影响CAD的发展。

为此，纳米粒子可用于传递与HDL增加、SCFA增加、LPs减少和促炎细胞因子减少有关的特定肠道微生物群。清除纳米粒子也可以优化(I)LDL胆固醇、(II)LPS、(III)促炎细胞因子和(IV)TMAO的摄取和去除。这些机制在预防、诊断和治疗CAD方面有很大的潜力，可用于替代目前具有各种负面副作用的药物。

然而，在设计安全有效的纳米粒子以预测和治疗CAD方面仍然存在挑战。此外，蛋白质电晕还会影响纳米载体的药物释放谱。因此，为了诊断和治疗CAD，需要进一步研究这些新的治疗平台的生物学特性。

临床微生物群研究的其他挑战

将人类肠道微生物群整合到临床设计和设置中并不是一项容易的任务，而且可能面临许多挑战。 通常，人类微生物群多年来保持稳定。尽管肠道环境中具有长期的稳定性和可塑性，但个体间变异和个体内变异是很重要的。

内部变异可能是由于婴儿过渡期（即出生胎龄、分娩类型和喂养方法）、年龄和抗生素使用等环境因素造成的。此外，肠道微生物群的变异可能是由于性别、肠型、体重指数(BMI)和生活方式、运动频率、种族、饮食和文化习惯等外部因素造成的。

这种个体间和个体内变异的研究可能会使旨在识别生物标志物和研究肠道微生物群组成和作为群体比较的功能的研究复杂化。因此，将微生物群科学纳入临床实践，可以通过考虑CVD患者的变异来确定生物标志物和治疗方法。

用于研究肠道微生物群的样本收集（即粪便样本）也会导致许多挑战，没有标准的协议和共识可用于质量保证和下游分析。例如，肠道微生物群在唾液、上消化道、下消化道和粪便样本中含有不同的微生物群落。上消化道显示孪生球菌、韦荣球菌属、奈瑟菌、梭菌、链球菌、普氏菌、假单胞菌和放线菌增加，而下消化道显示粪杆菌、瘤胃球菌和拟杆菌增加，这可能会产生方法上的挑战。

此外，粪便细菌群落的组成可能受到实验设计和收集、储存和DNA提取等程序等因素的影响。已经证明，粪便微生物群不是粘膜微生物群的代表，因此超越单一“以粪便为中心”的观点是至关重要的。 除了样本的类型外，纵向抽样可以增加对稳态的理解，但肯定会给病人带来负担。

测序技术和“组学”发展

最后，在过去的十年里，肠道微生物群研究的激增可归因于成本效益高的下一代测序(NGS)技术和人类基因组、代谢组学和蛋白质组学数据等“组学”数据的发展。NGS技术加上生物信息学的进步，彻底改变了微生物群的领域，取代了以培养为基础的方法，从而可以分析日益复杂的微生物群特征。

然而，局限性仍然存在。 例如，16SrRNA测序可以可以导致对细菌的观点是单一领域的，必须考虑生命的各个方面，包括真菌、原生动物和病毒。

宏基因组学研究可以将科学视角扩展到一个多领域的视角，但也存在局限性。 例如，由于参考数据库缺乏密切匹配，很大一部分数据无法分配功能特别是病毒数据。 因此，这些复杂的组学数据需要专门的统计模型来考虑成分、稀疏性、批效应、技术噪声、采样噪声和时空变化等因素。

解释“组学”数据也会产生挑战，因为特定肠道微生物丰度的变化可能不会被推断为对宿主有保护或有害的影响。例如，在Vandeputte等人的一项研究中，微生物的绝对数量（用定量微生物组谱测量）比经典的相对丰度谱更好，因为后者不能提供关于分类群丰度或代谢潜力变化的方向性程度的信息。

建立一个知识库，以巩固微生物群领域中不相连的知识片段，以及微生物组研究中的其他创新（包括自然语言处理，文本挖掘，分类学表示和全领域词汇标准化），可以加快理解并帮助推进因果关系。因此，为了建立肠道生态系统动力学的全球模型，需要在质量控制、方法学和使用流程方面进行进一步的研究和改进。

04

结 语

为了充分了解肠道微生物在人类健康中的作用，并指导高胆固醇血症和CAD发展的治疗干预措施，必须阐明相互关联的身体因素共同作用，影响肠道微生物群和疾病发展。

对这些复杂机制的进一步研究是阐明肠道菌群介导的机制的组成部分（例如，通过先进的纳米医学技术、数据科学以及种族和性别等因素），这反过来又可以导致更有效和高精度的基于微生物群的CAD预防和治疗方法，最终可以降低CAD的社会和经济成本。

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参考文献

Kazemian N, Mahmoudi M, Halperin F, et al. Gut microbiota and cardiovascular disease: opportunities and challenges[J]. Microbiome, 2020, 8(1): 1-17.

「哮喘」-更精细和全面的认识

哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，影响着全世界3亿多人。预计到 2025 年将增加到 4 亿人。

咳嗽、胸闷、喘息、气促等

发作起来的窒息感让人崩溃

喘息是如何发生的？

当一个人没有哮喘症状时，呼吸是顺畅的，空气可以很容易进出肺部，一旦哮喘发作，肺部就发生了变化：

气道外平滑肌收紧，气道或支气管肿胀，管内粘膜开始产生粘液，粘液堆积进一步堵塞导致喘息，哮喘的征兆开始了。

哮喘带来的危险

除了咳嗽，患者会觉得呼吸困难，哮喘发作时，炎症会导致呼气比吸气更困难，肺部过度充气，人体超负荷进行肺部空气循环，各个器官和组织氧气输送量减少，甚至无法维持人体正常运作而发生危险。

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于是，人们开始积极寻找各种方式来预防或者治疗哮喘。吸入器便出现了，它可以喷雾的形式将药物传送到受感染的呼吸道，以快速缓解症状。然而，人们对哮喘的病因依然缺乏足够的了解。

目前普遍认为，出现哮喘与多种因素有关，例如遗传、环境、感染和营养因素等。

随着研究的深入，逐渐发现在生命早期就已经有了潜在危险。对哮喘的研究也逐渐渗透到更精细的层面。

01

哮喘不是一种单一的疾病

哮喘不是一种简单的疾病，具有许多表型和内型，目前，对于这些复杂致病过程的最佳理解，在于它们的二元分类：分为2型哮喘或非2型哮喘。

· 2型哮喘

临床上常见的2型哮喘有早期过敏性哮喘、晚期嗜酸性哮喘或运动性哮喘。

· 非2型哮喘

肥胖相关哮喘、中性粒细胞性哮喘和寡粒细胞性哮喘

哮喘表型和内型的示意图

内型是根据病理生理机制对哮喘进行分类，而表型是指疾病的临床和形态描述。

涉及哮喘的简化细胞机制及其与微生物的相关性

Th2细胞驱动的炎症与Th2细胞、2型固有淋巴细胞、T滤泡辅助细胞、2型B细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞结合，导致痰、支气管肺泡液体、血清和支气管活检中IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、前列腺素D2和CCR8含量增加。

非2型炎症的特点是Th1和Th17细胞和中性粒细胞浸润，I型干扰素的存在，NLRP3炎症小体的激活，以及IL-1b和IL-17的特征。

02

健康的肺不是无菌的

人体所有表面都充满了微生物群，当然也包括上呼吸道（URT）和下呼吸道（LRT）在内。

呼吸系统的组成

人类的呼吸系统由上呼吸道（从鼻腔开始，然后是鼻咽、口咽和声带上方的喉） 和下呼吸道（一直到声带下的喉部，包括气管、支气管、细支气管和无数肺泡）组成。

而这个上呼吸道，相当于一个看门人，守护着呼吸健康。微生物群主要通过鼻咽部的微呼吸进入肺部，口咽部则更密集、分布更广。微生物也可以通过粘膜表面的扩散进入肺部。

上下呼吸道菌群

上呼吸道和下呼吸道的健康微生物群在呼吸道和整个机体内稳态的发展和维持中起着重要作用。

上呼吸道和下呼吸道的健康微生物群在呼吸道和整个机体内稳态的发展和维持中起着重要作用。

生命早期的“机会之窗”

从生命的第一天起，所有粘膜部位的微生物群都会发生动态变化，从而形成微生物群与人体之间适当的相互作用，并构成决定未来健康或疾病的关键“机会之窗”。

在出生和出生的第一天，母体阴道和皮肤的微生物群只能短暂地转移到婴儿身上，而母亲的肠道微生物群则成为婴儿在四个月大时获得的微生物群的主要来源。

由于这两种解剖结构代表了不同的环境，因此早期生活的背景下，有必要将上下呼吸道分开讨论。

从生命的第一刻起，上呼吸道就不断地暴露在外界环境及其伴随的环境中，从而形成了上呼吸道微生物群。

稳定状态下，下呼吸道菌群的瞬时特性取决于上呼吸道进入的菌群与被宿主免疫消除的菌群之间的平衡。 因此，上呼吸道样本无法完全反映下呼吸道中发生的相互作用。

健康呼吸道微生物群对宿主免疫的总体影响反映了活微生物及其细胞或代谢物成分对宿主局部和全身固有和适应性免疫过程的累积影响。如果健康适时的定植过程被破坏，早期生命肠道和肺微生物群的失调就成为许多呼吸系统疾病发生的重要危险因素。

03

肠-肺轴对呼吸和肠道健康的影响 

不同的肺部疾病会受到肠道微环境变化的影响，反之亦然。由此提出了“肠-肺轴”连接的概念。

在哮喘中，微生物群是导致这两者之间相互作用的重要因素。在人类和小鼠的研究中，肺和肠道之间的联系已经被反复证明。

肺部炎症时的肠-肺轴

这种相互作用可以是双向的；肠道微生物可以影响肺部的免疫反应，而肺部刺激可以导致肠道反应。

此外，在慢性阻塞性肺病（COPD）中还描述了「肠-肺-肝轴」。

来自肠道菌群的短链脂肪酸对肺部的促炎反应有抑制作用。

肝脏反应增强巨噬细胞活化和肺部炎症

肠道菌群产生的短链脂肪酸（SCFAs）对肺内炎症反应有抑制作用，肝脏通过HMGCoA还原酶抑制甲羟戊酸途径或与G-蛋白受体结合抑制炎症反应。

04

细菌是肠道和肺部最大的微生物种群

我们知道，肠道是人体菌群最密集的定植部位，其菌群及其与哮喘的关系，无论是在早期还是在已确诊的疾病中，都需要特别关注。

在一项研究中，来自加拿大的三个月大婴儿哮喘高风险的粪便样中观察到Lachnospira, Veillonella, Faecalibacterium, Rothia显著下降。这种菌群特征在1岁时不再明显，同时伴随着粪便乙酸的减少和肝肠代谢物失调。此外，预测的细菌群落功能分析表明，哮喘高危儿童微生物群中脂多糖生物合成途径的减少。

在卵清蛋白（OVA）诱导的小鼠呼吸道炎症模型中，将哮喘婴儿的粪便浆液补充具有代表性的Lachnospira, Veillonella, Faecalibacterium, Rothia菌属后，移植到无菌小鼠体内，可以减轻呼吸道炎症。

在另一项人类出生队列研究中，厄瓜多尔儿童在3个月大时，粪便样本中链球菌和拟杆菌的相对丰度增加，双歧杆菌和Ruminococcus gnavus减少的，在5岁的时候有更高的患过敏和哮喘的风险。

最后，根据肠道微生物群的组成，在美国新生儿中，双歧杆菌属、阿克曼菌属和粪杆菌属相对丰度低，念珠菌和红酵母真菌相对丰度较高的新生儿患过敏和哮喘的风险最高。

短链脂肪酸

肠道微生物对哮喘的影响至少部分是由细菌代谢物介导的，这可能会影响身体远端的免疫反应。在人类呼吸道炎症中，最著名的具有保护性质的代谢物是短链脂肪酸。

1岁时粪便中含有大量丁酸和丙酸的儿童，其特应性敏感性明显降低，3至6岁之间哮喘的可能性较小。此外，可溶性纤维补充可降低哮喘患者痰嗜酸性粒细胞增多和痰组蛋白去乙酰化酶9基因的表达。

怀孕和断奶期间口服SCFAs保护小鼠后代免受过敏性肺炎影响

在小鼠中，短链脂肪酸通过抑制组蛋白去乙酰化而增加转录因子Foxp3的表达，从而支持T调节细胞(T调节细胞)的扩增，增加IL-10的产生。

在OVA和家庭尘螨(HDM)诱导的气道炎症模型中，短链脂肪酸还被证明可以减少炎症。

此外，在怀孕和断奶期间口服SCFAs对小鼠有保护作用，使其后代免受过敏性肺部炎症的影响，尤其是丁酸能有效诱导幼鼠肺部Tregs的产生。

哮喘粪便样中组胺分泌细菌数量增多

最近有研究表明，人体肠道细菌能够产生其他具有促炎和抗炎作用的代谢物，如生物胺（包括组胺）和氧化脂质，如12,13-di-HOME。哮喘患者粪便样本中组胺分泌细菌数量明显增多。此外，组胺分泌细菌的数量与疾病的严重程度有关。

然而，在OVA引起的过敏性气道炎症模型中，细菌源性组胺降低了支气管肺泡液中的总细胞数和肺匀浆中IL-4、IL-5和IL-13的含量，突出了细菌源性免疫调节的复杂性。相反，12，13-dihome小鼠腹腔治疗可减少肺部Treg细胞的数量，并增加蟑螂抗原小鼠气道炎症模型的肺部炎症，由肺和肠道细菌分泌的代谢物可能被证明有助于额外的治疗方法。

占主导的变形菌——潜在的致病菌

在几项人类研究中，肺部变形菌似乎是哮喘患者中最占主导地位的门。变形杆菌门以潜在的致病菌为代表，包括Haemophilus, Moraxella, and Neisseria菌属。

在哮喘炎症表型中，嗜中性粒细胞性哮喘患者，通常接受高剂量吸入性皮质类固醇（ICSs），与嗜酸性哮喘患者比起来，表现出菌群多样性较少，Haemophilus 和 Moraxella、变形菌门相对富集，链球菌、Gemella、卟啉单胞菌的相对丰度降低。

克雷伯氏菌在严重哮喘患者中富集

在严重哮喘患者中，代表非2型哮喘的Th17细胞上皮基因特征与变形菌门的表达增加有关，这进一步与哮喘控制的恶化和哮喘中性粒细胞恶化有关。克雷伯氏菌是变形菌门中的一个细菌属，在严重哮喘患者中特别富集，而放线菌门与哮喘控制有关。

哮喘治疗也可能导致肺部菌群变化

哮喘治疗也可能导致肺部微生物群落的变化，这表明在确定因果关系方面的复杂性。例如，放线菌与类固醇反应的分子证据（FKBP5表达）有关。因此，某些气道微生物可能有潜力被用作哮喘对类固醇反应的指标，使临床医生能够改进治疗方法。

重要的是，肥胖和哮喘对机体免疫反应、气道和肠道微生物群的实质性相加效应最近已被描述。

患有严重疾病的肥胖和非肥胖哮喘患者的粪便中Akkermansia muciniphila菌水平均有所降低，这可能与急性和慢性气道炎症的小鼠模型中所显示的因果关系有关。严重哮喘患者肺部的另一个属是链球菌。

特应性哮喘患者，通常表现为嗜酸性炎症表型，在梭杆菌属、卟啉单胞菌属和鞘氨醇单胞菌科的细菌中有丰富的菌群，同时单胞菌科和乳杆菌科的相对丰度降低。

此外，哮喘患者痰液中的嗜酸性粒细胞与成人体内的Tropheryma whipplei有关。与中性粒细胞性哮喘惊人的可重复性研究结果相反，嗜酸性粒细胞性哮喘和2型哮喘中的微生物群较不清晰且异质，可能再次反映了ICSs治疗引起的不同的微小型或混合型反应。

目前尚不清楚成人哮喘患者气道中特定细菌的多样性和存在在多大程度上反映了炎症的类型或微生物对皮质类固醇治疗的反应。研究表明，ICSs和口服糖皮质激素联合治疗与变形菌和假单胞菌数量增加，拟杆菌、梭菌和普雷沃菌数量减少呈正相关。

另一方面，一项未经吸入皮质类固醇治疗的轻度哮喘研究表明，嗜血杆菌、奈瑟菌、梭菌和卟啉单胞菌具有独特的富集作用，同时在其气道中的单胞菌科和乳杆菌科存在缺失。这些研究表明，经常使用皮质类固醇治疗的哮喘患者的肺微生物群组成，可能是炎症环境和药物作用之间复杂相互作用的结果。

小鼠在感染Moraxella catarrhalis菌（M. catarrhalis，Proteobacterium phyla）1天后，可导致嗜中性粒细胞浸润、IL-6、IL-1b和肿瘤坏死因子a (TNF-α)的高浓度、CD4+T细胞来源的IFN-g和IL-17的中度浓度。此外，IL-17或TNF-α而不是IL-6的中和作用，可加速卡他性支气管炎的清除，有效地预防感染引起的过敏性气道炎症的恶化。

来自变形菌门的流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae 能够将与Th2细胞和嗜酸性粒细胞相关的类固醇敏感过敏性气道疾病（AAD）转化为与Th1细胞、中性粒细胞和显性IL-17反应相关的类固醇抗性疾病。

越来越多的证据表明细菌在哮喘中起着一定的作用，但还需要进一步的研究，以更清楚所涉及的最重要的菌群，并了解哮喘背景下的细菌失调是否是疾病的原因或影响。更详细的机理研究是必要的，以充分了解肺和肠道微生物组成和复杂的关联代谢在生活中的不同点与特定类型的哮喘炎症。未来的工作应集中在继续详细描述介导细菌与哮喘宿主之间沟通的细胞和分子机制。

05

超越细菌的视野：

真菌——被遗忘的微生物

目前尚不清楚真菌是在健康的成人肠道中定植，还是只是作为短暂的口腔或食物来源的真菌被检测出来，但即使是短暂的肠道定植者也有可能影响微生物群落生态和宿主免疫反应。

真菌失调是与儿童高危哮喘表型的发展相关

虽然所涉及的机制没有被探索，但最近对来自美国和厄瓜多尔的人类出生队列的两项研究已经确定真菌失调是与儿童高危哮喘表型的发展相关的婴儿肠道微生物特征的一个关键特征。

这些结果表明，真菌失调可能是一个容易检测到的哮喘风险的生物标志物。 此外，这两项研究都发现真菌失调与细菌失调有关。

肠道内的微生物影响宿主对其他微生物的免疫反应，在生理和代谢上相互作用，并争夺空间和营养。 动物模型的早期研究旨在建立真菌失调与哮喘严重程度之间的因果关系，结果表明用抗生素预处理的小鼠经常见的人类肠道共生白色念珠菌(C.albicans)灌胃后受真菌过度生长的影响。

这些小鼠进一步证明，在气道刺激后，Th2细胞介导的气道炎症加剧，这一效应被认为至少部分是由白色念珠菌产生的免疫调节前列腺素介导的。

与此相一致的是，抗生素治疗后小鼠肠道中另一种念珠菌的过度生长与前列腺素PGE2介导的肺巨噬细胞向M2表型的极化有关，并在抗原致敏和刺激后加重了过敏性炎症。

在该模型中，真菌过度生长与肺部的炎症免疫细胞浸润有关，但也需要特定的抗生素引起的细菌微生物的变化。只有引起乳酸菌属相对数量减少的抗生素才与真菌过度生长和抗原激发后气道炎症加重有关。

值得注意的是，乳酸菌和其他产乳酸的细菌因其作为益生菌而受到关注，以预防哮喘和过敏，并具有抗真菌作用。

进一步的证据表明，真菌失调发生的历史和当前微生物环境影响了哮喘期间相关的免疫后果，这一点最近才出现。

不存在支原体的小鼠在接种了失调真菌后显示出Th2和Th17细胞的混合性肺浸润，而同样的方法在有支原体的常规小鼠中只导致哮喘期间Th2细胞炎症的增加。类似地，感染白色念珠菌的真菌初生小鼠表现出与真菌特异性Th17细胞和IL-17高反应中性粒细胞的系统性扩张相关的AAD恶化。这些研究共同强调了肠道微生物群的复杂性、动态性以及跨界微生物相互作用在确定哮喘预后中的重要性。

除抗生素治疗外，抗真菌治疗还可引起特异性无病原体（SPF）小鼠肠道细菌和真菌群落的变化，并在AAD的HDM模型中加剧2型变态反应性气道炎症和嗜酸性粒细胞增多。

连续补充在该模型中鉴定为在真菌治疗后肠道中过量表达的三种真菌（安斯曲霉Aspergillus amstelodami，Wallemia mellicola [sebi]和Epicoccum nigrum）或仅在抗生素治疗后单独补充Wallemia mellicola会增加哮喘的严重程度。

在这些研究中，抗真菌治疗和向特定无病原体小鼠引入抗生素真菌群落导致肠道细菌群落的变化，包括乳杆菌科减少。然而，在未经抗生素预处理的改变的Schaedler菌群小鼠中，在细菌微生物群没有实质性变化的情况下，再补充失调真菌可使AAD的恶化作用重现。

此外，最近证明，肠道常驻CX3CR1+单核吞噬细胞直接感应抗真菌诱导的真菌失调增加固有层中Th2细胞的数量，并导致AAD HDM模型中真菌失调相关的气道炎症增加，与细菌群落的抗真菌相关变化无关。

因此，除了通过重组免疫调节肠道细菌种群或产生系统代谢物对气道炎症有潜在的间接影响外，在肠道中的哮喘相关真菌失调可对宿主天然和适应性免疫细胞群体产生直接影响。

肺中的局部真菌失调也与哮喘有关

在一个小样本的受试者中，有和没有严重哮喘的儿童在支气管肺泡液样本中表现出特定真菌的相对丰度的差异，但在支气管肺泡液体样本中，真菌的总体多样性并不存在差异。这些差异包括严重哮喘患者 Pneumocystis相对丰度的增加，这是肺中存在的一种菌，与人体和动物模型中宿主2型免疫反应的诱导有关。

Pneumocystis 在2-5个月龄时的亚临床定植被认为是婴儿期最常见的感染之一，并与粘蛋白基因表达增加有关。Pneumocystis的早期肺定植可能是诱导肺中Th2细胞偏向免疫反应的危险因素，并使婴儿容易哮喘。

一项针对成人患者的18S焦磷酸测序研究同样发现，与非特应性对照相比，哮喘患者痰中特异性真菌相对丰度存在差异。在这些成年人中，哮喘患者表现出与特应性皮炎过敏条件有关的马拉色菌Malassezia 的相对丰度增加。

总的来说，这种情况逐步浮现：哮喘患者表现出与诱导2型炎症免疫途径相关的特定真菌的相对丰度增加，一些真菌要么不存在，要么只存在于健康肺中的低丰度中。

哮喘患者肺部真菌改变的结果并不令人惊讶，因为真菌成分，如甘露聚糖、蛋白酶、几丁质和β-葡聚糖通常存在于常见的人类过敏原和室内灰尘中。虽然致敏的潜在机制尚不清楚，但许多严重和/或不受控制的哮喘患者对真菌敏感和/或在抗真菌治疗后哮喘症状可能有所改善。

通常与致敏和哮喘相关的肺部真菌包括曲霉属Aspergillus、链格孢属Alternaria和枝孢属Cladosporium。

有意思的是，一些来自动物模型的证据表明，致敏作用是继发于自然Th2细胞和嗜酸性粒细胞免疫应答之后，才能有效清除引起感染的真菌。此外，支气管肺泡液样本中真菌载量增加与严重哮喘患者的皮质类固醇治疗有关，无论是否有真菌致敏。

因此，需要进一步的研究来确定病理性真菌定植和肺部真菌失调是否会导致更严重的哮喘发作，并在严重哮喘相关的皮质类固醇治疗后发生，和/或对哮喘相关的肺部微环境变化作出反应。

气道真菌群

最近，研究已经开始精确地描述与某些哮喘内质型和临床特征相关的气道真菌群。在一项检查气管内灌洗和支气管肺泡液体的微生物群的研究中，与健康对照组和2型低哮喘患者相比，Fusarium, Cladosporium, Alternaria在哮喘患者和2型高哮喘患者的支气管肺泡液体中富集。

表明其作为疾病生物标志物的潜力，支气管肺泡液液中交互链球菌和棒孢菌的相对丰度也与强制呼气容积1呈负相关（一种肺功能的临床测量方法）。

在过去的几十年里，对肠道微生物（包括真菌）的对宿主的组成和免疫作用的研究已经爆发。 虽然还有许多有待阐明的地方，但一组强有力的证据现在支持真菌在失调-哮喘中的重要作用。

真菌-细菌和真菌-宿主相互作用在确定真菌失调对宿主健康的影响方面都起着重要作用。 许多这项工作已经在儿童出生队列和小鼠模型中完成，需要更多的研究肠道菌群与成人哮喘的相关性。

此外，早期真菌失调是否以及如何影响以后生活中当失调不再时的哮喘发病和/或严重程度，仍然需要进行机械试验。

06

病毒很容易在肺部定居

尽管病毒感染被认为是哮喘恶化的主要原因，但病毒与哮喘之间的关系还不完全清楚，是由于不断发展的有关呼吸道健康的知识。

已观察到上呼吸道和下呼吸道病毒的组成和丰度在健康受试者和无症状和有症状的慢性呼吸道疾病患者中有所不同，但需要进行详细的纵向研究，以更好地理解因果关系。

病毒与额外的环境和内在因素之间复杂的相互作用可能是哮喘患者呼吸道中某些病毒存在时间较长但短暂的原因，或是导致严重恶化的完全感染的发生。

在人类生命的第一年，几乎所有的喘息发作都与病毒感染有关。

已知引起哮喘喘息或恶化的最常见的病毒是RV和RSV，但博卡病毒、流感病毒和巨细胞病毒也有牵连。 据报道，早期人类鼻病毒引起的喘息对以后的哮喘风险有附加作用。

RV病毒

RV毛细支气管炎患儿气道中最丰富的细胞类型是中性粒细胞，尽管嗜酸性粒细胞的浸润也起着重要作用。此外，最近已经证明肥大细胞IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-α的浓度在RV病毒刺激后显著升高。

T细胞参与通过识别病毒抗原和随后启动TC和抗体介导的免疫应答来控制RV病毒感染。最近的一项研究表明，RV病毒在体外进入并形成B淋巴细胞病毒复制中心，并诱导B细胞增殖。

RSV病毒

另一种与哮喘风险增加有关的病毒是RSV病毒；然而，它与该疾病的关系不太清楚。 有研究表明RSV病毒引起的毛细支气管炎与哮喘之间存在联系，但其他研究尚未确定婴儿RSV病毒感染与学龄哮喘发展之间的相关性。

RSV病毒感染对哮喘的长期影响与以下事实有关：该病毒通常在肺发育过程中影响新生儿。新生儿调节性B细胞对RSV病毒感染有很高的耐受性，其频率可以预测急性细支气管炎的严重程度。 此外，RSV病毒迅速附着在人类嗜酸性粒细胞上，并可能被这些细胞灭活。 随着哮喘严重程度的增加，嗜酸性粒细胞捕获病毒的能力降低了75%。

流感病毒

流感病毒是与哮喘恶化有关的另一种病毒感染。 流感感染背景下的哮喘与更严重、更高的住院风险、需要重症监护和死亡率有关。据推测，IL-33是驱动流感病毒引起的哮喘恶化所必需的。 在哮喘小鼠模型中，IL-33通过抑制先天和适应性抗病毒反应来增强气道高反应性和气道炎症。 另一项研究表明，流感感染通过一种需要IL-13-IL-33轴的途径诱导气道高反应性。

影响儿童哮喘的不常见病毒——HBoV和巨细胞病毒

除了与哮喘相关研究最为深入的病毒和上面描述的病毒外，还有一些不太常见的病毒影响哮喘中的气道炎症。 人博卡病毒1型 (HBoV)和巨细胞病毒也与儿童哮喘发作有关。

另一项研究报告说，在一个小样本中，急性喘息儿童HBoV病毒年龄为 ≥4 岁的因急性细支气管炎住院的儿童，他们都发展为反复哮喘，其中一半在5-7岁时患有哮喘。

还有证据表明，在OVA致敏小鼠中皮下注射急性喘哮喘儿童HBoV-VP1u 或 B19V-VP1u可导致气道炎症升高。 最后，51.4%的复发性喘息患者检测到巨细胞病毒DNA，在12-36个月的哮喘预测指数阳性的患者中比在阴性的喘预测指数同一年龄组中更普遍。

呼吸道病毒感染与哮喘发展之间的联系最近已经用很多方法进行了研究。 然而，导致这种相关性的确切机制尚不清楚，需要在动物模型和人类研究中使用多组学方法进行进一步的详细研究。考虑患者全球病毒的分析也应在未来考虑。最后，科学家还应该问一个问题：肠道病毒是否可能影响肺部炎症？

07

古细菌在人类肠道中的出现

虽然研究不足，但古细菌在人类微生物研究中一直被发现，它们的群落组成因身体部位而异。

古细菌主要有Methanobrevibacter smithii，Methanosphaera stadtmanae，具有免疫原性。

最近，一项针对来自荷兰考拉出生队列的472名儿童的研究表明，肠道古菌在失调-哮喘范式中的作用。6至10岁儿童粪便样本中存在M. stadtmanae（一种常见的肠道古菌，与儿童哮喘风险显著相关，提示肠道古菌可能在过敏的发生发展中起到调节作用），这种情况与被诊断为哮喘的风险降低有关。这种效应与父母哮喘状态无关。

然而，在本研究的样本中，只有8.3%的样本检测为阳性，而某些古生物蛋白实际上被认为具有促炎性或致敏特性。 因此，需要更多的队列研究和机制研究肠道古菌在哮喘背景下的免疫调节作用。

与其他微生物群的情况一样，古生物群破坏的微生物和免疫环境可能决定了宿主的最终免疫后果。随着儿童和成人中的人类肺微生物群的不断特征化，肺古菌在生物失调模式中的作用有待确定。

08

结语

现在有大量的文献支持人类微生物群影响宿主免疫系统的成熟和功能。肺和肠道微生物对哮喘的发展、表型和严重程度都有影响，但这些相关性的详细细胞和分子机制尚未得到充分的表征。

一个有助于理解人类微生物群和免疫系统之间联系的机制的重要工具是用于过敏性气道炎症的人源化微生物群小鼠模型。

人类队列研究应包括明确界定的临床结果，并从关于症状、治疗和临床信息的详细和具体问题中收集纵向数据。 关于病人饮食和生活方式的完整信息也应仔细准备，以确保最好地概述病人的情况和对微生物群的潜在影响。

需要对更多患者进行纵向和前瞻性分析，以了解疾病的病程、其表型和内型、对疾病进展的易感性以及对治疗的反应之间的关系。

总之显而易见，哮喘患者的未来诊断和治疗应通过分析个体微生物群的组成和代谢活动来辅助。

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参考文献

Barcik W, Boutin R C T, Sokolowska M, et al. The Role of Lung and Gut Microbiota in the Pathology of Asthma[J]. Immunity, 2020, 52(2): 241-255.

怀孕期间母体肠道微生物分子保护后代免受代谢性疾病的影响

近日，日本学者发表在Science上的一项研究
(DOI: 10.1126/science.aaw8429 ）为妊娠期母体肠道微生物对后代健康影响新增一项证据，该研究表明表明，孕期母体肠道环境是影响后代代谢发育以预防代谢综合征的关键因素，因此，孕鼠肠道微生物群提供了一个环境线索，可以微调后代的能量稳态以预防代谢综合征的发育起源。

早期生命期是一个关键的时期：影响胎儿发育的事件可能带来一生的影响。人类胎儿发育过程中的一点点紊乱不仅影响主要的发育结果，甚至有可能影响几十年来无法表现的表型，如心脏代谢疾病的风险。

近几十年来，抗生素使用和摄入高热量、低纤维饮食的迅速扩大导致肠道微生物群的紊乱，使人类容易患上各种疾病，如代谢综合征。虽然微生物群对出生后的影响已经有很好的文献记载，但是关于胚胎阶段肠道微生物群的影响所知甚少。 尽管越来越多的证据支持健康和疾病的发展起源（DOHaD）这一概念，但其潜在机制仍不清楚。

在这项研究中，主要探讨了母体肠道微生物群对胚胎发育和后期疾病易感性的影响。

以短链脂肪酸为代表的肠道微生物群衍生代谢产物（如乙酸、丙酸和丁酸），不仅是宿主细胞的燃料，而且还是肠道微生物群和肠外器官之间的信号分子。

GPR41和GPR43属于游离脂肪酸受体（FFAR）家族，是SCFAs的受体。

之前已经证实了FFARs在能量代谢中的生物重要性，通过与膳食成分以及肠道微生物群衍生代谢产物的相互作用。

肠道微生物SCFAs通过交感神经系统、脂肪组织、胰腺和肠道中的GPR41和GPR43调节宿主能量稳态。

最近的一项研究进一步表明，怀孕小鼠的肠道微生物群影响后代的免疫和大脑功能。在DOHaD理论的背景下，这些发现增加了母体SCFAs在调节出生后疾病易感性中起关键作用的可能性。

妊娠期间，母体肠道微生物群通过胚胎SCFA受体影响后代肥胖倾向

研究人员发现孕期母体微生物群对后代的肥胖具有抵抗力。

怀孕小鼠在特定的无病原体（SPF）和无菌（GF）条件下繁殖，之后由寄养母亲在常规条件下抚养新生儿，以调整出生后的生长环境。来自GF母亲的后代极易患代谢综合征，其特征是肥胖和葡萄糖不耐症的加重，与成年期高脂饮食消耗的能量消耗减少有关。在妊娠期喂食低纤维饲料的小鼠后代中也观察到类似的表型。

用SCFA治疗妊娠GF或低纤维饮食喂养的小鼠使成年后代对肥胖具有抵抗力。妊娠小鼠结肠腔内的SCFA通过母体肝脏和血流到达胚胎。值得注意的是，胚胎的交感神经、肠上皮和胰腺高度表达GPR41和/或GPR43，以感知来自母体肠道微生物群的SCFAs。

然而，他们观察到GPR41在无菌小鼠中的表达较低。小鼠GPR41表达的丧失导致交感神经投射到心脏的缺陷，这在无菌后代中也是明显的。

体外证实了SCFAs激活交感神经元分化的能力，丙酸具有最大的作用。在缺乏GPR43的小鼠中，作者发现SCFA和微生物群在胚胎肠内分泌和胰腺B细胞发育中的依赖性缺陷。

微生物对代谢疾病的保护

SCFA-GPR41 和 SCFA-GPR43轴 赋予后代对肥胖的抵抗力

胚胎GPR41和GPR43信号转导的缺失在产前由于交感神经功能障碍和高血糖而影响能量代谢。SCFA-GPR41和SCFA-GPR43轴促进神经细胞、表达GLP-1的肠内分泌细胞和胰脏细胞的发育，从而形成胚胎能量代谢。这个发育过程有助于维持出生后的能量平衡。

在怀孕期间，母体肠道微生物群通过 SCFA-GPR41 和 SCFA-GPR43轴 赋予后代对肥胖的抵抗力。妊娠期间，GPR41和GPR43在胚胎的交感神经、肠道和胰腺中感知来自母体肠道微生物群的SCFAs，影响代谢和神经系统的产前发育。

这些发现表明，孕期的母体肠道环境是防止代谢综合征的后代代谢程序的关键因素。

因此，怀孕小鼠的肠道菌群提供了一种环境线索，可微调子代的能量平衡，从而防止代谢综合征的发展。

补充丙酸来拯救？

事实上，另一项研究结果也表明，在怀孕期间喂养低纤维饮食的小鼠的后代增加了肥胖和胰岛素抵抗的风险。低纤维饮食的有害影响可以用丙酸补充来拯救。

当怀孕的小鼠服用抗生素时，高纤维和低纤维饮食喂养的母亲的后代的代谢参数没有差异，证实了母体微生物在介导保护方面的重要性。

高纤维喂养动物的后代出生时更重，但在以后的生活中免受肥胖的影响。这与人类是一致的，因为低出生体重与未来的肥胖有关。补充丙酸孕鼠保护后代免受未来疾病的影响。 然而，丙酸补充是否对母亲有任何影响尚未评估。

考虑到减少人类代谢性疾病的目标，确定类似的机制是否控制人类的发展是至关重要的。 迫切需要更好地理解如何、为什么以及在什么情况下应该尝试调节妊娠中的肠道微生物群或SCFA。 

高纤维饮食符合现有的营养建议，包括在怀孕期间，但这些是否能有效地增加SCFA和保护后代免受未来代谢性疾病的影响尚不清楚。人类微生物组成存在很大的个体间变异，不同的微生物具有不同的SCFA生产能力。 因此，微生物群产生SCFA能力的差异可能会影响后代肥胖的风险。

虽然补充丙酸可能是一个方便的选择，但怀孕期间的安全性和有效性仍有待确定。对人类的进一步研究是有必要的，以了解调节这一途径是否可以成为改善下一代代谢健康的途径。

参考文献

I. H. L. Blackmore, S. E. Ozanne, J. Mol. Cell. Cardiol. 83, 122 (2015).

II. I. Kimura et al., Science 367, eaaw8429 (2020).

III. J Ferguson.  Science 367  eaaw6481 (2020)