annoSnake：一款用于宏基因组和MAGs的模块化、一站式自动化注释管道

annoSnake：一款用于宏基因组和MAGs的模块化、一站式自动化注释管道

谷禾健康

如果你正为宏基因组数据的组装和注释而忙于“拼工具、调环境、转格式”，那么annoSnake或许能让你从繁琐中解放。

它是一个基于Snakemake的自动化工作流程，从clean reads组装到物种分类、功能注释，再到MAGs的装配和注释。

作为开源工具，annoSnake具备良好的可重复性、可扩展性和可移植性，非常适合HPC集群环境。

本文将带你了解它的工作流程、在白蚁肠道宏基因组数据上的验证结果，以及它的优势与局限，帮助你快速判断是否值得上手。

---

01
annoSnake 的工作流程

annoSnake以“自动化+模块化”为核心：输入clean reads → 组装 → 注释 → 分箱 → 结果汇总与可视化。

每个标准化步骤里，annoSnake使用的都是主流工具，如果你事先没有任何准备，也无需担心，它会自动创建独立的虚拟环境，并安装所需的分析工具和注释用的数据库。

分析前的准备

1. Mac OS或linux系统设备，磁盘空间推荐>100GB。如果运行单个宏基因组样本，只要有32 GB 内存和 8 核 CPU 基本就能跑完。

若要在集群上批量运行十几个样本或进行MAG分析，最好准备 ≥128 GB 内存和多核服务器。annoSnake 可批量化处理。

2. 安装mamba或conda用于管理环境，然后安装snakemake。

3.克隆Github仓库到本地（git clone https://github.com/bheimbu/annoSnake.git）。

4. 清洗后的测序数据，可以是双端，也可以是交错合并的fastq.gz文件，注意要是gzip格式。

5.编辑./profile/params.yaml和./profile/config.yaml文件。config.yaml 决定“要做什么”与“怎么做”，config.yaml 决定“在哪跑、分配多少资源”。

首次分析，annotSnake会自动下载并设置GTDB、dbCAN、Pfam、KEGG等数据库，总量约100GB。

开始分析

1. 组装

MEGAHIT v1.2.9工具进行宏基因组组装，默认–presets meta-sensitive模式组装，保留≥1500 bp的contigs，并以metaQuast评估组装质量。

2. 物种分类注释

Prokka v1.14.6工具识别CDS、rRNA、tRNA；fetchMG v1.2提取40个单拷贝标记基因；结合GTDB(v202, (Parks et al.2022)数据库进行blastp和blastx注释；自定义R脚本gtdb_diamondlca.R进行LCA分类整合。

3. 功能注释

对细菌/古菌的contig执行注释，可以选择的功能数据库有：CAZy（dbCAN version 11）、Pfam（version 35）和KEGG。

针对Pfam搜索结果，可以自行借助在线工具HydDB进一步分类。针对KEGG结果，借助KofamScan工具重建以KEGG为基础的代谢通路。E-values阈值在params.yaml中设定。

4. 基因丰度量化与归一化

Salmon v1.10.2对CDS进行TPM定量，对于TPM>1的，予以保留，然后对剩余TPM做CLR对数转换（默认，log(TPM+0.65)）。

5. 分箱与注释（可选）

同是采用三种分箱算法：MetaBAT v2.10.2、MetaCoAG v1.1.1、MaxBin v2.2.7，最后用metaWRAP v1.3的bin_refinement整合最优集合，CheckM 评估MAGs质量，默认阈值是完整性≥50%且污染≤10%。

对优质的MAGs使用GTDB-Tk v2.3.2进行物种分类（数据库v214），Prokka做基因预测，然后用MicrobeAnnotator进行功能注释，该工具使用DIAMOND和KofamScan，并以通路基因存在/缺失评估完整性。

6. 输出与可视化

输出包括CSV表格和ggplot2/plotly生成的PDF/HTML图表。

!

Tips

annoSnake已经内置了“KEGG条目（KO编号）→基因名称/通路名称”的映射表文件。如果你想重点关注某些特定的KEGG基因或通路（比如只看甲烷生成、乙酸生成或硫酸盐还原等），可以在/workflow/rules/scripts目录下，直接编辑这类映射文件，把你关心的KO编号及其基因名、通路名加入或调整。

管道运行时会按你改过的清单去批量检索与汇总这些目标基因/通路的注释与丰度，并在输出图表中优先呈现，从而实现“按课题定制”的结果视图。

02
测试数据的验证与结果

作者用来自澳大利亚Amitermes组（AAG）的白蚁肠道宏基因组作为测试数据，与已知发现进行一致性检验。

▸在测序深度不高时仍能识别主要细菌谱系和代谢通路

31个群体，Illumina NextSeq双端，平均每样本约700万条reads。尽管测序深度不高，但annoSnake仍有效识别了主要的细菌谱系，以及大量与木质纤维素消化相关的代谢通路和基因。

图中是annoSnake识别出的主要菌群，结果显示不同取食类型白蚁肠道的优势类群模式，这与已知发现相符，通常，食草和食木的白蚁其肠道群落以螺旋体为主，而食腐殖质和土壤的白蚁则富含梭菌（clostridia）。

但也有与已知发现不符的结果，D. tamminensis物种的肠道群落以梭菌为主，几乎不见螺旋体或Fibrobacterota，部分D. gayi群体也表现出类似模式，这与“草/木料取食类型的白蚁常以螺旋体占优”的普遍模式不一致，作者解释这是数据特性使然，低覆盖度数据只能恢复高丰度群落成员，而非物种生态学的结论。

▸ 识别出硫酸盐还原等重要通路的基因

在所有样本中，annoSnake识别出硫酸盐还原通路的关键基因，如aprA、aprB和dsrAB，这符合白蚁肠道微生物组中硫酸盐还原过程的常见模式。还有许多与木质纤维素消化相关的KEGG代谢通路基因，这支持白蚁肠道微生物组在碳循环和能量代谢方面的普遍功能特征。

仅检测到少量与甲烷生成相关的基因，如mcrABG。已知甲烷生成主要局限于厌氧甲烷生成古菌，而本次分析中未有样本被检测到古菌，所以甲烷生成基因稀少是符合预期的。这与低覆盖度数据仅恢复高丰度群落成员的特性一致，古菌可能被低估，而不是KEGG注释的偏差。

识别出fdhF和acsABCDE等基因预测还原性乙酸生成的存在，这一点由分箱得到的15个Bacillota和6个螺旋体MAGs所支持，这两类群包含潜在的乙酸生成菌。这与其他白蚁和千足虫研究中已知的乙酸生成潜力一致。

▸ 能够检测到大量碳水化合物活性酶

annoSnake检测到大量CAZymes（碳水化合物活性酶）。D. tamminensis在不同群体间的GHs丰度差异再次暗示饮食灵活性，且部分群体GHs模式与腐殖/土壤取食物种一致；螺旋体主导的D_gayi_BEC329中GHs丰富，符合凋落物取食物种的特性，而在梭菌主导的D. gayi群体中GHs较低。

annoSnake从低覆盖度数据中获得30个MAGs，其中包括15个Bacillota（内含大量梭菌纲）、1个Desulfobacterota、7个Fibrobacterota、1个Pseudomonadota、6个Spirochaetota。

图中展示了MAGs中木质纤维素消化相关代谢途径（甲烷生成、还原性乙酸生成、硫酸盐还原）基因的存在/缺失。左侧给出MAG的完整性和污染分值，颜色越浅表示完整性越高，污染越少。 紫色方块表示基因缺失，黄色方块表示基因存在。

03
annoSnake的优势与劣势分析

优势

• 覆盖全流程的一站式自动化：从输入reads→组装→物种注释→功能注释→丰度定量→分箱(可选)→可视化，节省操作时间。

• 数据库自动下载和配置。

• 兼具一些灵活性，比如可以自定义数据库，也能调整分析参数。

• 可重复、可扩展、可移植。Snakemake内核+HPC优化，可以在不同HPC环境中高效执行。

劣势

• 资源占用较高，数据库体量约100GB，完整流程在大规模数据上更适合HPC环境；本地轻量设备可能受限于存储、内存与时长。

• 需要有一定代码基础，掌握Snakemake、Conda与YAML配置，能调试环境配置时可能出现的错误。

• 范围聚焦细菌/古菌，真核生物未被纳入默认流程，氢化酶精细亚型分类需借助HydDB等外部工具，未在管道集成。

• 低覆盖度数据的固有限制：对稀有类群的恢复能力受限，更偏向于恢复高丰度成员，需要结合研究设计与深度规划权衡。但作者也没有发表对高覆盖度数据的测试结果，所以工具对高覆盖度数据的表现不明确。

• 工具较新，容易出现环境/兼容性问题或边缘情况未覆盖；第三方依赖更新也可能引入不稳定性。数据库管理灵活性受限，版本固定且无更新管道。虽支持自定义数据库，但需自行调整文件格式。

o 输出的图像不够美观，可视化类型单一。

04
结论

annoSnake适合具备中级生信技能，需快速产出的微生物组学研究者。如样本量大，需批量分析，则需要配备高性能设备。研究范围在细菌/古菌的宏基因组与MAGs。

下面这个网址可访问 annoSnake 文档：

https://annosnake.readthedocs.io/en/latest/index.html

参考文献：

Bastian Heimburger, Rebecca Clement, Tamara R. Hartke

bioRxiv 2025.11.03.686227; doi: https://doi.org/10.1101/2025.11